Name: בידוד של תמצית גרעינית פעילה של Caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: למדו לבודד תמצית גרעינית פעילה מ-Caenorhabditis elegans לחקר ביוכימי של תמלול גנים. השיטה משתמשת בהומוגניזטור Balch ומאפשרת ויזואליזציה של פעילות תמלול במבחנה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH MIRA (R35GM124678 ל- J. S. ).

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-15 (2007).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li>
<li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li>
<li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7(2014).</li>
<li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87(2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-11 (2006).</li>
<li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+buffers+in+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

C. elegans הוא אורגניזם מודל מושך ללמוד את מערכת התמלול האוקריוטית בגלל התחזוקה הזולה שלה ואת הקלות של מניפולציה גנטית. כאן פרוטוקול לבידוד עקבי של תמצית גרעינית פעילה מבחינה תפקודית מ L4 C. elegans מתואר. למרות שפרוטוקול זה התמקד בהדמיית פעילות התמלול, ניתן לכמת את ה- cDNA שהופק לאחר שעתוק באמצעות RT-qPCR כדי לקבל מדידה מדויקת יותר של פעילות התמלול8. שיטה זו של בידוד חלבונים גרעיניים מ C. elegans יכול לעזור להרחיב את המחקר של מכונות שעתוק אאוקריוטי. מאז C. elegans</...

הנמטודה הקטנה, החיה החופשית Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל פשוט אך רב עוצמה לטיפול במגוון רחב של שאלות ביולוגיות. מאז הצגתו בשנת 1963, הנמטודות היו יקרות ערך לענות על שאלות נוירוביולוגיה, חילוף החומרים, הזדקנות, התפתחות, חסינות, וגנטיקה1. חלק מהמאפיינים הרבים של החיה שהופכים אותו לאורגניזם מודל אידיאלי כוללים זמן דור קצר, האפקטיביות של הפרעות RNA, גוף שקוף, ואת המפות הושלמו של שושלת התאים שלה ומערכת העצבים.
בעוד שתרומת הנמטודה למדע היא עצומה, הם נוצלו פחות כדי להדגיש את מערכת התמלול האוקריוטית, כאשר רוב הבנתנו לגבי מנגנונים אלה מגיעה ממחקרים המשתמשים בתמצית גרעינית של שמרים, זבובי פירות ותרבות תאי יונקים2. המשוכה הגדולה ביותר שמניאת את החוקרים מחילוצת תמצית גרעינית תפקודית היא הגוון החיצוני הקשוח של הנמטודה. שלד חיצוני זה כולל קולגנים מקושרים, חותך, גליקופרוטאין ושומנים, מה שהופך את C. elegans משלב הזחל לבגרות עמידים להפקת חלבונים באמצעות כוחות כימיים או מכניים3. מערכת תמלול במבחנה באמצעות תמצית גרעינית C. elegans פותחה בעבר אך לא אומצה באופן נרחב בשל ההיקף המוגבל של המערכת, והשימוש בהומוגניזר Dounce להכנת התמצית עלול להוביל לחוסר יציבות בחלבון4,5.
שלא כמו הפרוטוקול הקודם לבידוד תמצית גרעינית אשר השתמש homogenizer Dounce לשבור C. elegans, פרוטוקול זה משתמש homogenizer Balch. ההומוגניזר Balch מורכב משני מרכיבים עיקריים: כדור קרביד טונגסטן ובלוק נירוסטה עם ערוץ משועמם דרך מקצה לקצה. ההומוג'ייזר Balch טעון עם כדור קרביד טונגסטן וכתרים משני הצדדים כדי לאטום את תא הטחינה. מזרקים ניתן לטעון על שתי היציאות האנכיות המובילות לתא הטחינה. כאשר החומר מועבר ממזרק אחד לשני דרך תא הטחינה, הלחץ מהמזרקים מאלץ את החומר דרך רווח צר בין הכדור לקיר התא. לחץ איטי וקבוע זה שובר את החומר עד שהוא מגיע לגודל עקבי המסוגל לעבור דרך הפער הצר בקלות. אילוץ C. elegans דרך הפער הצר באמצעות לחץ מתמיד אך עדין שובר את בעלי החיים פתוח, שחרור התוכן שלהם לתוך חוצץ שמסביב. החלפת גדלי הכדור מהדקת עוד יותר את הפער, שוברת את התאים החדשים ששוחררו ומשחררת את הגרעינים לתוך המאגר. מקרים מרובים של צנטריפוגה מפרידים את הגרעינים משאר פסולת התא, ומאפשרים איסוף של תמצית גרעינית נקייה. הומוגניזר Balch מועדף על פני homogenizer Dounce מכמה סיבות: המערכת יכולה להתמודד עם מספר רב של בעלי חיים, מה שמאפשר לחלץ כמות גבוהה של חלבונים פעילים בניסיון אחד; עיבוד מדויק של הכדורים ואת בלוק הפלדה מאפשר שחיקה עקבית בין דגימות מרובות; בלוק הפלדה הכבדה משמש ככיור חום, מושך חום באופן אחיד מתא הטחינה, ומונע דנטורינג.
לאחר הבידוד, יש לאמת את פעילות התמלול של התמלול של התמליל של התמצית הגרעינית לפני השימוש בניסויים ביוכימיים כלשהם. באופן מסורתי, פעילות שעתוק נמדדה באמצעות נוקלאוטידים עם תווית רדיו כדי לעקוב ולדמיין את הרנ"א המסונתז החדש. עם זאת, תיוג רדיואקטיבי יכול להיות מעיק כפי שהוא דורש זהירות במהלך השימוש וסילוק6. ההתקדמות הטכנולוגית מאפשרת לחוקרים כיום להשתמש בשיטות הרבה פחות מזיקות או בעייתיות כדי למדוד אפילו כמויות RNA קטנות באמצעות טכניקות כגון PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)7. כאן, הפרוטוקול מתאר שיטה לבודד תמצית גרעינית פעילה משלב זחל 4 (L4) C. elegans ולדמיין פעילות שעתוק במערכת במבחנה.

