Name: מודל מדרגי לחקר ההשפעות של פגיעה בוטה בכוח בדגי זברה בוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: חקור מודל Marmarou מותאם ליצירת פגיעת ראש טראומטית בכוח בוטה בדגי זברה בוגרים. השיטה מאפשרת לחקור מנגנוני התחדשות עצבית ותגובות ביולוגיות לדרגות חומרה שונות של פגיעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לחברי המעבדה בהייד על הדיונים המהורהרים שלהם, לטכנאי המרכז למדעי החיים של פריימן על טיפול וגידים של דגי זברה, ולאוניברסיטת נוטרדאם אופטי מיקרוסקופיה Core/NDIIF על השימוש במכשירים ובשירותיהם. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז לחקר דגי זברה באוניברסיטת נוטרדאם, המרכז לתאי גזע ורפואה רגנרטיבית באוניברסיטת נוטרדאם, ומענקים ממכון העיניים הלאומי של NIH R01-EY018417 (DRH), תוכנית מלגת המחקר לתואר שני של הקרן הלאומית למדע (JTH), מלגת LTC ניל היילנד מנוטרדאם (JTH), זקיפים של מלגת חופש (JTH) ומלגת פט טילמן (JTH).

דגי זברה גדלו והתוחזקו במתקן דגי הזברה של נוטרדאם במרכז פריימן למדעי החיים. השיטות המתוארות בכתב יד זה אושרו על ידי אוניברסיטת נוטרדאם טיפול בבעלי חיים ושימוש בוועדה.
1. פרדיגמת פגיעה מוחית טראומטית
<ol><li>הוסף 1 מ"ל של 2-פנוקסיאתנול ל 1 ליטר של מי מערכת (60 מ"ג של אוקיינוס מיידי ב 1 ליטר של מי RO deionized).</li>
	<li>הכן מיכל התאוששות מאוורר המכיל 2 ליטר של מי מערכת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בחר את המשקל הרצוי של מיסבים כדוריים ואת האורך וקוטר הרצוי של צינורות פלדה / פלסטיק ולקבוע את האנרגיה ואת כוח ההשפעה. הערה: צינורות צריכים להיות קוטר פנימי המאפשר את מיסוי הכדור לעבור מבלי לשנות את הנתיב או את מהירות התנועה שלה.<ol>
<li>קבע את האנרגיה הקינטית בעת הפגיעה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq01.jpg"> איפה, KE = אנרגיה קינטית, m = מסה (בק"ג), g = כוח כבידה, h = גובה (במ') מנקודת טיפה לדגים. הערה: פעולה זו מספקת אנרגיה קינטית ב- J. הכפל את הערך ב- 1,000 כדי לקבוע mJ. KE מבוסס על אובייקט מאיץ, המתרחש כאשר נושאת הכדור יורדת ממיקום נייח.</li>
		<li>צור TBI מתון (miTBI) באמצעות צינורות פלדה/פלסטיק באורך 7.62 ס"מ המסתיים 1.5 ס"מ מעל הצלחת על גולגולת דג הזברה (מרחק כולל של 9.1 ס"מ) ומסב כדור בקוטר 1.5 גרם (6.4 מ"מ). אלה מייצרים אנרגיה קינטית של 1.33 mJ. נזק זה הוחלט אמפירית להיות שווה ערך miTBI המבוסס על סמני TBI פתופיזיולוגיים מפתח, כגון פגיעה בכלי הדם, היווצרות שטף דם subdural / intracerebral, מוות תאי עצבי, ליקויים קוגניטיביים כי במידה רבה recapitulated מה דווח באוכלוסייה האנושית באופן תלוי חומרה.</li>
		<li>חשב אנרגיה קינטית miTBI = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq02.jpg">
</li>
		<li>צור TBI מתון (moTBI) באמצעות צינורות פלדה/ פלסטיק באורך 12.7 ס"מ המסתיים 1.5 ס"מ מעל הצלחת על גולגולת דג הזברה (מרחק כולל של 14.2 ס"מ) ומסב כדור בקוטר 1.5 גרם (קוטר 6.4 מ"מ) המייצר אנרגיה קינטית של 2.08 mJ.</li>
		<li>חשב אנרגיה קינטית moTBI = <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq03.jpg">
</li>
		<li>צור TBI חמור (sTBI) באמצעות צינורות פלדה/ פלסטיק באורך 7.62 ס"מ המסתיים 1.5 ס"מ מעל הצלחת על גולגולת דג הזברה (מרחק כולל של 9.1 ס"מ) ומסב כדור בקוטר 3.3 גרם (8.38 מ"מ) המייצר אנרגיה קינטית של 2.94 mJ.</li>
		<li>חשב אנרגיה קינטית sTBI = <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq04.jpg">
</li>
	</ol></li>
	<li>מלאו צלחת פטרי בחימר דוגמנות (איור 1, שלב 1) והשתמשו בכלי קהה (כלומר, בגב זוג מלקחיים) כדי ליצור פלטפורמה מוגבהת (5 ס"מ על 1.5 ס"מ) עם חימר דוגמנות נוסף (איור 1, שלב 2).<ol>
<li>השתמשו בסכין גילוח כדי לחלק את הפלטפורמה המוגבהת לאורכה לשני חצאים שווים בקירוב (איור 1, שלב 3, קו מקווקו אדום). יוצרים את שני החצאים לערוץ המתאים לאורך של דג בוגר (איור 1, שלב 4). השתמש חימר נוסף כדי לבנות קירות שיאבטחו ~ 2/3 של גוף הדג, משאיר את הראש חשוף.</li>
		<li>לעצב תמיכה קטנה באזור הראש החשוף בניצב לקירות כדי לתמוך בראש כדי למנוע סיבוב או רהט של הראש על פציעה (איור 1, שלב 4). הערה: הערוץ צריך להיות עמוק מספיק כדי לתמוך בדגים במצב של למעלה, אך עדיין צריך לאפשר לראש לנוח מעל החימר שמסביב. בנוסף, תמיכת הראש צריכה לעקוב אחר העקמומיות הטבעית של הדגים, ותמיכה בלסת התחתונה ובזימים.</li>
		<li>ודאו שמשקל הירידה אינו מעוקל על ידי הצדדים של הערוץ (איור 1, שלב 4).</li>
	</ol></li>
	<li>צור דיסק פלדה בקוטר 3 מ"מ באמצעות ניקוב חור מיני 22 גרם מהבהב פלדה. ניתן להשתמש בכל דיסק מספר פעמים.</li>
	<li>להרדים דג אחד על ידי הצבתו לתוך עם 50-100 מל של 1:1000 (1 מל / 1 L, 0.1%) 2-פנוקסיאתנול עד שהוא אינו מגיב לצבוט זנב.</li>
	<li>הניחו את הדג, צד גב למעלה, על תבנית החימר בתוך התעלה כך שהגוף יהיה מאובטח בצדדים והניחו על הראש דיסק פלדה באורך 3 מ"מ 22 גרם, שבמרכזו נקודת הפגיעה הרצויה (איור 1, שלב 5).<ol>
<li>ודא כי הדג מיושר בניצב ככל האפשר כדי למנוע את ראשו מלהטות לצד אחד, אשר עלול לגרום לפגיעה לא אחידה.</li>
	</ol></li>
	<li>אבטחו את צינורות הפלדה/פלסטיק, באמצעות מעמד טבעת סטנדרטי ומהדק זרוע, כך שתחתית הצינורות היא 1.5 ס"מ מעל ראש דג הזברה (איור 1, שלב 6). ודאו שהצינורות ישרים.<ol>
<li>הביטו מטה בצינורות וודאו שהצינורות מיושרים מעל צלחת הפלדה.</li>
	</ol></li>
