בידוד של תמצית גרעינית פעילה של Caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד תמצית גרעינית פעילה משלב זחל 4 C. elegans והדמיה של פעילות שעתוק במערכת במבחנה .

פרוטוקול זה ממלא פער טכני למחקר הביוכימי של C.elegans ומרחיב את התועלת שלהם כאורגניזם מודל. טכניקה זו היא פשוטה וחזקה, ומאפשרת בידוד עקבי של תמצית גרעינית C.elegans פעילה מבחינה תפקודית. התחל על ידי הצבת בעלי החיים L1 מסונכרנים על 10 150 מ"מ נמטודה צמיחה צלחות המכילות מדיה זרעים עם Escherichia coli OP50, ולאפשר לבעלי החיים לגדול במשך 48 שעות ב 20 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לשלב L4.

ברגע המאגרים ההיפוטוניים וההיפרטוניים מוכנים, לנקות את homogenizer Balch על ידי הצפת תא הטחינה עם 70%אתנול. לאחר מכן לשטוף את החדר עם מים deionized כדי להסיר את האתנול עודף. מכניסים את כדור הקרביד טונגסטן לתא הטחינה.

כיסו את קצות החבית של הבלך הומוגניזר, ואבטחו את הפקקים עם הנוגדיים שסופקו. לאחר מכן הכינו חמישה מיליליטרים של המאגרים ההיפוטוניים וההיפרטוניים המלאים לדגימה כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן מלא מזרק סטרילי, שני מיליליטר עם מיליליטר אחד של חוצץ היפוטוני מלא, בעדינות לשטוף את חדר הטחינה של homogenizer Balch, משאיר כ 500 microliters של חיץ היפוטוני מלא בתא.

לאחסן את homogenizer הסמוקים על קרח, ולתת לו להתקרר במשך 30 דקות. לאסוף את בעלי החיים L4 המוזנים היטב עם חוצץ M9 בצינור חרוט 15 מיליליטר, וצנטריפוגה החיות ב 1, 000 פעמים g במשך שלוש דקות. הסר את supernatant, ולהמשיך לשטוף את גלולה בעלי חיים עד supernatant הוא ברור.

לאחר מכן לשטוף את החיות עם שלושה מיליליטר של חוצץ היפוטוני קר, וצנטריפוגה שוב כפי שהוכח. לאחר הסרת המאגר ההיפוטוני העל-טבעי, הוסיפו מיליליטר אחד של חיץ היפוטוני מלא לכדור החי, והעבירו את ההשעיה של בעלי החיים למזרק סטרילי חדש, שני מיליליטר. להומוגניזציה בעלי החיים המשיכו על הקרח, דחפו בעדינות את החיות דרך תא הטחינה של ההומוגניזר הבלך טעון בכדור טונגסטן.

ואז לאסוף את החיות בחזרה במזרק, ולחזור על הליך זה 30 פעמים. לאחר 30 מחזורים של הומוגניזציה, לאסוף השעיה בעלי חיים מקסימלית מן homogenizer Balch, ולאחסן את המזרק עם הקצה ממוקם כלפי מטה בתוך microtube 1.7 מיליליטר. מוציאים את כדור הטונגסטן, ומנקים את תא הטחינה במים מתובלים.

יבש ולהחזיר את הכדור לצינור המסומן בהתאמה. לאחר מכן הכנס את כדור הטונגסטן בקוטר 7.9880 מילימטר ופינוי פער של 12 מיקרומטר לתא הטחינה, ונחתום מחדש את ההומוגניזר. לשטוף את תא הטחינה שוב עם מיליליטר אחד של חיץ היפוטוני שלם קר כקרח.

טוחנים את המתלים 25 פעמים כפי שהודגם. מעבירים את ההשעיה של החיה למיקרו-צינור נקי של 1.7 מיליליטר, ומאחסנים את המתלים על הקרח. גלולה את גופות בעלי החיים ופסולת על ידי צנטריפוגה.

פיפט 40 מיקרוליטרים של הסופר-נט לצינור המסומן כשבר קלט, ומאחסנים את השבר על הקרח. מעבירים את הסופר-נט הנותר לצינור חדש של 1.7 מיליליטר מבלי להפריע לכדור, וצנטריפוגה כדי לגלגל את הגרעינים. לאחר מכן העבר את supernatant מבלי להפריע גרעינים גלולה לצינור חדש 1.7 מיליליטר מסומן כמו שבר ציטוסולי.

כדי לשטוף את גלולה גרעינים, להוסיף 500 microliters של חוצץ היפוטוני מלא לכדור, להשעות את הכדור, וצנטריפוגה ב 4, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. בסוף הצנטריפוגה, resuspend הכדור הגרעיני ב 500 microliters של חיץ היפוטוני מלא טרי, ושוב צנטריפוגה המדגם כפי שהוכח. ואז להמיס את הכדור ב 40 microliters של חיץ היפרטוני מלא.

העבר את ההשעיה הגרעינית לצינור חדש 1.7 מיליליטר שכותרתו שבר גרעיני, ולאחסן אותו על קרח. קבעו את ריכוז החלבון של שלושה שברים באמצעות ערכת כימות פלואורסצנטית. Aliquot שברים גרעיניים לתוך צינורות חד פעמיים המכילים שישה מיקרוגרם של החלבון הגרעיני, ולהישבר קפוא בקרח יבש ואמבט אתנול.

לאחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. תמונת הג'ל הייצוגית מציגה את מוצרי התמלול של תמצית גרעינית זחלי L4 של Caenorhabditis elegans L4 באמצעות תבנית ה- DNA של מקדם CMV. הבידוד המוצלח של חלבונים גרעיניים פעילים הביא ללהקת זוגות בסיסים של 132 לאחר תמלול במבחנה, ובידוד לא מוצלח הביא ללהקה חלשה או להיעדר להקה.

זכור לתייג בבירור את המאגרים המלאים. מאגרים לא הולמים עלולים לפגוע בפונקציונליות של החלבונים הגרעיניים. כמו כן, לשמור על קר קרח הומוגניזר כדי למנוע denaturing של החלבונים.

פיתוח טכניקה זו אפשר לחוקרים למדוד את קצב שעתוק הרנ"א של C.elegans בתנאים מלחיצים, והראה כי קצב התמלול של החיה יכול להשתנות בהתאם לתנאי הסביבה.