מגשר אנושי לשחרר את אסאי כהקראה עבור עוצמה אלרגן

ה- assay מייצג כלי מחקר חשוב כדי לדמות את degranulations של בזופילים המושרה על ידי קישור צולב של חולים'IgE ואלרגנים. לכן ניתן להשתמש בבחינת כדי לחקות סוג 1, תגובות אלרגיות. ההסתערות איתנה, ניתנת לשחזור ומתאימת.

יתר על כן, זה רגיש מאוד כפי שהוא יכול להתבצע עם כמויות קטנות של אלרגן רקומביננטי או מטוהר או אפילו עם תמציות אלרגן מורכב. השיטה משמשת לאבחון אלרגיות כפי שהוא מנתח את התגובה של חולים'IgE לאלרגנים. כמו כן שיטה זו מתאימה לנתח תגובה צולבת ולנטר את יעילות הטיפול ב- AIT.

התחל על ידי קצירת תאי Ag8 מבקבוק תרבית התא ולהעביר את התאים לתוך צינור צנטריפוגה. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך חמש דקות, ב 250 פעמים g בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נט, והגדילו מחדש את גלולה התא לריכוז סופי של בערך פי 10 עד התא השישי, למיליליטר בתאי RBL אנושיים בינוניים.

לדלל סרה אנושית אחת עד 10 בהשעיית תא Ag8 לדילול הסרום הסופי של אחד עד 20 בבחאי, ודגרה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס וחמש עד 7% פחמן דו חמצני. כאשר תאי RBL האנושיים מגיעים ל-50 עד 90%, שאפו את המדיום מבקבוק תרבית תאי T-75 בזהירות מבלי לגעת בתאי RBL האנושיים הדבוקים. לשטוף את התאים פעמיים על ידי הוספת 10 מיליליטר של DPBS לצד הנגדי של הבקבוק ולא ישירות על התאים.

שאפו DPBS, להוסיף חמישה מיליליטר של טריפסין-EDTA התחמם מראש פעם אחת עבור ניתוק התא ודגרה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הקש בעדינות על הבקבוק כדי לנתק את התאים. העבר את ההשעיה התא לתוך צינור centrifugation 15 מ"מ ולמלא את הצינור עם בינוני תא RBL אנושי או DPBS כדי לדלל את טריפסין-EDTA.

צנטריפוגות התאים ב 250 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נט, ושאפו מחדש את הכדור בחמישה מיליליטרים של מדיום תאי RBL אנושי לספירת תאים. לאחר ספירת התאים, לדלל את התאים במדיום תא RBL אנושי כדי להשיג ריכוז סופי של פעמיים 10 עד התא השישי למיליליטר.

הוסף 50 מיקרוליטרים של השעיית תאי RBL אנושיים, לכל טוב, שווה ערך ל- 10 לתאים החמישיים לבאר בלוח סטרילי של 96 בארות. צנטריפוגה השעיית סרום Ag8 דגירה מראש ולהעביר 50 microliters של השעיית סרום Ag8 צנטריפוגות לכל באר המכילה תאי RBL אנושיים, מבלי להפריע גלולה תא Ag8. השתמש בתאים לא מגונים ללא אנטיגן כאין בקרת אנטיגן לאינדיקציה לרמת האות התחתונה או לרקע, ואל תחשוף את הרקע ואת בארות בקרת התמוגה המרבית.

מכסים את הצלחת במכסה ודגרה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5 עד 7% פחמן דו-חמצני. שאפו את הסרה המכילה תא בינוני, היפו והקשו על הצלחת על הנייר הסופג כדי לרוקן את הצלחת לשטיפת תאי RBL אנושיים. לשטוף את התאים שלוש פעמים על ידי הוספת 200 microliters של המאגר של טיירוד לבאר, ודגור במשך כ 30 שניות לכל לשטוף עבור שתי השטיפות הראשונות.