	<li>זרוק את מיסוי הכדור (1.5 גרם עבור TBI מתון ומתון, ו 3.3 גרם עבור TBI חמור) מגובה קבוע מראש (מתואר בשלבים 1.3.3-1.3.5) במורד הצינורות על צלחת הפלדה הממוקמת מעל האזור הנוירואנטומי הרצוי של עניין (למשל, המוח הקטן, איור 1, שלב 5) כדי לייצר את TBI כוח קהה לחומרה הרצויה של פציעה. מניחים את הדגים הפצועים במיכל התאוששות כדי להיות במעקב. הערה: בהתאם לחומרת הפציעה, תמותה או התקפי טוניק-קלוניים עלולים להתרחש. אם הדגים אינם מגיבים במשך תקופה ממושכת של זמן בעקבות TBI, להשתמש pipette העברה או מלקחיים כדי לנהל זנב קמצוץ ולהעריך לתגובה כאב.</li>
</ol>2. הבקעת התקפים לאחר TBI בדגי הזברה הבוגרים
<ol><li>להרדים ולפצוע את הדגים על פי פרוטוקול הפציעה המתואר בסעיף 1 ומניחים את הדגים הפצועים במיכל התאוששות מאוורר של 2 ליטר של מי מערכת.</li>
	<li>שימו לב לדגים לסימנים של התקפים פוסט-טראומטיים שמתחילים מיד לאחר שהוכנסו למיכל ההתאוששות. קבע זמן תצפית (כלומר, שעה) ותיעד את כל פעילות ההתקפים, כולל ציון התפיסה (המתואר להלן), משך כל התקף ואחוז הדגים שחוו התקפים (איור 2A). הערה: התקפים יכולים להתרחש מיד עם הפציעה, כמו גם שעות או ימים לאחר TBI. התקפים יכולים להימשך לטווח ארוך ודגים בודדים יכולים להיות התקפים מרובים. קביעת זמן תצפית של שעה ומעלה תניב ייצוג טוב למגמה הכוללת של שיעורי תפיסה.</li>
	<li>ציון דגים באמצעות הנחיות Mussulini18 עבור פנוטיפים התקפי דגי זברה למבוגרים. הערה: ללא שימוש בתוכנת המעקב, קשה להעריך את ציוני ההתקפים מתחת ל-3 באופן בלתי משוחד. לכן, רק ציוני תפיסה של 3 ומעלה יש לרשום כאשר ההערכה מתבצעת ללא תוכנה.</li>
</ol>3. ניתוח מוח
<ol><li>המת חסד דגים ב 1:500 (2 מ"ל / 1 L, 0.2%) פתרון של 2-פנוקסיאתנול, עד תנועות זימים להפסיק, והם אינם פעילים סנפיר צביטה, בנקודת הקצה הרצויה.</li>
	<li>מלא צלחת פטרי עם חימר דוגמנות וליצור חלל קטן כדי לתמוך בגוף במהלך הניתוח.</li>
	<li>מניחים את הדג, צד הגב למעלה, בתבנית החימר. מניחים סיכת ניתוח אחת דרך קו האמצע באמצע גוף הדג וסיכה שנייה ~ 5 מ"מ מאחורי בסיס הראש.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ אור ניתח, נתק בבוטות את עצב הראייה עם זוג מלקחיים של דומונט מס' 5 והסר את העיניים (איור 2A).</li>
	<li>כוון את הדג כך שקצה הרוסטריאל יהיה הרחוק ביותר כשמסתכלים דרך המיקרוסקופ (איור 2B). הערה: השלבים הבאים מיועדים לאנשים ימניים. אנשים שמאליים עשויים להעדיף לבצע את השלבים הבאים בכיוון שיקוף.</li>
	<li>השתמשו במלקחיים מס' 5 כדי למקם לאט קצה אחד של המלקחיים מתחת ללוח הקודקוד הימני, תוך ביצוע פעולת מספריים מכוונת הנעה לכיוון קצה הרוסטרלי והסירו את הלוחות הקודקודיים והחזיתיים הימניים (איור 2C).<ol>
<li>שמור את המלקחיים בזווית של 45° או נמוך יותר על מנת למנוע חדירה למוח במהלך הניתוח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>סובב את הדג 90° בכיוון השעון. הנח קצה אחד של המלקחיים מס' 5 מתחת ללוח הקודקוד השמאלי והשתמש באותה תנועת מספריים כדי להסיר את הלוחות הקודקודיים והחזיתיים השמאליים החושפים את כל ההיבט העורי של המוח (איור 2D,E).</li>
	<li>תעבירו בבוטות את המקסילה עם מלקחיים מס' 5. שמור על נורות הריח ולא לפגוע בהם אם זה אזור העניין.</li>
	<li>הסר את האופלקל, הניתוח הקדם-ניתוחי, הניתוח המשולב והתת-ניתוח הימניים עם מלקחיים מס' 5 (איור 2F).</li>
	<li>יש לכרות בבוטות את השרירים בקצה הקדחתני של פתח הקלבריום באמצעות מלקחיים מס' 5, וחושפים את חוט השדרה.</li>
	<li>תקיף בבוטות את חוט השדרה עם מלקחיים מס' 5. הניחו בזהירות מלקחיים מתחת למוח והוציאו בעדינות את המוח מהקלבריום. הערה: לעולם אל תצבט את המוח. השתמש במלקחיים כדי "לערסל" את המוח או לכרות מחדש את חוט השדרה החשוף כנקודת צביטה לתמרן את המוח.</li>
	<li>תקן את המוחות שהוסרו ב-9 חלקים 100% אתנול לחלק אחד 37% פורמלדהיד במהלך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על משטח נדנדה.</li>
</ol>4. מחקרי בצקת במוח דגי הזברה
<ol><li>להרדים ולפצוע דגים על פי פרוטוקול הפציעה המתואר בסעיף 1 ולאפשר לדגים להתאושש במיכל התאוששות עד שהם מתחילים לשחות בחופשיות.</li>
	<li>החזירו את הדגים לתנאי הדיור הרגילים לאחר הפציעה למשך יום אחד.</li>
	<li>המתת חסד את הדג ב 1:500 2-פנוקסיאתנול, לאחר שהזמן חלף.</li>
	<li>לנתח את כל המוח או אזור העניין על פי הפרוטוקול המתואר בסעיף 3 ולהניח את המוח מיד על סירת שקילה קטנה. הערה: היזהר בעת העברת המוח, באמצעות מלקחיים עדינים כדי למקם אותו בעדינות על סירת השקילה מבלי לדקור או לגרד את המוח, אשר עלול לגרום לאובדן רקמות.</li>
	<li>תווית (עם קבוצת פציעה ומספר מוח) ו tare ייבוש קטן נוסף שוקל סירה בקנה מידה. השתמש בקנה מידה עם היכולת למדוד מינימום של 0.001 גרם כדי לקבל מדידה מדויקת.</li>
	<li>מעבירים את המוח לסירה השקילה של ייבוש זפת ומתעדים את המשקל הרטוב של המוח. כוון את המוח כך שהם ישכבו על סירת השקילה כשצד הגב פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>מניחים את סירה שוקל ייבוש ואת המוח בתנור הכלאה להגדיר 60 °C (8 שעות).</li>
	<li>לאחר הייבוש, המוח עשוי להיצמד לסירה שוקל ייבוש עשוי להיות קשה להסיר ולהעביר לסירה שקל קטנה מזופת חדשה. הימנע צובט את המוח עם מלקחיים, כמו זה עלול לגרום נזק למוח היבש ואובדן רקמות. במקום זאת, לצבוט את המלקחיים העדינות יחד, החל מהצד הגחון של המוח, לגרוף בתנועה כלפי מעלה.</li>
	<li>קבעו את תכולת המים של כל מוח באמצעות הנוסחה (איור 4): <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq05.jpg">
