Name: מדידת תחלופת שומנים בממברנה עם ND6 אנלוגי פלואורסצנטי רגיש ל- pH (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: למד שיטת דימות פלואורסצנטי לניטור תנועת שומנים בממברנה בתאים חיים באמצעות חיישן ND6 רגיש ל-pH. שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה של תהליכי אקסוציטוזה ואנדוציטוזה בנוירונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי משרד המחקר והחקירה לתואר ראשון של אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק (M.J.S.), מענק פיילוט של מחלקת הבריאות של פלורידה אד ואתל מור 20A17 (Q.Z.), מענק איגוד האלצהיימר AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.), ומענק NIA R21 AG061656-01A1 (Q.Z).

הפרוטוקול הבא כולל (1) הליך פשוט לביסוס תרביות בהיפוקמפוס ובקליפת המוח של עכברים המבוסס על פרוטוקול מבוסס היטב22, (2) מבוא קצר למערך מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עבור נוירונים חיים, (3) תיאור מפורט של טעינה והדמיה של ND6 בנוירונים של עכברים, (4) דיון על כימות הסחר בממברנות על ידי אות ND6. כל הנהלים עוקבים אחר הנחיות הבטיחות הביולוגית ו- IACUC באוניברסיטת פלורידה אטלנטיק. הסינתזה של ND6 תוארה בעבר20.
1. הכנת תרביות עכבר, היפוקמפוס וקליפת המוח;
הערה: אם לא צוין אחרת, יש לבצע את כל השלבים במכסה מנוע זרימה למינרית ברמת בטיחות ביולוגית 2. לעקר את כל הכלים והחומרים.
<ol><li>השתמש במלקחיים במידה 5 כדי להניח כיסויי זכוכית בצלחות תרבית מרובות. הערה: לדוגמה, צלחת 24 בארות אידיאלית עבור כיסויים של 12 מ"מ <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> .</li>
	<li>הוסף את הנפח המתאים של מטריצות חוץ-תאיות כדי לצפות את פני השטח של תרבית התא (לדוגמה, 75 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת קרום מרתף לכל כיסוי של 12 מ"מ <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> ; ראה טבלת חומרים)</li>
	<li>הניחו את הצלחות המוכנות באינקובטור תרביות הרקמה (5% CO2, 100% לחות ו-37°C) למשך 1-4 שעות כדי לאפשר הצלבה של מטריצת קרום המרתף.</li>
	<li>הקריבו את בעלי החיים, פתחו את הגולגולת והעבירו את המוח כולו לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ עם 3 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) המכילה 20% נסיוב בקר עוברי (H+20). חתכו את המוח לאורך קו האמצע, והפרידו את קליפת המוח ואת ההיפוקמפי במכסה מנוע של דיסקציה של זרימה למינרית כדי להפחית את הזיהום.</li>
	<li>השתמש במספריים כדי לחתוך את הרקמות לחתיכות קטנות (~ 1 מ"מ3). העבר רקמות אלה לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של H+20.</li>
	<li>לשטוף את הרקמות שלוש פעמים עם 5 מ"ל של H + 20 ושלוש פעמים עם 5 מ"ל של HBSS.</li>
	<li>הוסף 1.5 מ"ל של 1% טריפסין עם חומצה טטראצטית אתילאנדיאמין ודגור ב 37 ° C במשך 10 דקות לעיכול אנזים.</li>
	<li>חזור על שלב 1.6 והשתמש בוואקום כדי לשאוף HBSS בסופו של דבר.</li>
	<li>נתק את הרקמות באופן מכני ב- 1 מ"ל HBSS המכיל 2.95 גרם / ליטר MgSO4•7H2O באמצעות פיפטת זכוכית מלוטשת אש.</li>
	<li>צנטריפוגה את תרחיף התא ב 400 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים בנפח מתאים של מצע תרבית כדי לקבל ריכוז של ~10,000,000 תאים / מ"ל.</li>
	<li>צלחת את התאים ב ~ 1,000,000 תאים / ס"מ2 ומניחים את התרבית באינקובטור (5% CO2, 100% לחות, ו 37 ° C) במשך 1-4 שעות כדי להקל על חיבור התא לכיסויי זכוכית.</li>
	<li>הוסף נפח מתאים של מדיום תרבית (למשל, 1 מ"ל לבאר עבור צלחת של 24 בארות). הוסף את אותו נפח של מדיום תרבות לאחר שבוע אחד. לאחר שבועיים, החליפו מחצית ממדיום התרבות הקיים במדיה רעננה מדי שבוע.</li>
</ol>2. מערך מיקרוסקופ להדמיית פלואורסצנטיות של תאים חיים
הערה: מערך הדמיה לדוגמה (איור 5) כולל לפחות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (ראה טבלת חומרים), מקור אור פלואורסצנטי עם תריס אוטומטי, ערכות מסנן פלואורסצנטיות (לדוגמה, עבור הדמיה ND6, השתמש ב- 405/10 BP לעירור, 495 LP עבור דיכרואית ו- 510/20 BP עבור פליטה), ומצלמה בעלת רגישות גבוהה (Table of Materials), שכולם נשלטים על ידי תוכנה לרכישת תמונה (Table of Materials).
<ol><li>הכן תא הדמיה המאפשר בקרת טמפרטורה וקלט/פלט תמיסה להדמיית פלואורסצנטיות של תאים חיים. הערה: לדוגמה, בפרוטוקול זה נעשה שימוש בתא הדמיה מותאם לאמבטיה פתוחה המקובע על פלטפורמת חימום (איור 6).</li>
	<li>הגדר התקן ניתן לתכנות כדי להחליף את פתרונות הזילוח ולספק את הגירוי החשמלי בנקודות זמן מוגדרות במהלך ההדמיה. הערה: סנכרון חומרה ותוכנה נחוץ לניתוחים כמותיים (איור 7). לדוגמה, בפרוטוקול זה, פלט טריגר ממצלמת ההדמיה שימש להפעלת תוכנית מחשב השולטת במכשיר מתג אוטומטי, השולט במערכת זילוח רב ערוצית ובמגרה דופק מרובע.</li>
	<li>כדי לצלם במשותף שני כתבים פלואורסצנטיים או יותר, בצע הדמיה פלואורסצנטית רב-ערוצית על-ידי החלפת מערכות מסננים ברצף או על-ידי פיצול בו-זמני של פליטות פלואורסצנטיות שונות והקרנה לאותה מצלמה.</li>
</ol>3. טעינה והדמיה ND6 בתרביות עצביות
