מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה טורית של פרצוף בלוק (SBEM) לחקר קוצים דנדריטים

כל נוירון במוח מחובר לתאים עצביים אחרים על ידי כ 7,000 סינפסות. אלא שהסינפסות האלה במוח היונקים ממוקמות בעיקר על בליטות קטנות של הממברנה הנקראת קוצים דנדריטיים. פלסטיות של הסינפסות וקוצים דנדריטיים וכדומה, תפקודי מוח חשובים כמו תהליכי למידה וזיכרון.

חשוב לציין כי רק מיקרוסקופיית אלקטרונים נותנת תובנה מלאה אם לעמוד שדרה דנדריטי יש קלט פוסט-סינפטי. טכניקות שונות על דימות קוצים דנדריטי זמינים. עם זאת, מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקת פנים בלוק סדרתית מעניקה אפשרות ייחודית לדמיין נפח גדול של רקמה ברזולוציה גבוהה.

טכניקת מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה סדרתית מבוססת בלוק דורשת פרוטוקול מיוחד של הכנת מדגם הכולל ניגוד חזק עם מתכות כבדות. הקיבעון העיקרי שלי במהלך זלוף אפשר לנו להשתמש באותם מוחות למיקרוסקופיית אלקטרונים מוארת. עכברים הוקרבו ונושלו עם קיבעון ראשוני מתון.

המוח נחתך לחצי וחצי וחצי כדור אחד הוצב עם אימונופלואורסצנטיות ייעודית לקיבוע, קריו-הגנה, פרוסה באמצעות קריוסטט ומעובדת למחקרי אימונופלואורסצנטיות. היכן שחצי הכדור השני הוצב עם מיקרוסקופיה אלקטרונית קבועה, פרוסה עם הוויברטום ומוכנה למחקרי מיקרוסקופיה אלקטרונית. פרוסות מוח למחקרי מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה סדרתיים מבוססי בלוק היו מנוגדים, שטוח מוטבע שרף, אז אזור CA1 של ההיפוקמפוס הותקן על הסיכה ותמונה עם מיקרוסקופ אלקטרוני סריקה מבוסס בלוק סדרתי.

החלק בפרוטוקול המודגש בקופסה צהובה הוצג בסרטון. קח את הרקמה, אשר תוקן לחתוך לתוך 100 פרוסות מיקרוביוטיות לשטוף אותו עם חוצץ פוספט קר חמש פעמים במשך שלוש דקות כל אחד. הכן תערובת של אחד על אחד של 4%אוסמיום tetroxide ו 3%אשלגן ferrocyanide.

המוצר הסופי יהפוך לחום. לטבול את הדגימות בתערובת זו. ואז למקם את הדגימות על קרח.

ומשלב זה ואילך חשוב להגן עליהם מפני אור. לדגור אותם עם רועד עדין במשך שעה אחת. בינתיים, להכין את פתרון TCH.

מערבבים 10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים ו 0.1 גרם של TCH. מניחים אותו בתנור שנקבע על 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. חשוב לגנום את הפתרון מעת לעת.

כאשר מוכן, לקרר אותו לטמפרטורת החדר. עכשיו לשטוף את הדגימות עם מים מזוקקים כפול חמש פעמים במשך שלוש דקות כל אחד ולאחר מכן לטבול אותם בתמיסת TCH מסוננת. הפרוסות יהפכו לשחורות.

לדגור אותם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הדגימות עם מים מזוקקים כפול חמש פעמים במשך שלוש דקות כל אחד ודגור אותם עם 2% osmium tetroxide במשך 30 דקות, הפעם בטמפרטורת החדר. שוב, לשטוף את הדגימות עם מים מזוקקים כפול חמש פעמים במשך שלוש דקות כל מקום אותם לתוך מסונן 1%או אצטט עמיל.

לדגור אותם בארבע מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת, להתחיל עם הכנת D-אספרטט. מערבבים עופרת חנקתית עם תמיסת חומצה אספרטית מחוממת מראש ל-60 מעלות צלזיוס.

מניחים את התערובת באמבט מים להגדיר ב 60 מעלות צלזיוס ולהתאים את ה- pH ל 5.5 עם נתרן הידרוקסיד טוחן אחד. סוגרים את הקרבון עם אספרטט עופרת ומשאירים אותו ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. הפתרון צריך להיות ברור.