</li>
</ol>5. תיוג התפשטות תאית על פני הנוירוקסיס והכנת רקמות קבועות.
<ol><li>הכן 10 מ"מ 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) ב 2 מ"ל של ddH2O.</li>
	<li>להרדים 3 עד 4 דגים בכל פעם ב 50-100 מ"ל של 1:1000 (1 מ"ל / 1 L, 0.1%) 2-פנוקסיאתנול עד הדגים אינם מגיבים לצבוט זנב, בנקודת הזמן הרצויה לאחר פציעה (באמצעות הפרוטוקול המתואר בסעיף 1).</li>
	<li>לעשות חתך חלקי על ספוג רטוב ומניחים דג אחד בכל פעם בפתח, בצד הגחון למעלה.</li>
	<li>השתמש מחט 30 G כדי להזריק ~ 40 μL של 10 mM EdU לתוך הגוף של הדג. החזירו את הדג למיכל אחזקה מלא במי מערכת. הערה: זריקות חוזרות עשויות להתבצע בנקודות זמן שונות כדי לסמן מספר גדול יותר של תאים מתרבים וייתכן שיהיה צורך לתקופת מרדף של יותר משבוע אחד.</li>
	<li>לאסוף מוחות כפי שמתואר בסעיף 3 ולמקם אותם כקבוצה ב בקבוקון זכוכית 5 מ"ל המכיל 2 מ"ל של 9 חלקים 100% אתנול ל 1 חלק 37% פורמלדהיד. תקן את המוח ב 4 °C (5 °F) על פלטפורמת רוקר. הערה: פלטפורמת נדנדה או שייקר אוסרת על המוח לנוח בתחתית ועל הטלנספלון של מוחות שלמים מסלסול.</li>
	<li>מוחות Rehydrate, באותו בקבוקון זכוכית המשמש לתיקון המוח, בשטיפה של סדרת אתנול יורד, 75%, 50%, ו 25%, במשך 15 דקות כל אחד, ואחריו לשטוף 1.5 שעות ב 5% סוכרוז / PBS על רוקר בטמפרטורת החדר. יש לאחסן את המוח ב בקבוקון זכוכית למשך הלילה ב-30% סוכרוז/PBS ב-4 מעלות צלזיוס על משטח נדנדה.</li>
	<li>הסר את המוח מ 30% סוכרוז / PBS ולהעביר אותם עם מלקחיים לתוך צלחת 12 טוב (קבוצת טיפול אחת לבאר) עם בארות מלאות בתמיסה 2:1 המורכבת 2 חלקים רקמות הקפאה בינוני 1 חלק 30% סוכרוז / PBS. לדגור את המוח בלילה ב 4 °C (5 °F) על פלטפורמת רוקר.</li>
	<li>העבר את המוח לשורה הבאה של הבא של בארות בתוך 12-טוב צלחת שקוע מוחות ב 100% TFM עבור 2-24 שעות ב 4 °C (70 °F).</li>
	<li>השתמש צ'אק cryostat להטמיע את המוח ב- TFM באוריינטציה הרצויה על קרח יבש.</li>
	<li>בצע cryosectioning (קטעים בעובי 16 מיקרומטר) ואסוף את המקטעים בשקופיות טעונות חיוביות. מחליק יבש על מחמם שקופיות במשך שעה אחת ולאחר מכן לאחסן ב -80 °C (80 °F) או להמשיך עם אימונוהיסטוכימיה.</li>
	<li>הכן מחסום הידרופובי על המגלשה סביב קטעי הרקמה ולאפשר להתייבש על מחמם שקופיות במשך 20 דקות.</li>
	<li>לשטוף בקצרה את השקופיות PBS במשך 5 דקות ולאחר מכן פעמיים PBS-Tween 20 (0.05%) במשך 10 דקות כל אחד.</li>
	<li>בצע זיהוי EdU באמצעות ערכת התפשטות תאי EdU והוראות היצרן.</li>
	<li>נתח את השקופיות וכמת את התאים הניוזרים בתווית EdU באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או מיקרוסקופ קונפוקל. מינימום של מטרה 40x יידרש להבחין בבירור תאים בודדים.</li>
</ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+Report+of+Traumatic+Brain+Injury-related+Emergency+Department+Visits%2C+Hospitalizations%2C+and+Deaths-United+States%2C+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Centers+for+Disease+Control+and+Prevention%2C+U.S.+Department+of+Health+and+Human+Services%22%5BJournal%5D)">Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths-United States, 2014.</a> Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , (2019).</li>
<li>Galgano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injury%3A+current+treatment+strategies+and+future+endeavors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors.</a> Cell transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).</li>
<li>Santiago, L. A., Oh, B. C., Dash, P. K., Holcomb, J. B., Wade, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+comparison+of+penetrating+and+blunt+traumatic+brain+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+injury%22%5BJournal%5D)">A clinical comparison of penetrating and blunt traumatic brain injuries.</a> Brain injury. 26 (2), 107-125 (2012).</li>
<li>Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergency+department+evaluation+of+traumatic+brain+injury+in+the+United+States%2C+2009-2010%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Head+Trauma+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010.</a> The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31 (6), 379-387 (2016).</li>
<li>Faul, M., Xu, L., Wald, M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFaul%2C+M+%22Traumatic+Brain+Injury+in+the+United+States%3A+Emergency+Department+Visits%2C+Hospitalizations+and+Deaths%22">Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths</a>. , (2010).</li>
<li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch3+and+DeltaB+maintain+M%C3%BCller+glia+quiescence+and+act+as+negative+regulators+of+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Glia. 69 (3), 546-566 (2021).</li>
<li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLoS Biology. 17 (2), 3000159(2019).</li>
<li>Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+zinc+sulfate+results+in+differential+effects+on+olfactory+sensory+neuron+subtypes+in+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445(2016).</li>
<li>Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).</li>