לאחר הוספת המאגר של טיירוד בפעם השלישית, שאפו את המאגר והותירו את הפתרון בבארות עד שיהיו מוכנים להוסיף את דילול האנטיגן. העבר 100 מיקרוליטרים של פתרון אנטיגן לכל באר המכילה את תאי RBL אנושיים רגישים מראש, אך אינם מעוררים את התמוגה המרבית ותאי רקע לא רגישים עם אנטיגן. הוסף 100 מיקרוליטרים של המאגר של טיירוד בבארות בקרת התמוגה המרביות, בארות בקרת רקע לא רגישות ובארות ללא אנטיגן רגישות.

לדגור על התאים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס וחמש עד 7% פחמן דו חמצני. פנקו את בארות בקרת התמן המרביות עם 10 מיקרוליטרים של 10% טריטון X-100 לבאר, וערבבו כראוי כדי לרסן את התאים לחלוטין עבור 100% שחרור של בטא-הקסוסמידאז. הוסף 50 מיקרוליטרים של פתרון מצע ללוח חדש שאינו מחייב 96 באר.

העבר 50 מיקרוליטרים של supernatant מבארות של תאי RBL אנושיים המכילים צלחת לתוך הלוח החדש המכיל את פתרון המצע ודגר את הצלחת במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר המרה של המצע פלואורוגניים. הוסף 100 מיקרוליטרים של עצירת פתרון לבאר ומדוד את הפלואורסצנטיות כמתואר בכתב היד של הטקסט. עקומת בצורת פעמון המתקבלת בטא-hexosaminidase פעילות assay, המציין את העיסוק המונובלנטי של אפיטופות אנטיגן של אימונוגלובולין E בשל עודף של אלרגן, אשר מעכב את אלרגן אימונוגלובולין E cross-linking בריכוזים אנטיגן גבוהים.

ריכוז האנטיגן הדרוש לשחרור המתווך החצי-מקסימלי חושב באמצעות ניתוח הרגרסיה הליניארית. בדיקת הכדאיות של התא בוצעה כדי לא לכלול את ההשפעות הציטוטוקסיות הנגזרות מהסרום החושני או מהאנטיגן המשמש לגירוי. חמישה סרומים אנושיים שונים שימשו לבדיקת פעילות בטא-הקסוסמידאז, וארבעה מתוך חמישה סרה שמקורם בחולי אלרגיה לאבקת ליבנה הגיבו לגירוי Bet v 1, והוכיחו כי Bet v 1 הוא אלרגן חזק האחראי על אימונוגלובולין E תיווך תסמינים אלרגיים.

התגובה הצולבת של אימונוגלובולין E לאלרגנים הומולוגיים הוערכת. התגובה לבית 1 נמצאה בשני המטופלים, אבל חולה 2 הגיב גם לקור 1. אלרגן מזון הומולוגי Bet v 1, המציין גבוה יותר Cor 1 תגובה צולבת אימונוגלובולין E רמות בחולה שני.

האופי ההיפואלרגני של גרסאות מוטנטיות של האלרגנים הוערך והושווה למקבילם סוג הפראי שלהם. עקומת השחרור של גרסת הקיפול Bet v 1 עברה לריכוז אנטיגן גבוה יותר בהשוואה לאלרגן מסוג הבר, וכתוצאה מכך ריכוז גבוה משמעותית של אנטיגן כדי לעורר את השחרור המקסימלי למחצה, מה שהופך את המוטציה לפחות אלרגית ולכן מועמד לאימונותרפיה ספציפית לאלרגן. אל תשכח להשאיר את פתרונות הכביסה על התאים עד החלת דילול אנטיגן כדי למנוע את התאים להתייבש, אחרת, זה יגרום ביצועים ירודים של ההסתה.

הבדיקה יכולה לשמש עבור יישומים רבים ושונים, כולל סטנדרטיזציה של מוצרים אלרגניים, בהתבסס על הפעילות הביולוגית שלהם, כגון פתרונות בדיקת דקירה בעור או תמציות המשמשות לאימונותרפיה ספציפית לאלרגן.