<ol><li>לשקול כמות מתאימה של ND6, להמיס אותו dimethylsulfoxide (DMSO), ולאפשר לו להמיס בטמפרטורת החדר; סוניק לזמן קצר (למשל, 3 דקות). סנן את תמיסת המלאי הגולמי באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים גדולים של צבע. לאחר הסינון, קבע את ריכוז הצבע על ידי ספקטרוסקופיית בליעה ב 405 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר קונבנציונלי או מיקרו-נפח באמצעות ε = 10,700 M-1 cm-1.</li>
	<li>לפני היישום, לדלל את תמיסת המלאי לריכוז של 1 מיקרומטר באמצעות תמיסת האמבטיה. שמור את תמיסת המלאי בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>תיוג אנדוזומים ושלפוחיות סינפטיות<ol><li>כדי לתייג בכל מקום תאי ממברנה אנדוציטוזיים כגון אנדוזומים, יש להוסיף תמיסת מלאי ND6 (למשל, 1 מילימטר ב-DMSO) למדיום התרבית בריכוז הסופי של 1 מיקרומטר, ולדגור ב-5%CO2, 100% לחות ו-37°C למשך 30 דקות. כדי להפחית את היקף התיוג SV, לדכא את הפעילות העצבית הספונטנית מבחינה פרמקולוגית. לדוגמה, השתמש בטטרודוטוקסין כדי לחסום פוטנציאלי פעולה או 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]quinoxaline-7-sulfonamide (NBQX) ו-D-(-)-2-amino-5-phosphonopentanoic acid (D-AP5) כדי לעכב שידור מעורר23.</li>
		<li>כדי לתייג באופן סלקטיבי SVs, השתמש בגירוי קצר אך חזק כדי לעורר exo-/endocytosis presynaptic. ראשית, העבירו את כיסויי התרבית לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> המכילה 2 מ"ל של תמיסה רגילה של טירוד בטמפרטורת החדר. שנית, לדלל את תמיסת מלאי ND6 בתמיסת High-K+ Tyrode (90 mM KCl) בריכוז הסופי של 1 μM. שלישית, החליפו את תמיסת הטירוד הרגילה בצלחת הפטרי בתמיסת טירוד High-K+ המכילה ND6 ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>העבירו את תרבית התאים המסומנת ב-ND6 לתא הדמיה מלא בתמיסת Tyrode רגילה שחוממה מראש ומכילה 10 μM NBQX ו-10 μM D-AP5.</li>
	<li>כוונן את מהירות הזילוח ל~0.2 מ"ל/שנייה (כלומר, טיפה אחת לשנייה) והתחל את הזילוח של תמיסת Tyrode נורמלית שחוממה מראש המכילה NBQX ו-D-AP5 כדי להסיר ND6 מוגזם בתרבית.</li>
	<li>כוונן את המיקוד ואתר את שדה הראייה המתאים המכיל נוירונים בריאים ומפוזרים היטב הנושאים נוירונים מחוברים. הימנעו מאזורים המכילים קולואידים של צבע לא פתור.</li>
	<li>נסה לבצע הדמיה של תאים טעוני ND6 עם זמני חשיפה שונים כדי לזהות את הגדרות ההדמיה הטובות ביותר. הערה: לקבלת זמן החשיפה הטוב ביותר, עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר של פיקסלים בתמונה המתקבלת היא כמחצית מטווח הסיביות (לדוגמה, עבור תמונה של 16 סיביות, טווח הסיביות הוא בין 0 ל- 65,535), מה שיאפשר עלייה נוספת בפלואורסצנטיות בעת יישום תמיסת האמבטיה החומצית. יש להשתמש בזמן החשיפה שנבחר עבור כל הדמיית ND6.</li>
	<li>הגדר את פרוטוקול הגירוי והזילוח, מרווח המסגרות ומשך הזמן הכולל. לדוגמה, בפרוטוקול הבא, השתמש בקו בסיס של 30 שניות, גירוי שדה חשמלי של 10 s 30 Hz, התאוששות של 50 שניות, 120 s 90 mM K+, שחזור של 60 שניות, פתרון של 60 s Tyrode עם 50-mM NH4Cl, 60 s הפתרון של Tyrode ב- pH 5.5, ומרווח מסגרת של 3 שניות.</li>
	<li>התחל את רכישת התמונה מלווה בגירוי וזילוח מסונכרנים. עקוב אחר הסימולציה והחלפת הפתרונות במהלך ההדמיה.</li>
	<li>הפסק את הזילוח לאחר סיום ההדמיה, הסר את הכיסוי ונקה את תא ההדמיה לקראת הניסוי הבא.</li>
</ol>4. כימות הסחר בממברנות על ידי שינוי בפלואורסצנטיות ND6
<ol><li>גבה ו/או צור עותק אלקטרוני של כל קובצי התמונה.</li>
	<li>בחר תוכנית ניתוח לחילוץ נתונים, לדוגמה, תוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח כגון ImageJ24 ו / או FIJI25.</li>
	<li>פתח או ייבא אוסף תמונות לתוכנית הניתוח.</li>
	<li>הגדר את התמונה הראשונה כהפניה ויישר אליה את השאר באמצעות פונקציות/תוספים כגון רישום קשיח26, אשר יקטין את הממצאים עקב היסחפות xy. עיין באיור 8 לדוגמה תמונות.</li>
	<li>ממוצע כל התמונות שנרכשו במהלך 30 שנות הטרום בסיס כדי להפיק תמונת התייחסות. שמור עותק של תמונה זו לעיון עתידי.</li>
	<li>קבעו את סף העוצמה ליצירת תמונה בינארית מהתמונה עם ממוצע קווי הבסיס.</li>
	<li>השתמש בקו פרשת המים ב- ImageJ או בפונקציות דומות בתוכנית אחרת כדי להפריד נוירונים או תאים מחברים.</li>
	<li>השתמש בפונקציה Analyze Particle עם גודל שטח ומעגליות מתאימים כדי לבקש אזורי עניין (ROIs) המתאימים לקרומי תאים, אנדוזומים, ליזוזומים או בוטונים סינפטיים. שמור את כל החזר ההשקעה שנבחר.</li>
	<li>בחר ארבעה החזר השקעה ברקע באזורים נטולי תאים בשדה הראייה.</li>
	<li>מדוד את עוצמות הפיקסלים הממוצעות עבור כל החזר השקעה בכל מסגרת באוסף התמונות, וייצא את התוצאות לניתוח סטטיסטי.</li>
	<li>חשב את העוצמה הממוצעת של החזר ההשקעה ברקע כרעש הבסיסי, אשר יופחת מעוצמות הפיקסלים הממוצעות עבור כל החזר השקעה.</li>
	<li>ממוצע שלוש העוצמות הממוצעות הגבוהות ביותר עבור כל ROI שנבחר במהלך היישום של פתרון pH 5.5 Tyrode כדי להשיג את עוצמת הפלואורסצנטיות המקסימלית, המוגדרת כ -100% לנורמליזציה.</li>
	<li>ממוצע שלוש העוצמות הממוצעות הנמוכות ביותר עבור כל החזר השקעה שנבחר במהלך היישום של 50 mM NH4Cl כדי להגדיר את עוצמת הפלואורסצנטיות המינימלית, המוגדרת כ- 0% לנורמליזציה.</li>
	<li>חשב את השינויים הפלואורסצנטיים היחסיים עבור כל החזר השקעה בהתבסס על העוצמות של 0% ו- 100% שלו. להפיק שינויים פלואורסצנטיים ממוצעים, קינטיקה של שינויים וערכים/מגרשים אחרים מנתוני ROI בודדים.</li>
</ol>