אם נהיה מעונן יש להשליך אותו וצריך להכין אחד חדש. בינתיים, לשטוף את הדגימות עם גז מזוקק כפול מים חמש פעמים במשך שלוש דקות כל אחד ולשמור אותם בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. טובלים את הדגימות בתמיסת אספרטט העופרת הטריה ודגר אותם בתנור שנקבע על 60 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.

הכן שרף אפוקסי. שוקלים את החומרים ומערבבים היטב את השרף לפחות 30 דקות לפני הוספת מאיץ DMP 30. הכן וירוס עם דילול מדורג של אתנול.

לאחר מכן מוציאים את הדגימות מהתנור ושוטפים אותן שוב במים מזוקקים כפולים חמש פעמים במשך שלוש דקות כל אחת. בינתיים, לערבב את השרף עם 100% אתנול בשיעור אחד לאחד כדי להשיג את 50% שרף. מערבבים את זה היטב.

לאחר מכן, לייבש את הדגימות בכל דילול של אתנול במשך חמש דקות. זכור שאסור שהדגימות יתייבשו לגמרי. לחדור את הדגימות תחילה ב 50% שרף במשך 30 דקות, הבא ב 100% שרף במשך שעה אחת, ולאחר מכן שוב 100% שרף טרי בן לילה.

למחרת, מניחים את הדגימות ב-100% שרף טריים למשך שעה אחת ואז הטמעו אותן בין יריעות הטמעה פלואורופולימריות. הכן חתיכות של גיליון הטמעה אשר כבר דה משומן עם אתנול ולשים בצד את שקופיות הזכוכית אשר ישמשו כתמיכה. מניחים חתיכת סדין הטמעה על מגלשת זכוכית, מניחים עליה טיפת שרף, ואז מעבירים את הדגימה בזהירות עם השימוש במקל עץ.

כסה אותו עם החתיכה השנייה. נסה להימנע מבועות אוויר. להיות עדין כמו הרקמה היא שבירה מאוד.

מניחים בזהירות עוד מגלשת זכוכית על גבי פיסת גיליון ההטבעה ומרפאים את הדגימה בתנור ב 70 מעלות צלזיוס לפחות 48 שעות. הפרד את השכבות וחתוך חתיכה מהדגימה המוטבעת עם סכין גילוח. תעביר את זה לפרפין.

זה ימזער את הסכנה לאבד את המדגם עקב אלקטרוסטטיק. קח סיכת אלומיניום כי כבר דה משומן עם אתנול. מערבבים היטב אפוקסי מוליך ומשתמשים בכמות קטנה ממנו כדי לעלות על הדגימה על הסיכה.

לרפא אפוקסי מוליך ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. חותכים כל צד של בלוק המדגם עם סכין היהלום ולאחר מכן ללטש את הפנים של הבלוק עד הרקמה נחשפת. קרקע את המדגם לסיכה באמצעות צבע מוליך ולרפא אותו.

כדי למזער את הטעינה, יש להבחין גם בדגימות מצופות בשכבה דקה של זהב או פלדיום זהב. הנח את הסיכה עם הדגימה בתא של מיקרוסקופ אלקטרוני סריקה מבוסס בלוק סדרתי. יישר את המדגם לסכין ולאחר מכן סגור את התא והגדר את הפרמטרים.

אסוף ערימה של תמונות. בשיטה המתוארת הושגו תמונות של רקמת מוח העכבר. התמונה הגדולה של ההיפוקמפוס אזור אחד צולמה והדמיה נקבעה במרכז רדיאטור השכבה.

ערימה של תמונות נרכשה ואובייקטים מעניינים, כגון קוצים דנדריטים וסינפסות, היו מקוטעים. מורפולוגיה של רקמות באיכות טובה הושגה עם ממברנות גלויות בבירור ושלטיות סינפטיות ומיטוכונדריה שמורה היטב. מחקרים אימונופלואורסצנטיים של נוגדן PSD 95 אישרו כי קיבעון ראשוני מתון קיבעון מסורתי עם 4%PFA לתת תוצאות דומות.

הפרוטוקול המוצג מאפשר רכישה של תמונות רקמת המוח באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה סדרתית המבוססת על בלוק, מורפולוגיה של רקמות באיכות גבוהה, ו -12 ממברנות גלויות מקלות על פילוח ושחזור ימניים של 10. הקיבעון העיקרי שלי איפשר להשתמש באותם מוחות לניתוח של PSD 95 אימונופלואורסצנטיות ומיקרוסקופיית אלקטרונים הדמיה דנדריטית. כאן אנו משתמשים PSE 9, 500 ניצנים.

עם זאת, השני יכול לשמש גם כן.