<li>Becker, C., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Restorative+Neurology+and+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li>
<li>Alyenbawwi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizures+are+a+druggable+mechanistic+link+between+TBI+and+subsequent+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Seizures are a druggable mechanistic link between TBI and subsequent tauopathy.</a> eLife. 10, 58744(2021).</li>
<li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+neuroepithelia-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of neuroepithelia-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li>
<li>McCutcheon, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+traumatic+brain+injury+in+adult+zebrafish+demonstrates+response+to+injury+and+treatment+comparable+with+mammalian+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A novel model of traumatic brain injury in adult zebrafish demonstrates response to injury and treatment comparable with mammalian models.</a> Journal of Neurotrauma. 34 (7), 1382-1393 (2017).</li>
<li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li>
<li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li>
<li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li>
<li>Marmarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+I%3A+Pathophysiology+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).</li>
<li>Mussulini, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizures+induced+by+pentylenetetrazole+in+the+adult+zebrafish%3A+a+detailed+behavioral+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Seizures induced by pentylenetetrazole in the adult zebrafish: a detailed behavioral characterization.</a> PloS One. 8 (1), 54515(2013).</li>
<li>Kalueff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+comprehensive+catalog+of+zebrafish+behavior+1.0+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond.</a> Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).</li>
<li>Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+traumatic+brain+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Animal models of traumatic brain injuries.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 128-142 (2013).</li>
<li>Amamoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+axolotls+can+regenerate+original+neuronal+diversity+in+response+to+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury.</a> eLife. 5, 13998(2016).</li>
<li>Yamamoto, S., Levin, H., Prough, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild%2C+moderate+and+severe%3A+terminology+implications+for+clinical+and+experimental+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mild, moderate and severe: terminology implications for clinical and experimental traumatic brain injury.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (6), 672-680 (2008).</li>
<li>Lund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+traumatic+brain+injury%2C+acute+phase+course+and+deviations+in+physiological+variables%3A+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Trauma+Resuscitation+and+Emergency+Medicine%22%5BJournal%5D)">Moderate traumatic brain injury, acute phase course and deviations in physiological variables: an observational study.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation and Emergency Medicine. 24, 77(2016).</li>
<li>Levin, H., Arrastia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis%2C+prognosis%2C+and+clinical+management+of+mild+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury.</a> The Lancet Neurology. 14 (5), 506-517 (2015).</li>
<li>Ruff, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+diagnosing+a+mild+traumatic+brain+injury%3A+a+National+Academy+of+Neuropsychology+education+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Clinical+Neuropsychology%3A+The+Official+Journal+of+the+National+Academy+of+Neuropsychologists%22%5BJournal%5D)">Recommendations for diagnosing a mild traumatic brain injury: a National Academy of Neuropsychology education paper.</a> Archives of Clinical Neuropsychology: The Official Journal of the National Academy of Neuropsychologists. 24 (1), 3-10 (2009).</li>
<li>Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in fish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (7), 019018(2016).</li>
<li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+origin%2C+proliferation+dynamics%2C+migration+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295, 263-277 (2006).</li>
<li>Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+Muller+glia+to+regenerate+retinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons.</a> Annual Review of Visual Science. 6, 171-193 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