<ol><li>Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytosis and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).</li>
<li>Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+membranes+and+beta-amyloid%3A+a+harmful+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Pept+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection.</a> Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).</li>
<li>Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis%3A+proteins+and+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Exocytosis: proteins and perturbations.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 659-701 (1996).</li>
<li>Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+in+regulated+exocytosis%3A+what+are+they+doing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Lipids in regulated exocytosis: what are they doing.</a> Frontiers in Endocrinology. 4, 125(2013).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112 (4), 519-533 (2003).</li>
<li>Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+cellular+membranes%3A+a+convergence+with+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386(2017).</li>
<li>Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+pHluorin+for+quantitative%2C+kinetic+and+high-throughput+analysis+of+endocytosis+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587(2016).</li>
<li>Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+vesicle+cycling+in+presynaptic+terminals+using+the+genetically+encoded+probe+synaptopHluorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li>
<li>Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+biophysical+properties+of+lipid+membranes+by+environment-sensitive+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes.</a> Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).</li>
<li>Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+vesicle+recycling+by+staining+and+destaining+vesicles+with+FM+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).</li>
<li>Gaus, K., Zech, T., Harder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+membrane+microdomains+by+Laurdan+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy.</a> Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).</li>
<li>Kahms, M., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+pH-sensitive+lipid+based+exo-endocytosis+tracers+reveal+fast+intermixing+of+synaptic+vesicle+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18(2018).</li>
<li>Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+of+molecular+probes+based+on+the+fluorophore+4-amino-1%2C8-naphthalimide%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Chemical+Letters%22%5BJournal%5D)">New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide.</a> Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).</li>
<li>Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((l%2C8-Naphthalimide+based+DNA+intercalators+and+anticancer+agents.+A+systematic+review+from+2007+to+2017%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).</li>
<li>Ulla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+emitting+1%2C8-naphthalimides+with+electron+transport+properties+for+organic+light+emitting+diode+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications.</a> Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).</li>
<li>Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+and+fluorescent+anion+sensors%3A+An+overview+of+recent+developments+in+the+use+of+1%2C8-naphthalimide-based+chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors.</a> Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).</li>
<li>Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+intramolecular+charge+transfer+%28ICT%29+process+in+push-pull+systems%3A+Effect+of+nitro+groups%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups.</a> RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvatochromic+and+pH-sensitive+fluorescent+membrane+probes+for+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells.</a> ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).</li>
<li>Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+breadth+of+4-amino-1%2C8-naphthalimide+photophysical+properties+through+substitution+of+the+naphthalimide+core%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+-+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core.</a> Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).</li>
<li>Liu, G. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+synaptic+transmission+at+single+hippocampal+synaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons.</a> Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).</li>
<li>Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+provide+an+optical+signal+specific+to+full+collapse+fusion+of+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 509-547 (2004).</li>
<li>Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonium+chloride+alters+neuronal+excitability+and+synaptic+vesicle+release%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5061(2017).</li>
<li>Wilhelm, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).</li>
<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (1), 57-69 (2005).</li>
<li>DelBove, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+modulation+between+amyloid+precursor+protein+and+synaptic+membrane+cholesterol+revealed+by+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging.</a> Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).</li>
<li>Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+sterols+are+essential+for+synaptic+vesicle+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling.</a> Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).</li>
<li>Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%3A+New+insights+into+the+modes+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).</li>
<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200(1992).</li>
<li>Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis-endocytosis+with+pH-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