<table><tbody><tr><td><חזק>חומרים מתכלים וריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 מ"ל צינורות 8 רצועות & כובעי רצועה שטוחים, Clear</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-706</td><td></td></tr><tr><td>0.2 מ"ל צינורות PCR בודדים</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-153G</td><td></td></tr><tr><td>1.7 מ"ל מיקרו-צינורות סטריליים</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282S</td><td></td></tr><tr><td>100% אתנול בדרגה מולקולרית מוחלטת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>&nbsp; BP2818</td><td></td></tr><tr><td>100% אתנול, Koptec</td><td>Decon Labs</td><td>&nbsp; V1001</td><td></td></tr><tr><td>פיפט סרולוגי 10 מ"ל</td><td>VWR בינלאומי</td><td>&nbsp; 89130-898</td><td></td></tr><tr><td>לוחות פטרי 150 מ"מ</td><td>Tritech Research</td><td>&nbsp; T3325</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"ל</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 28-103</td><td></td></tr><tr><td>מזרקי פלסטיק 20 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955460</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל מזרקי Norm-Ject</td><td>Henke-Sass Wolf GmbH</td><td>4020</td><td></td></tr><tr><td>500 מ"ל מסנן ואקום 0.22 ומיקרו; m PES, Stericup Millipore Express Plus</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"ל</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור סרולוגי</td><td>VWR בינלאומי</td><td>&nbsp; 89130-902</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפט סרולוגי</td><td>VWR בינלאומי</td><td>&nbsp; 89130-896</td><td></td></tr><tr><td>אגר, קריטריון</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; C7432</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>דנוויל סיינטיפיק</td><td>&nbsp; CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>טוש הוכחת אלכוהול</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 52877-310</td><td></td></tr><tr><td>בקטו פפטון</td><td>VWR בינלאומי</td><td>&nbsp; 90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans</td><td>CGC</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>סידן דיכלוריד</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; C4901</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>Millipore סיגמא</td><td>&nbsp; C8667</td><td></td></tr><tr><td>בקרת פריימרים לשיבוט מקדש DNA, קדימה 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריימרים לשיבוט מקדש DNA, קדימה 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מים</td><td></td><td></td><td></td>נטולי יונים</tr><tr><td>דיתיותרייטול</td><td>אינוויטרוגן</td><td>&nbsp; 15508-013</td><td></td></tr><tr><td>כתם ג'ל DNA, בטוח SYBR</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; S33102</td><td></td></tr><tr><td>תערובת סולם DNA, O' שליט הגנים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>&nbsp; SM1173</td><td></td></tr><tr><td>צבע טעינת DNA, 6x TriTrack</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>FERR1161 DNase, Baseline-ZERO</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>DB0715K</tr><tr><td>קרח</td><td></td><td></td><td></td> יבש</tr><tr><td>Escherichia coli זן OP50</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A38</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>&nbsp; G6279</td><td></td></tr><tr><td>HeLa תמצית גרעינית מערכת שעתוק במבחנה, HeLaScribe</td><td>Promega</td><td>&nbsp; E3110</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td><td>Millipore Sigma</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית 37%</td> <td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה היפוכלוריט</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB מרק</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; L3022</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום דיכלוריד</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; M8266</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט</td><td>Millipore סיגמא</td><td>&nbsp; M7506</td><td></td></tr><tr><td>כלים במשקל בינוני</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>&nbsp; 02-202-101</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ, Vista vision</td><td>VWR International</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>מים