חקירות של נוירוטרומה והמשך הקשורים כבר זמן רב התמקדו מודלים מכרסמים מסורתיים שאינם רגנרטיביים20. רק לאחרונה מחקרים יישמו צורות שונות של נזקי מערכות ום ים למודלים רגנרטיביים9,11,13,14,21. למרות תובנה, מודלים אלה מוגבלים על ידי שימוש בשיטת פגיעה נדירה באוכלוסייה האנושית (טראומות חודרות, אבלציה כימית, פיצוץ) ו / או שהפגיעה אינה מדרגית ולכן...

פגיעות מוחיות טראומטיות (TBIs) הן משבר בריאותי עולמי וגורם מוביל למוות ונכות. בארצות הברית, כ -2.9 מיליון אנשים חווים TBI מדי שנה, ובין השנים 2006-2014 התמותה עקב TBI או TBI sequelae גדלה ביותר מ -50%1. עם זאת, השחפת משתנה באטיולוגיה, בפתולוגיה ובהצגה הקלינית שלהם בעיקר בשל מנגנון הפציעה (MOI), המשפיע גם על אסטרטגיות הטיפול ועל הפרוגנוזה החזויה2. למרות שחפת יכולה לנבוע MOI שונים, הם בעיקר תוצאה של טראומה חודרת או בוטה כוח. טראומות חודרות מייצגות אחוז קטן של שחפת ומייצרות פגיעה חמורה ומוקדית המותאמת לאזורי המוח המיידיים וסובבים3. לעומת זאת, שחפת בוטה נפוצה יותר באוכלוסייה הכללית, משתרעת על פני מגוון של חומרות (קלות, בינוניות וחמורות), ומייצרת פגיעה מפוזרת, הטרוגנית ועולמית המשפיעה על אזורים מוחיים מרובים1,4,5.
דגי זברה (דניו ריו) נוצלו כדי לבחון מגוון רחב של עלבונות נוירולוגיים המשתרעים על מערכת העצבים המרכזית (CNS)6,7,8,9. דגי זברה מחזיקים גם, בניגוד ליונקים, תגובה רגנרטיבית מולדת וחזקה לתיקון נזקי מערכת NS10. מודלי טראומה הנוכחיים של דגי הזברה משתמשים בשיטות פציעה שונות, כולל חדירה, כריתה, עלבון כימי או גלי לחץ11,12,13,14,15,16. עם זאת, כל אחת משיטות אלה משתמשת MOI כי הוא מנוסה לעתים רחוקות על ידי האוכלוסייה האנושית, אינו מדרגי על פני מגוון של חומרות פגיעה, ואינו מתייחס הטרוגניות או חומרה תלוי TBI sequela שדווח לאחר כוח בוטה TBI. גורמים אלה מגבילים את השימוש במודל דגי הזברה כדי להבין את המנגנונים הבסיסיים של הפתולוגיות הקשורות לצורה הנפוצה ביותר של TBI באוכלוסייה האנושית (פציעות קלות בוטה).
שמנו לנו למטרה לפתח מודל דגי זברה מהירים ומדרגיים המספק אפיקים לחקור פתולוגיית פציעות, התקדמות של SEQUELA TBI, ואת התגובה הרגנרטיבית המולדת. שינינו את הירידה הנפוצה במשקל של המכרסם Marmarou17 והפעלנו אותה על דגי זברה בוגרים. מודל זה מניב טווח חומרה רב-ממדי הנע בין מתון, בינוני ועד חמור. מודל זה גם משחזר היבטים מרובים של פתולוגיה TBI אנושית, באופן תלוי חומרה, כולל התקפים, בצקת, שטף דם תת-עורי וtracerebral, מוות תאי עצבי, ליקויים קוגניטיביים, כגון למידה ופגיעה בזיכרון. ימים לאחר הפציעה, הפתולוגיות והגירעונות מתפוגגים, וחוזרים לרמות הדומה לבקרות שלא ניזוקו. בנוסף, דג זברה זה מציג התפשטות חזקה ותגובת התחדשות עצבית ברחבי הנוירוקסיס בנוגע לחומרת הפציעה.
כאן, אנו מספקים פרטים לקראת הקמה וגיוס של טראומה קהה כוח, ניקוד התקפים פוסט טראומטיים, הערכה של פציעות כלי דם, הוראות להכנת מקטעי מוח, גישות לכימות בצקת, ותובנה על התגובה ההתרבותית לאחר פציעה.