צבעים מבוססי ליפידים, כגון 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine (DiI) ו- 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), שימשו זה מכבר להמחשת מורפולוגיה של תאים ולמעקב אחר תהליכים תאיים כגון תחזיות אקסונים של נוירונים. צבעי סטיריל, כגון FM1-43, הומצאו ושימשו בהצלחה לחקר אקסוציטוזה34. בשל הזיקה הנמוכה שלהם לממברנה, הם מתייגים באופן סלקטיבי בועיות אנדוציטוזיות שבהן הן לכודות בעוד שהצבעים שנותרו על קרום הפלזמה נשטפים על ידי זילוח קבוע. ככאלה, צבעי סטיריל אינם מתאימים לניטור רציף ...

דו-שכבת השומנים היא אחת ממכלולי הביומולקולות הנפוצות ביותר והיא הכרחית לכל התאים. מחוץ לתאים, הוא יוצר את תאי התממשקות קרום הפלזמה ואת סביבתם; בתוך התאים, הוא ממדר אברונים שונים המתמחים בפונקציות ייעודיות. באופן דינמי יותר מאשר דומם, קרומי השומנים חווים כל הזמן איחוי וביקוע, המתווכים את שינוע החומרים הביולוגיים, רפורמת אברונים, שינוי מורפולוגיה ותקשורת תאית. אין ספק, קרום השומנים הוא הבסיס הפיזי כמעט לכל התהליכים התאיים, ותפקוד לקוי שלו משחק תפקיד מכריע בהפרעות שונות, החל מסרטן1 ועד מחלת אלצהיימר2. למרות שמולקולות שומנים הן הרבה פחות מגוונות מחלבונים, מחקר הממברנות עד כה היה בעיקר ממוקד חלבון. לדוגמה, הרבה יותר ידוע על מכונות חלבון מאשר על שומנים באקסוציטוזה 3,4,5. יתר על כן, הארגון, הפיזור, הדינמיקה וההומאוסטזיס של ליפידים על פני השטח ועל פני השטח של הממברנות התוך-תאיות נותרו במידה רבה בלתי נחקרים בהשוואה לחלבוני ממברנה6.
זה לא מפתיע מכיוון שטכניקות מודרניות של ביולוגיה מולקולרית, כגון מוטגנזה, מספקות יתרון מתודולוגי לחקר חלבונים ולא ליפידים. לדוגמה, תיוג מהונדס של חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל- pH רגיש ל- pHluorin לחלבוני שלפוחית מאפשר מדידה כמותית של כמות וקצב תחלופת חלבון שלפוחית במהלך exo-/אנדוציטוזה 7,8,9. עם זאת, זה כמעט בלתי אפשרי לשנות גנטית שומנים בקרום in vivo. יתר על כן, מניפולציות איכותיות ואפילו כמותיות של כמויות חלבון והתפלגויות הם הרבה יותר ריאלי מאלה של שומנים10. עם זאת, שומנים פלואורסצנטיים מקומיים וסינתטיים בודדו ופותחו כדי לדמות שומנים אנדוגניים בממברנה במבחנה ו-in vivo11. קבוצה אחת של שומנים פלואורסצנטיים בשימוש נרחב הם צבעי סטיריל, למשל FM1-43, המציגים פלואורסצנטיות משופרת בקרום ומהווים כלי רב עוצמה בחקר שחרור שלפוחית סינפטית (SV) בתאי עצב12. לאחרונה, צבעי שומנים רגישים לסביבה הומצאו ונעשה בהם שימוש נרחב כסוג חדש של כתבים לחקר תכונות שונות של קרום התא, כולל פוטנציאל קרום11, סדר שלב13 והפרשת14.
סוג חדש של מימטי שומנים שהפלואורסצנטיות שלהם רגישה גם ל-pH (למשל, pHluorin) וגם לקרום (למשל, FM1-43) פותחה כדי למדוד ישירות את התפלגות השומנים בקרום הפלזמה ובאנדוזומים/ליזוזומים ואת תנועת השומנים במהלך אקסו/אנדוציטוזה. הפלואורופורים הסולבטוכרומיים הידועים בעלי תכונות דחיפה-משיכה עקב העברת מטען תוך-מולקולרית נבחרו למטרה זו. מבין הפלואורופורים הסולבטוכרומיים הקיימים, פיגום 1,8-נפתלימיד (ND) קל יחסית לשינוי, רב-תכליתי לתיוג, והוא ייחודי בפוטו-פיזיקה15 ולכן שימש באינטרקלטורים של דנ"א, דיודות פולטות אור אורגניות וחיישני ביומולקולות 16,17,18.
הצמדת קבוצה תורמת אלקטרונים למיקום C4 של פיגום ND יוצרת מבנה דחיפה-משיכה, המוביל למומנט דיפול מוגבר על ידי חלוקה מחדש של צפיפות האלקטרונים במצב מעורר19,20. העברת מטען תוך-מולקולרית כזו מייצרת תפוקות קוונטיות גדולות ותזוזות סטוקס, והתוצאה היא פלואורסצנטיות בהירה ויציבה21. קבוצה זו פיתחה לאחרונה סדרה של אנלוגים שומנים solvatochromic המבוססים על פיגום ND והשיגה אותם עם תשואות סינתטיות טובות20.