בדרגה מולקולרית,</td><td>מעבדות Hypure Hyclone</td><td>&nbsp; </td><td></td>SH30538</tr><tr><td>Nystatin</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; מערכת N1638</td><td></td></tr><tr><td>PCR, FailSafe עם פרמיקס A</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>FS99100</tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P39111</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P3786</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז, קוקטייל הפסקה לשימוש חד פעמי 100x</td> ערכת בדיקת חלבון <td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>, Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; ערכת שעתוק הפוך Q33211</td><td></td></tr>, ערכת מיצוי RNA <tr><td>205211</td><td></td><td>Qiagen Sensiscript</td><td></td></tr> ערכת <tr><td>מיקרו RNeasy Qiagen</td><td></td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase</td><td>Applied Biosystems</td><td>&nbsp; </td><td></td>N8080119</tr><tr><td>סודיום כלוריד</td><td>VWR בינלאומי</td><td>&nbsp; BDH9286-12 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Millipore סיגמא</td><td>&nbsp; 1-09137</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק סטרילי עם 0.2 ומיקרו; m ממברנת פוליאתרסולפון</td><td>VWR בינלאומי</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>VWR בינלאומי</td><td>&nbsp; 200-334-9</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים לשעתוק, קדימה 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריימרים לשעתוק, הפוך 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריס-בייס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>&nbsp; BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P2287</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 ו-deg; חממת C</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 & deg; חממת C</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; חממת C</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 & deg; מקרר C</td><td>ThermoFisher Scientific-80</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C מקפיא</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balch הומוגנייזר, הומוגנייזר תאים איזוביוטק</td><td>Isobiotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה, צנטריפוגה Eppendorf 5418 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>, VWR Clinical 50</td><td>VWR International</td><td>82013-800</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה, Leica M80</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלואורומטר, מערכת הדמיית ג'ל Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>, iBright FL1500</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; A44241</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ג'ל</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>VWR International</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגות, Eppendorf 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra</td><td>155017</td><td></td></tr><tr><td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת נדנדה</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950030010</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של תמצית גרעינית פעילה של caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans היה מערכת מודל חשוב למחקר ביולוגי מאז הוצג בשנת 1963. עם זאת, C. elegans לא נוצל באופן מלא במחקר הביוכימי של תגובות ביולוגיות באמצעות תמציות גרעיניות שלה כגון תמלול במבחנה ושכפול DNA. משוכה משמעותית לשימוש C. elegans במחקרים ביוכימיים היא לשבש את החתך החיצוני העבה של הנמטודה מבלי להקריב את הפעילות של התמצית הגרעינית. בעוד מספר שיטות משמשות כדי לשבור את הקיטור, כגון הומוגניזציה Dounce או sonication, הם לעתים קרובות להוביל חוסר יציבות חלבון. אין פרוטוקולים מבוססים לבידוד חלבונים גרעיניים פעילים מזחלים או C. elegans למבוגרים לתגובות במבחנה . כאן, הפרוטוקול מתאר בפירוט את ההומוגניזציה של שלב זחל 4 C. elegans באמצעות הומוגניזר Balch. ההומוגניזר הבלץ' משתמש בלחץ כדי לאלץ את בעלי החיים באיטיות לעבור פער צר ששובר את הקיטור בתהליך. העיצוב האחיד והעיצוב המדויק של ההומוגניזר בלך מאפשרים שחיקה עקבית של בעלי חיים בין ניסויים. פירוק ההומוגנית המתקבלת מההומוגניזר Balch מניבה תמצית גרעינית פעילה מבחינה תפקודית שניתן להשתמש בה בשיטת מבחנה לבדיקת פעילות שעתוק של C. elegans.