<table><tbody><tr><td>2-פנוקסיאתנול</td><td>סיגמא אלדריך</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>#00 Buckshot</td><td>רמינגטון</td><td>RMS23770</td><td>משקל 3.3 גרם עבור sTBI</td></tr><tr><td>#3 Buckshot</td><td>רמינגטון</td><td>RMS23776</td><td>משקל 1.5 גרם עבור miTBI/moTBI</td></tr><tr><td>#5 מלקחיים של דומונט</td><td>WPI</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>5-ethynyl-2'-deoxyuridine</td><td>Life Technologies</td><td>A10044</td><td>EdU</td></tr><tr><td>בקבוקון זכוכית 5 מ"ל</td><td>VWR</td><td>66011-063</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU ערכת התפשטות תאים</td><td>Life Technologies</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>CytoOne 12 בארות</td><td>צלחת ארה"ב Scientific</td><td>CC7682-7512</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>סופר פרוסט שקופיות טעונות Postiviely</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pen חוסם נוזלים</td><td>טד פלה</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הקפאת רקמות</td><td>VWR</td><td>15148-031</td><td></td></tr></tbody></table>

מודל מדרגי לחקר ההשפעות של פגיעה בוטה בכוח בדגי זברה בוגרים

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

פגיעות מוח טראומטיות בוטה (TBI) הן הצורה הנפוצה ביותר של טראומת ראש, המשתרעת על מגוון של חומרות ותוצאות השפעות משניות מורכבות והטרוגניות. אמנם אין מנגנון להחליף או לחדש את הנוירונים האבודים בעקבות TBI בבני אדם, דגי זברה יש את היכולת לחדש נוירונים בכל הגוף שלהם, כולל המוח. כדי לבחון את רוחב הפתולוגיות המוצגות בדגי זברה בעקבות TBI קהה ולחקור את המנגנונים שבבסיס התגובה המתחדשת העצבית שלאחר מכן, שינינו את הירידה הנפוצה במשקל מרמרו המכרסם לשימוש בדגי זברה בוגרים. מודל ה-TBI הפשוט שלנו הוא מדרגי, גורם ל-TBI קל, בינוני או חמור, ומציג מחדש רבים מהפנוטיפים שנצפו בעקבות TBI אנושי, כגון התקפי מגע ופוסט טראומה, בצקת, שטף דם תת-עורי וtracerebral, וליקויים קוגניטיביים, שכל אחד מהם מוצג באופן תלוי חומרת פציעה. רצף TBI, אשר מתחיל להופיע בתוך דקות של הפציעה, שוכך ולחזור לרמות שליטה כמעט ללא פגע בתוך 7 ימים לאחר הפציעה. תהליך הרגנרטיביות מתחיל כבר 48 שעות לאחר הפציעה (hpi), כאשר שיא התפשטות התאים נצפה על ידי 60 כ"ס. לפיכך, מודל ה-TBI שלנו מייצר פתולוגיות TBI פגיעות ראשוניות ומשניות אופייניות הדומות ל- TBI האנושי, המאפשר לחקור את התפרצות המחלה והתקדמותה, יחד עם מנגנוני ההתחדשות העצבית הייחודיים לדגי זברה.

הכנת אסדת אינדוקציה לפציעות מאפשרת אמצעי מהיר ופשטני של אספקת TBI קהה מדרגית לדגי זברה בוגרים. חומרתו המדורגת של מודל הפציעה מספקת מספר מדדים הניתנים לזיהוי בקלות של פגיעה מוצלחת, אם כי הפגיעה בכלי הדם היא אחת הפתולוגיות הקלות והבולטות ביותר (איור 3). זן הדגים המשמש במהלך הפציעה יכול להפוך מחוון זה קל יותר או קשה יותר לזיהוי. בעת שימוש בדגי AB מסוג בר (WTAB, איור 3A-D), קשה להבחין בזיהוי של פגיעה בכל...

שינינו את מודל ירידה במשקל של מרמארו לדגי זברה בוגרים כדי לבחון רוחב של פתולוגיות בעקבות פגיעה מוחית טראומטית בוטה (TBI) והמנגנונים שבבסיס ההתחדשות העצבית שלאחר מכן. מודל TBI קהה זה הוא מדרגי, מעורר TBI מתון, בינוני או חמור, ומשיב הטרוגניות פציעה שנצפו ב- TBI האנושי.