אפיון ספקטרוסקופי מראה שבין המוצרים האלה, ND6 הוא בעל התכונות הפלואורסצנטיות הטובות ביותר (איור 1)20. ראשית, יש לו שיאי עירור ופליטה מופרדים היטב (כלומר, ~400 ננומטר ו~520 ננומטר, בהתאמה, באיור 2A,B) בהשוואה לפלואורופורים פופולריים כמו פלואורסצאין איזותיוציאנט, רודמין או GFP, מה שהופך אותו לניתן להפרדה ספקטרלית מהם ולכן שימושי להדמיה מרובת צבעים. שנית, פלואורסצנטיות ND6 מציגה עלייה של יותר מפי שמונה בפלואורסצנטיות שלה בנוכחות מיצלות (איור 2C), מה שמרמז על תלות חזקה בקרום. מחקרי הדמיה פלואורסצנטיים קודמים של תאים חיים עם סוגים שונים של תאים הראו צביעת קרום מעולה על ידי ND620. שלישית, כאשר רמת החומציות של התמיסה יורדת מ-7.5 (נמצא בדרך כלל בסביבות חוץ-תאיות או ציטוסוליות) ל-5.5 (נמצא בדרך כלל באנדוזומים וליזוזומים), ND6 מראה עלייה של בערך פי 2 בפלואורסצנטיות (איור 2D), מה שמראה את רגישות ה-pH שלה. יתר על כן, סימולציה של דינמיקה מולקולרית מצביעה על כך ש-ND6 משתלב בקלות בדו-שכבה השומנית כאשר פיגום ה-ND שלו פונה החוצה מהממברנה ושאריות פיפרזין ומראה אינטראקציות חזקות עם קבוצות ראשי פוספוליפידים (איור 3). בסך הכל, תכונות אלה הופכות את ND6 לאנלוגי שומנים פלואורסצנטי אידיאלי כדי להמחיש ולמדוד את תחלופת השומנים בקרום במהלך אקסו/אנדוציטוזה.
מאמר זה מציג שיטה לחקר קצב התחלופה והדינמיקה של שומנים SV באמצעות תאי עצב בהיפוקמפוס של עכבר בתרבית. על-ידי גירוי תאי עצב עם תמיסות K+ Tyrode גבוהות, SVs וקרום הפלזמה הועמסו ב-ND6 (איור 4A,B). לאחר מכן, תאי עצב עוררו מחדש עם גירויים שונים, ואחריהם תמיסות של NH4Cl ו-pH 5.5 Tyrode (איור 4D). פרוטוקול זה מאפשר מדידה כמותית של שיעורי האקסוציטוזה והאנדוציטוזה המורכבים בנסיבות שונות (איור 4C).

<table><tbody><tr><td>Digidata 1440A מערכת רכישת נתונים</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Digidata 1440A</td><td>לגירוי מסונכרנים והחלפת פתרונות</td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה דו-ערוצי</td>, <td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td>להדמיית תאים חיים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>OMEGA Scientific</td><td>FB-01</td><td>להכנת תמיסת H+20 המשמשת בדיסקציה ותרבית רקמות</td></tr><tr><td>Hamamatsu Flash4.0 sCOMS מצלמה</td><td>Hamamatsu Inc.</td><td>C13440-20CU</td><td>מצלמה בעלת רגישות גבוהה</td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td>להכנת תמיסת H+20 המשמשת בדיסקציה ותרבית רקמות</td></tr><tr><td>פלטפורמה מחוממת</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>PH-1</td><td>להדמיית תאים חיים</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>לתרבית רקמות</td></tr><tr><td>טבלת בידוד רטט Micro-G</td><td>TMC</td><td>63-564</td><td>להדמיית תאים חיים</td></tr><tr><td>מיקרו מנהל</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>NA</td><td>לבקרת רכישת תמונה</td></tr><tr><td>Multi-Line In-Line פתרון מחמם</td><td>Warner Instruments</td><td>SHM-6</td><td>להדמיית תאים חיים</td></tr><tr><td>Neurobasal Plus בינוני</td><td>THermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>לתרבית רקמות</td></tr><tr><td>Nikon Ti-E מיקרוסקופ הפוך Nikon</td><td></td><td>Ti-E / B</td><td>להדמיית תאים חיים</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 מצלמת CMOS דיגיטלית</td><td>Hamamatsu</td><td>C1340-20CU</td><td>להדמיית תאים חיים</td></tr><tr><td>תא זלוף תא</td><td>וורנר מכשירים</td><td>RC-26G</td><td>להדמיית תאים חיים</td></tr><tr><td>מערכת בקרת שסתום שישה ערוצים</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6</td><td>להחלפת פתרון</td></tr><tr><td>ממריץ דופק מרובע</td><td>מכשיר דשא</td><td>SD9</td><td>לגירוי שדה חשמלי</td></tr></tbody></table>