בעקבות הצעדים המתוארים אמור להניב תמצית גרעינית תפקודית (איור 1),סטייה בשלבי השחיקה או הכביסה עלולה להוביל לפעילות לקויה או לתפוקות נמוכות. אם תתקבל תמצית גרעינית פונקציונלית C. elegans , זה יהיה לתמלל את האזור במורד הזרם של מקדם CMV על תבנית ה- DNA כאשר נוסף במבחנה שתוארה בעבר במבחנה. ניתן לטהר את תעתיק הרנ"א שנוצר מחלבונים גרעיניים ומתבנית DNA בשיטות קונבנציונליות. ללא ה- DNA של התבנית, שעתוק הפוך ומוצר PCR עוקב יכולים להיות רק תוצאה של ה...

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד תמצית גרעינית פעילה משלב זחל 4 C. elegans והדמיה של פעילות שעתוק במערכת במבחנה .

בידוד של תמצית גרעינית פעילה של Caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

פרוטוקול זה ממלא פער טכני למחקר הביוכימי של C.elegans ומרחיב את התועלת שלהם כאורגניזם מודל. טכניקה זו היא פשוטה וחזקה, ומאפשרת בידוד עקבי של תמצית גרעינית C.elegans פעילה מבחינה תפקודית. התחל על ידי הצבת בעלי החיים L1 מסונכרנים על 10 150 מ"מ נמטודה צמיחה צלחות המכילות מדיה זרעים עם Escherichia coli OP50, ולאפשר לבעלי החיים לגדול במשך 48 שעות ב 20 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לשלב L4.ברגע המאגרים ההיפוטוניים וההיפרטוניים מוכנים, לנקות את homogenizer Balch על ידי הצפת תא הטחינה עם 70%אתנול. לאחר מכן לשטוף את החדר עם מים deionized כדי להסיר את האתנול עודף. מכניסים את כדור הקרביד טונגסטן לתא הטחינה.כיסו את קצות החבית של הבלך הומוגניזר, ואבטחו את הפקקים עם הנוגדיים שסופקו. לאחר מכן הכינו חמישה מיליליטרים של המאגרים ההיפוטוניים וההיפרטוניים המלאים לדגימה כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן מלא מזרק סטרילי, שני מיליליטר עם מיליליטר אחד של חוצץ היפוטוני מלא, בעדינות לשטוף את חדר הטחינה של homogenizer Balch, משאיר כ 500 microliters של חיץ היפוטוני מלא בתא.לאחסן את homogenizer הסמוקים על קרח, ולתת לו להתקרר במשך 30 דקות. לאסוף את בעלי החיים L4 המוזנים היטב עם חוצץ M9 בצינור חרוט 15 מיליליטר, וצנטריפוגה החיות ב 1, 000 פעמים g במשך שלוש דקות. הסר את supernatant, ולהמשיך לשטוף את גלולה בעלי חיים עד supernatant הוא ברור.לאחר מכן לשטוף את החיות עם שלושה מיליליטר של חוצץ היפוטוני קר, וצנטריפוגה שוב כפי שהוכח. לאחר הסרת המאגר ההיפוטוני העל-טבעי, הוסיפו מיליליטר אחד של חיץ היפוטוני מלא לכדור החי, והעבירו את ההשעיה של בעלי החיים למזרק סטרילי חדש, שני מיליליטר. להומוגניזציה בעלי החיים המשיכו על הקרח, דחפו בעדינות את החיות דרך תא הטחינה של ההומוגניזר הבלך טעון בכדור טונגסטן.ואז לאסוף את החיות בחזרה במזרק, ולחזור על הליך זה 30 פעמים. לאחר 30 מחזורים של הומוגניזציה, לאסוף השעיה בעלי חיים מקסימלית מן homogenizer Balch, ולאחסן את המזרק עם הקצה ממוקם כלפי מטה בתוך microtube 1.7 מיליליטר. מוציאים את כדור הטונגסטן, ומנקים את תא הטחינה במים מתובלים.יבש ולהחזיר את הכדור לצינור המסומן בהתאמה. לאחר מכן הכנס את כדור הטונגסטן בקוטר 7.9880 מילימטר ופינוי פער של 12 מיקרומטר לתא הטחינה, ונחתום מחדש את ההומוגניזר. לשטוף את תא הטחינה שוב עם מיליליטר אחד של חיץ היפוטוני שלם קר כקרח.טוחנים את המתלים 25 פעמים כפי שהודגם. מעבירים את ההשעיה של החיה למיקרו-צינור נקי של 1.7 מיליליטר, ומאחסנים את המתלים על הקרח. גלולה את גופות בעלי החיים ופסולת על ידי צנטריפוגה.פיפט 40 מיקרוליטרים של הסופר-נט לצינור המסומן כשבר קלט, ומאחסנים את השבר על הקרח. מעבירים את הסופר-נט הנותר לצינור חדש של 1.7 מיליליטר מבלי להפריע לכדור, וצנטריפוגה כדי לגלגל את הגרעינים. לאחר מכן העבר את supernatant מבלי להפריע גרעינים גלולה לצינור חדש 1.7 מיליליטר מסומן כמו שבר ציטוסולי.כדי לשטוף את גלולה גרעינים, להוסיף 500 microliters של חוצץ היפוטוני מלא לכדור, להשעות את הכדור, וצנטריפוגה ב 4, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. בסוף הצנטריפוגה, resuspend הכדור הגרעיני ב 500 microliters של חיץ היפוטוני מלא טרי, ושוב צנטריפוגה המדגם כפי שהוכח. ואז להמיס את הכדור ב 40 microliters של חיץ היפרטוני מלא.העבר את ההשעיה הגרעינית לצינור חדש 1.7 מיליליטר שכותרתו שבר גרעיני, ולאחסן אותו על קרח. קבעו את ריכוז החלבון של שלושה שברים באמצעות ערכת כימות פלואורסצנטית. Aliquot שברים גרעיניים לתוך צינורות חד פעמיים המכילים שישה מיקרוגרם של החלבון הגרעיני, ולהישבר קפוא בקרח יבש ואמבט אתנול.לאחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. תמונת הג'ל הייצוגית מציגה את מוצרי התמלול של תמצית גרעינית זחלי L4 של Caenorhabditis elegans L4 באמצעות תבנית ה- DNA של מקדם CMV. הבידוד המוצלח של חלבונים גרעיניים פעילים הביא ללהקת זוגות בסיסים של 132 לאחר תמלול במבחנה, ובידוד לא מוצלח הביא ללהקה חלשה או להיעדר להקה.זכור לתייג בבירור את המאגרים המלאים. מאגרים לא הולמים עלולים לפגוע בפונקציונליות של החלבונים הגרעיניים. כמו כן, לשמור על קר קרח הומוגניזר כדי למנוע denaturing של החלבונים.פיתוח טכניקה זו אפשר לחוקרים למדוד את קצב שעתוק הרנ"א של C.elegans בתנאים מלחיצים, והראה כי קצב התמלול של החיה יכול להשתנות בהתאם לתנאי הסביבה.