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה, מהירה וניתן לשחזור כדי לגרום לפגיעה מוחית טראומטית בכוח קהה מדרגי בדגי זברה בוגרים. דגי הזברה הבוגרים העוברים את הכוח הבוטה הזה פגיעה מוחית טראומטית מציגים רבים מהמאפיינים שנצפו בבני אדם הסובלים מכוח בוטה TBI. שיוכיחו את ההליך יהיו מר ג'יימס הניג וגברת קיילי קלוגסי, שני דוקטורנטים מהמעבדה שלי.התחל על ידי מילוי צלחת פטרי עם חימר דוגמנות. לאחר מכן השתמש באצבעות או בחלק האחורי של זוג מלקחיים כדי ליצור פלטפורמה מוגבהת עם חימר דוגמנות נוסף. מחלקים את הפלטפורמה המוגבהת לאורכה לשני חצאים שווים בקירב באמצעות סכין גילוח.יוצרים את שני החצאים לתוך ערוץ, כך שהוא מתאים לאורכו של דג בוגר. השתמש חימר נוסף כדי לבנות קירות כדי לאבטח 2/3 של גוף הדג עם הראש חשוף. לעצב תמיכה קטנה באזור הראש החשוף בניצב לקירות כדי למנוע סיבוב או נרתע של הראש על פציעה.ודא כי הצדדים של הערוץ אינם לעכב את המשקל ירד. השתמש ניקוב חור מיני כדי ליצור דיסק פלדה 3 מ"מ מהבהב פלדה 22 מד. מניחים דג מרדים שאינו מגיב לזנב צובט על תבנית החימר בתוך התעלה עם צדו האחורי למעלה, כך שגופו מאובטח בצדדים.הנח את דיסק הפלדה 22 מ"מ 3 מ"מ על הראש, במרכזו מעל נקודת הפגיעה הרצויה. יישר את הדג בניצב כדי למנוע מראשו להטות לצד אחד, מה שעלול לגרום לפגיעה לא אחידה. השתמש במעמד טבעת סטנדרטי ובמהדק זרוע כדי לאבטח את צינורות הפלדה או הפלסטיק, והבטח שהוא ישר, כך שתחתית הצינורות היא 1.5 ס"מ מעל ראשו של דג הזברה.תסתכל למטה הצינורות כדי להבטיח שהוא מיושר מעל צלחת הפלדה. בחר את מיסוי הכדור המתאים בהתבסס על חומרת הפציעה הרצויה. זרוק את נושאת הכדור מגובה קבוע מראש במורד הצינורות על צלחת הפלדה.ואז למקם את הדגים הפצועים במיכל ההתאוששות כדי להיות במעקב. מלא צלחת פטרי עם חימר דוגמנות וליצור חלל קטן כדי לתמוך בגוף במהלך הניתוח. מניחים את הדג בתבנית החימר עם צד הגוזל למעלה.מניחים שני סיכות דיסקציה, אחת דרך קו האמצע באמצע הגוף והשנייה כ-5 מ"מ מאחורי בסיס הראש. השתמש בזוג של 5 מלקחיים דומונט לנתק בבוטות את עצב הראייה ולהסיר את העיניים. מניחים קצה אחד של 5 מלקחיים מתחת לצלחת הקודקוד הימנית.בצע פעולת מספריים מכוונת נע לכיוון קצה rostral ולהסיר את הלוח הקדמי הימני. ואז לסובב את הדג 90 מעלות בכיוון השעון. מניחים קצה אחד של 5 המלקחיים מתחת לצלחת הקודקוד השמאלית ומשתמשים באותה תנועת מספריים כדי להסיר את הלוחות הקודקודיים והחזיתיים השמאליים, וחושפים את כל ההיבט העורי של המוח.השתמש 5 מלקחיים כדי להעביר בבוטות את maxilla כך נורות הריח נשמרים ולא ניזוקו. באמצעות אותם מלקחיים, הסר את האופל הימני, ניתוח מקדים, פעולה משולבת ותת-ניתוח. ואז בבוטות לכרות את השרירים בקצה caudal של calvarium לחשוף את חוט השדרה.באמצעות המלקחיים, תקיף בבוטות את חוט השדרה. מניחים את המלקחיים בזהירות מתחת למוח ולהסיר בעדינות את המוח מהקלבריום. לנתח את כל המוח או אזור העניין באמצעות ההוראות בכתב היד הטקסט, ולהניח את המוח מיד על סירת שקילה קטנה באמצעות מלקחיים עדינים, תוך דאגה לא לדקור או לגרד את המוח.מעבירים את המוח לסירה השקילה של ייבוש זפת ומתעדים את המשקל הרטוב של המוח. כוון את המוחות להניח אותם שטוחים על סירת השקילה כשצד החזיר פונה כלפי מעלה. לאחר מכן מניחים את המוח ואת ייבוש שוקל סירה בתנור הכלאה להגדיר 60 מעלות צלזיוס במשך שמונה שעות.כדי להעביר את המוח לסירה קטנה מזופתת חדשה ברגע שהיא יבשה, צבוט את המלקחיים העדינות יחד, והחל מהצד הגחון של המוח, לגרוף בתנועה כלפי מעלה. לעשות חבטה חלקית על ספוג רטוב. מניחים דג אחד בכל פעם בפתח עם הצד הגחון למעלה ולהשתמש במחט 30 מד להזריק כ 40 microliters של 10 מילימולר EdU לתוך הגוף של הדג.לאחר מכן החזירו את הדג למיכל ההחזקה המלא במי מערכת. לאסוף את המוחות כאמור, וממקם אותם כקבוצה ב בקבוקון זכוכית 9 מיליליטר המכיל 2 מיליליטר של תשעה חלקים 100%אתנול לחלק אחד 37%פורמלדהיד. תקן את המוח ב-4 מעלות צלזיוס על משטח נדנדה.השתמש צ'אק cryostat להטמיע את המוח ב- TFM באוריינטציה הרצויה על קרח יבש. פגיעה בכלי הדם נמצאה כאחת הפתולוגיות הקלות והבולטות ביותר לזיהוי פגיעה מוצלחת באמצעות מודל זה. היכולת לזהות את המחוון השתנתה עם זן הדגים המשמשים במהלך הפציעה.זיהוי של פגיעה בכלי הדם בסוג בר AB היה קשה להבחין בין TBI מתון או בינוני ודגי בקרה ללא פגע עקב הפיגמנטציה. בעקבות הפציעה, דגי TBI הקלים הציגו שריטות משטח מינימליות, בעוד דגי TBI המתונים הציגו דימום מוחי מוגבל. היקף הפגיעה ניכר בדגי TBI קשים.לעומת זאת, פגיעה בכלי הדם ניתן לזהות בקלות בעת שימוש לבקן או דג קספר. נפיחות במוח עקב פציעה הוערך באמצעות בצקת. לעומת זאת, הן TBI מתון והן TBI חמור היה בצקת משמעותית, 1 dpi ו 3 dpi, אבל התוכן הנוזלי של TBI מתון ו TBI חמור חזר לרמות הדומה פקדים ניזוקו על ידי 5 dpi.פגיעה זו בכוח קהה הביאה לתגובת התפשטות תאים חזקה המשתרעת על פני הנוירוקסיס. תיוג EdU מוגבר נצפה באזורי החדר והתת-חדרי של החזה לעומת פקדים שלא ניזוקו. המוחות הפצועים הציגו תיוג מוגבר של EdU באזור האפור הצחיח, באונות הקטקל האופטיות ובהיבטים של ההיפותלמוס החלקירי בהשוואה למוח הדגים שלא ניזוק.בעקבות TBI חמור, אזורים נוירוגניים במוח האחורי הציגו התפשטות תאים מוגברת בהשוואה למוח שלא ניזוק. עבור אינדוקציה נכונה של הפגיעה, להבטיח את הדגים מאובטחים ויציבים בתבנית, וכי הצינורות הוא ישר כדי למנוע השפעה מחוץ למרכז או לשנות את מסלול ירידת המשקל. הליך זה מספק שיטת אינדוקציה מהירה וחסכונית של פגיעה בכוח קהה המיושמת על מודל רגנרטיבי שיהיה ישים במיוחד עבור טראומת ראש חוזרת ונשנית או מחקרים רגנרטיביים הנגרמים מפציעות.