מדידת תחלופת שומנים בממברנה עם nd6 אנלוגי פלואורסצנטי רגיש ל- ph

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

אקסו/אנדוציטוזה הוא תהליך נפוץ המתווך חילופי ביומולקולות בין תאים לסביבתם ובין תאים שונים. תאים מתמחים משתמשים בתהליך זה כדי לבצע תפקודי גוף חיוניים כגון הפרשת אינסולין מתאי β ושחרור מוליכים עצביים מסינפסות כימיות. בשל חשיבותו הפיזיולוגית, אקסו/אנדוציטוזה היה אחד הנושאים הנחקרים ביותר בביולוגיה של התא. כלים רבים פותחו כדי לחקור את התהליך הזה ברמת הגן והחלבון, שבגללם ידוע רבות על מנגנון החלבונים המשתתפים בתהליך זה. עם זאת, מעט מאוד שיטות פותחו כדי למדוד את תחלופת השומנים בממברנה, שהיא הבסיס הפיזי של אקסו / אנדוציטוזה.
מאמר זה מציג סוג של אנלוגים חדשים של שומנים פלואורסצנטיים המציגים פלואורסצנטיות תלוית pH ומדגים את השימוש בהם כדי לעקוב אחר מחזור שומנים בין קרום הפלזמה לבין שלפוחיות ההפרשה. בעזרת מניפולציות pH פשוטות, אנלוגים אלה מאפשרים גם לכמת את התפלגות השומנים על פני השטח ואת תאי הממברנה התאיים, כמו גם את מדידת קצב תחלופת השומנים במהלך exo-/ אנדוציטוזה. כתבי שומנים חדשים אלה יהיו בעלי עניין רב בתחומי מחקר ביולוגיים שונים כגון ביולוגיה של התא ומדעי המוח.

SVs מתמחים בשחרור נוירוטרנסמיטרים באמצעות exo-/endocytosis27 מעורר. ל-SVs יש לומן חומצי מאוד (כלומר, pH 5.5), שהוא אידיאלי עבור ND6. השתמשנו בגירוי K+ גבוה כדי לעורר SV exo-/אנדוציטוזה כדי לאפשר ל-ND6 לגשת ל-SV. כצפוי, פונקטה פלואורסצנטית ירוקה בהירה לאורך תהליכים עצביים הופיעה לאחר העמסה (איור 9A). פרופיל הקו המוצג באיור 4B הדגים חפיפה חזקה בין ND6 (עקומה ירוקה) לבין FM4-64 puncta (עקומה אדומה). המתאם החזק בין עוצמות פלואורסצנטיות של ND6 ו...

פרוטוקול זה מציג שיטת הדמיה פלואורסצנטית המשתמשת במחלקה של פלואורופורים ליפידים רגישים ל- pH כדי לעקוב אחר תנועת קרום השומנים במהלך אקסוציטוזה של התא ומחזור האנדוציטוזה.

מדידת תחלופת שומנים בממברנה עם ND6 אנלוגי פלואורסצנטי רגיש ל- pH

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

פרוטוקול זה מתאר אפיון ויישום של בדיקה חדשה של שומנים פלואורסצנטיים רגישים ל- pH, ספציפית לקרומי התא, המאפשרת לחוקרים לנטר אקסו ואנדוציטוזה בתאים חיים. רוב הכתבים הקודמים דיברו על חלבון ממברנה המבוסס על חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל-pH, שהוא עקיף. כחיקוי שומנים, ND6 משתלב בקרום התא, ובכך מדווח נאמנה על סחר בקרום השומנים.גשושית ND6 הופכת לפלואורסצנטית רק אם היא מוטמעת בסביבת הממברנה הביולוגית. עוצמת הפלואורסצנטיות של בדיקה זו מתואמת עם פרוטונציה ודה-פרוטונציה של קבוצת ראשי הפיפרזין. לכן, זה fluoresces הרבה יותר חזק ב pH נמוך יותר.אקסוציטוזה ואנדוציטוזה הם תהליכים הנמצאים בכל מקום בבסיס ההפרשה והספיגה של מולקולות איתות רבות. לכן, ND6 יכול לשמש לחקר כמה שאלות בסיסיות בביולוגיה של התא ובמדעים הביו-רפואיים. מי שידגימו את ההליך יהיו היילי, אוליבר וג'ונתן, סטודנטים מהמעבדה שלי.התחל בהכנת תא הדמיה המאפשר בקרת טמפרטורה ופלט קלט פתרון להדמיית פלואורסצנטיות של תאים חיים. הגדר התקן ניתן לתכנות כדי להחליף את פתרונות הזילוח ולספק את הגירוי החשמלי בנקודות זמן מוגדרות במהלך ההדמיה. שקלו כמות מתאימה של ND6.ממיסים אותו בדימתיל סולפוקסיד, ומאפשרים לו להתסיס בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הפעל את הפתרון בקצרה. סנן את תמיסת המלאי הגולמי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים גדולים של צבע.באמצעות ספקטרופוטומטר נפח קונבנציונלי או מיקרו, לקבוע את ריכוז הצבע ב 405 ננומטר. לפני היישום, לדלל את תמיסת המלאי לריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר באמצעות תמיסת האמבטיה. שמור את תמיסת המלאי בטמפרטורת החדר בחושך.הוסף תמיסת מלאי ND6 למדיום התרבית בריכוז הסופי של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר ודגר עליה כדי לסמן בכל מקום תאי קרום אנדוציטוזי, כגון אנדוזומים. כדי להפחית את היקף תיוג שלפוחיות סינפטיות, לדכא את הפעילות העצבית הספונטנית מבחינה פרמקולוגית. לאחר תיוג סלקטיבי של שלפוחיות סינפטיות כמתואר בכתב היד, יש להרכיב את פתק הכיסוי המכיל תאים בתא ההדמיה.חבר את חיישן הטמפרטורה, קלט הזילוח וקצה הוואקום לתא ההדמיה. כוונן את מהירות הזילוח לכ-0.2 מיליליטר לשנייה והתחל את הזילוח של תמיסת טירודה רגילה שחוממה מראש המכילה NBQX ו-DAP5 כדי להסיר ND6 מוגזם בתרבית. כוונן את המיקוד ואתר את שדה הראייה המתאים המכיל נוירונים בריאים ומפוזרים היטב הנושאים נוירונים מחוברים.הימנעות מאזורים המכילים דיקולואידים לא פתורים. נסה הדמיה של תאים טעונים ND6 עם זמני חשיפה שונים כדי לזהות את הגדרות ההדמיה הטובות ביותר. הגדר את פרוטוקול הגירוי והזילוח, מרווח המסגרות ומשך הזמן הכולל באמצעות המידע בכתב היד של הטקסט.התחל את רכישת התמונה מלווה גירוי וזילוח מסונכרנים. עקוב אחר הגירוי והחלפת התמיסה במהלך ההדמיה. יש להפסיק את הזילוח לאחר סיום ההדמיה.הסר את החלקת הכיסוי ונקה את תא ההדמיה לקראת גירסת הניסיון הבאה. גבה וצור עותק אלקטרוני של כל קובצי התמונה. בחר ופתח את תוכנית הניתוח לחילוץ נתונים.פתח או ייבא אוסף תמונות לתוכנית הניתוח. לאחר יצירת מסיכה בינארית, השתמש בפונקציית ניתוח החלקיקים עם גודל השטח והמעגליות המתאימים כדי לבקש אזורי עניין, או ROIs, המתאימים לקרום התא, אנדוזומים, ליזוזומים או בוטונים סינפטיים. בחר ארבעה החזר השקעה ברקע באזורים נטולי תאים בשדה הראייה.לאחר מכן שמור את כל החזר ההשקעה שנבחר. יישרו את כל המסגרות באוספי התמונות של ND6 עם קיטועי זמן. הגדר את התמונה הראשונה כהפניה ויישר אליה את השאר באמצעות רישום קשיח, אשר יקטין לכלוכים עקב נדידת XY.לאחר מכן שמרו את אוספי התמונות המיושרים. החל את החזר ההשקעה שנשמר על אוספי תמונות ND6 מיושרים. מדוד את עוצמות הפיקסלים הממוצעות של פלואורסצנטיות ND6 עבור כל החזר השקעה בכל מסגרת בערימת התמונות.לאחר מכן יצא את התוצאות לניתוח סטטיסטי. חשב את העוצמה הממוצעת של החזר ההשקעה ברקע כדי לקבל את רעש קו הבסיס, שיופחת מכל החזר ההשקעה שנבחר. ממוצע שלוש העוצמות הממוצעות הגבוהות ביותר עבור כל ROI שנבחר במהלך היישום של פתרון pH 5.5 tyrode כדי להשיג את עוצמת הפלואורסצנטיות המקסימלית, המוגדרת כ- 100% לנורמליזציה.ממוצע שלוש העוצמות הממוצעות הנמוכות ביותר עבור כל החזר השקעה שנבחר במהלך היישום של 50 מילימולר אמוניום כלורי כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות המינימלית, המוגדרת כ- 0% לנורמליזציה. חשב את השינויים הפלואורסצנטיים היחסיים עבור כל החזר השקעה בהתבסס על העוצמות של 0% ו- 100% שלו. להפיק שינויים פלואורסצנטיים ממוצעים, קינטיקה של שינויים וערכים או תרשימים אחרים מנתוני ROI בודדים.פונקטה פלואורסצנטית ירוקה בהירה לאורך התהליכים העצביים נראתה לאחר טעינת תאי העצב עם ND6. מתאם חזק בין עוצמות פלואורסצנטיות של ND6 ו-FM464 הצביע גם על צביעת שלפוחית סינפטית על ידי ND6. נצפתה ירידה בפלואורסצנטיות ND6 בתגובה הן לגירוי חשמלי והן לגירוי אשלגן גבוה, מה שמרמז על כך ש-ND6 שוכן בקרום השלפוחית הסינפטית וכי לומן השלפוחית הסינפטי מנוטרל במהלך השחרור.תחת גירוי חשמלי ממצה, הטיפול ב- M beta CD הפחית באופן משמעותי את שחרור השלפוחית הסינפטית ושליפתה שנמדדו על ידי הדמיית ND, אשר הצביעה על כך שכולסטרול הממברנה מאפשר אקסוציטוזה של שלפוחית סינפטית ואנדוציטוזה. Baf A1 מנע התאוששות פלואורסצנטית של ND6 לאחר גירוי על ידי חסימה חריפה של החמצה מחדש של שלפוחיות סינפטיות שהוחזרו. הבנה בסיסית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי היא חובה.תכנון קפדני של מצבים פיזיולוגיים לתמיכה בדימות תאים חיים הוא חשוב מאוד. חשוב לקבוע במדויק את ריכוז תמיסת מלאי ND. במידת האפשר, מדדו מחדש את ריכוז תמיסת המלאי לפני כל שימוש.אנא הרחיקו אותו מאור שמש ישיר כדי למנוע הלבנת תמונות ופירוק בדיקות.