a-scalable-model-to-study-effects-blunt-force-injury-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון זה, עוברים מופרים של דגי זברה עוברים דה-כוריון תחת מיקרוסקופ סטריאו ולאחר מכן נחשפים למעכב סינתזת כולסטרול, מה שמוביל להתפתחות קרעים בכלי הדם ודימומים מוחיים בזחלים. זחלים דימומיים, הניתנים לזיהוי על ידי כתמים אדומים ברורים, מופרדים לאחר מכן תחת מיקרוסקופ לניתוח נוסף.

מידול דימום הנגרם על ידי תרופות בזחלי דגי זברה

לאחר חיתוך רוחב השדרה, יש דג הזברה מבוגר התאוששות תפקודית על ידי שישה שבועות לאחר פציעה. כדי לנצל את שקיפות זחל והתאוששות מהירה יותר, אנו מציגים שיטה לtransecting חוט השדרה הזחל. לאחר חיתוך רוחב, אנו צופים התאוששות חושית מתחילים ב 2 ימים שלאחר פציעה, ותנועת C-עיקול על ידי 3 ימים לאחר פציעה.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

כדי לשפוך אור על המנגנונים התאיים והמולקולריים של נוירוגנזה והתחדשות בוגרים של דג הזברה, פיתחנו פרוטוקול לניתוח פולשני הגורם לפציעות מכניות בטלנצפלון הבוגר של דג הזברה וניטור לאחר מכן של שינויים בחצי הכדור הדקירה על ידי אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתר.

פציעה דקירת פצע של דג הזברה telencephalon מבוגרים: שיטה לחקר המוח של בעלי החוליות Neurogenesis והתחדשות

כאן אנו מציגים שיטה אמינה לחקר התחדשות כליות במבוגרים על ידי גרימת פגיעה כלייתית חריפה על ידי הזרקת גנטמיצין. אנו מראים כי הפציעה תלויה במינון הגנטמיצין ובטמפרטורת הסביבה באמצעות הכלאה באתרה כדי לתייג lhx1a+ מפתח נפרונים חדשים.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת פגיעה מכנית בכלי דם בעוברי דג זברה. מודל פציעה זה מספק פלטפורמה לחקר המוסטזיס, דלקת הקשורה לפציעה וריפוי פצעים באורגניזם המתאים באופן אידיאלי למיקרוסקופיה בזמן אמת.

פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

כאן נתאר 3 מודלים פציעה דג זברה מבוגרים, שלהם להשתמש בשילוב עם טיפול תרופות לדיכוי המערכת החיסונית. אנו מספקים הדרכה על הדמיה של התחדשות הרקמות ועל גילוי מינרליזציה עצם המצוי בו.

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

כאן אנו מציגים פרוטוקול לכמת פגיעה במוח, locomotor, ודלקות נוירודלקתיות בעקבות דימום במוח בזחלים דג זברה, בהקשר של דימום גרם האדם (השייך).

באמצעות הזחלים Zebrafish ללמוד את ההשלכות הפתולוגיים של שבץ מדמם

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לגרום לפגיעה בכליות חריפה (AKI) ב זברה-דג מבוגר באמצעות ציספלטין כסוכן נטרוקסי. פירטנו את השלבים כדי להעריך את הרבייה של הטכניקה ושתי טכניקות לניתוח דלקת ומוות תאים ברקמת הכליה, ציטומטריית זרימה ו- TUNEL, בהתאמה.

מודל פגיעה בכליות חריפה המושרה על ידי ציספלטין בדג זברה למבוגרים

מודל מכני של פגיעה מוחית בדגי זברה בוגרים מתואר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המווסתים את יכולת ההתחדשות הגבוהה שלהם. השיטה מסבירה יצירת פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי של מינים רבים של דגים קטנים כדי להעריך את התגובות הרגנרטיביות באמצעות אימונוסטיישן פלואורסצנטי.

מודל פציעת פצע דקירה של הטקטום האופטי הבוגר באמצעות דגי זברה ומדאקה לניתוח השוואתי של יכולת התחדשות

דגי זברה בוגרים, המסוגלים להחלמה תפקודית לאחר פגיעה בחוט השדרה, הם מערכת מודלים מובילה להבהרת מנגנונים מולדים של התחדשות עצבית. כאן, אנו מתארים סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדיקות כמו קריאות פונקציונליות של התחדשות חוט השדרה.

הערכה של סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים

פרוטוקול זה מתאר מודל cryoinjury כדי לגרום נזק עמוק של כמה מיומרים caudal בדגי זברה בוגרים. שיטה זו מספקת גישה חדשה לחקר התחדשות שרירי השלד לאחר אובדן חמור של רקמה אצל בעלי חוליות שאינם יונקים.

מודל Cryoinjury לחקר התחדשות שרירי השלד של הפדונקל הקאודלי בדגי זברה בוגרים

חקור מודל Marmarou מותאם ליצירת פגיעת ראש טראומטית בכוח בוטה בדגי זברה בוגרים. השיטה מאפשרת לחקור מנגנוני התחדשות עצבית ותגובות ביולוגיות לדרגות חומרה שונות של פגיעה.

מודל מדרגי לחקר ההשפעות של פגיעה בוטה בכוח בדגי זברה בוגרים

גלה סרטונים נוספים