measuring-membrane-lipid-turnover-with-ph-sensitive-fluorescent-lipid

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנחנו מציגים את assay מהיר הקרינה מבוססי המנטרת את קצב מרווה פלואורסצנציה כמדד לפעילות ערוץ gramicidin. ערוצי gramicidin משמשים מתמרים כוח מולקולרית כדי לעקוב אחר שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש.

Gramicidin מבוססי Assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים

השימוש בפלואורופורים להדמיה in vivo יכול להיות מוגבל מאוד על ידי אופסוניזציה, פינוי מהיר, רגישות זיהוי נמוכה והשפעות ציטוטוקסיות על המארח. אנקפסולציה של פלואורופורים בליפוזומים על ידי הידרציה ואקסטרוזיה מובילה לכיבוי והגנה פלואורסצנטיים המאפשרים הדמיה in vivo עם רגישות גילוי גבוהה.

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל In vivo דימות אופטי

אנו מציגים טכניקה חדשה למדידת הדיפוזיה הרוחבית של מין פעיל על פני השטח בממשק נוזל-נוזל על ידי מיזוג חד-שכבת טיפה על חד-שכבה שטוחה.

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

אנו מתארים בדיקה מבוססת פלואורסצנטית למדידת ערבול פוספוליפידים בליפוזומים חד-צדדיים גדולים שהורכבו מחדש עם אופסין.

Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase

פרוטוקול זה מציג שיטה למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד לקולטנים בזמן אמת בסביבה תאית. הקישור נמדד כהעברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) בין נגזרות נוקלאוטידים של טריניטרופניל לבין חלבון המסומן בחומצת אמינו פלואורסצנטית לא קנוני.

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

בדיקת דליפת הפלואורסצנטיות היא שיטה פשוטה המאפשרת לחקור אינטראקציות פפטיד/ממברנה על מנת להבין את מעורבותם במספר תהליכים ביולוגיים ובמיוחד את היכולת של פפטידים חודרי תאים להפריע לפולניידים דו-שכבתיים במהלך תהליך טרנסלוקציה תאית ישירה.

דליפת פלואורסצנטית אסאי לחקור את היציבות בקרום על ידי פפטיד חודר תאים

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות חיישני שומנים פלואורסצנטיים וליפוזומים כדי לקבוע אם חלבון מחלץ ומעביר פוספטידילסרין או פוספטידילינוזיטול 4-פוספט במבחנה.

מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

פרוטוקול זה מציג את השימוש בסביבת דגימה של זרימה עצורה כדי לערבב במהירות תמיסות נוזליות מרובות באתרן במהלך מדידת פיזור נייטרונים בזווית קטנה וללמוד תהליכים קינטיים בסקאלות אורך ננומטריות ובסקאלות זמן שניות.

מדידת התפתחות הזמן של חומרים ננומטריים באמצעות זרימה עצורה ופיזור נייטרונים בזווית קטנה

ליפופגיה היא צורה סלקטיבית של אוטופגיה הכוללת פירוק של טיפות שומנים. תפקוד לקוי בתהליך זה קשור להתפתחות סרטן. עם זאת, המנגנונים המדויקים עדיין לא מובנים במלואם. פרוטוקול זה מתאר גישות הדמיה כמותית כדי להבין טוב יותר את יחסי הגומלין בין אוטופגיה, מטבוליזם של שומנים והתקדמות סרטן.

חקר הוויסות של קטבוליזם טיפות שומנים באמצעות ליפופגיה

אנו מתארים שיטה לשימוש בציקלודקסטרין כדי לתווך חילופי שומנים של קרום הפלזמה עם ליפידים אקסוגניים. ניתן לשלב טכניקה זו עם ניסויים החוקרים חלבונים טרנסממברניים, המתנהגים באופן שונה בסביבות דמויות רפסודת שומנים מאשר בסביבות שאינן דמויות רפסודה.

בדיקת חילופי שומנים בתאים חיים

פרוטוקול זה מפרט בדיקת מבחנה למדידת ספיגת שומנים תאיים בתאי אנדותל בעת גירוי עם אנלוגים פלואורסצנטיים BODIPY-C12 ו-BODIPY-C16 של חומצות שומן רוויות ארוכות שרשרת וארוכות שרשרת מאוד. שיטה זו יעילה וניתנת להתאמה לסוגי תאים אחרים, ומציעה גישה שימושית לחקר חילוף החומרים של השומנים.

כימות ספיגת חומצות שומן אנדותל באמצעות אנלוגים של חומצות שומן פלואורסצנטיות

למד שיטת דימות פלואורסצנטי לניטור תנועת שומנים בממברנה בתאים חיים באמצעות חיישן ND6 רגיש ל-pH. שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה של תהליכי אקסוציטוזה ואנדוציטוזה בנוירונים.

מדידת תחלופת שומנים בממברנה עם ND6 אנלוגי פלואורסצנטי רגיש ל- pH

גלה סרטונים נוספים