isolation-active-caenorhabditis-elegans-nuclear-extract

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול עבור בידוד והפעלת spermatids מן...

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

פרוטוקול זה מתאר את הכנת המצע tRNA סינתטי...

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ&quot;א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים

ניתוח microarray נערך כדי לקבוע פרופילים של ביטוי...

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.

Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

פרוטוקול זה מתאר כיצד ללמוד תהליכים תאיים במהלך ההמרה גורל התא ב Caenorhabditis elegans ויוו. באמצעות בעלי חיים מהונדס, המאפשר ביטוי יזם מונחה חום-שוק של נוירון בתדר גורל שעתוק הגורם צ'ה-1 מציאה RNAi בתיווך דלדול של כרומטין מווסת גורם לין-53 נבט לתא נוירון התכנות יכול להיות שנצפו אין ויוו.<br...

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של RNA DNA, חלבונים מדגם זהה, פרוטוקול, במאמץ להפחית את הווריאציה לשפר הפארמצבטית, להקל על פרשנויות.

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד פשוט של קבוצות מסוימות של תאים עצביים חיים המבטא חלבון פלורסנט ירוק מקווי האלגניים של הקווים. שיטה זו מאפשרת מגוון של מחקרים vivo ex התמקדו נוירונים ספציפיים ויש לו את היכולת לבודד תאים עבור לטווח קצר יותר culturing.

בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

שיטה זו מתארת פרוטוקול להכנת תמצית חלבון בתפוקה גבוהה מדגימות אלגנים של Caenorhabditis ו- co-immunoprecipitation לאחר מכן.

הכנת תמצית חלבון ושיתוף חיסוני מאלגנים של קנורהאביטיס

מוצג כאן תיאור של הבידוד הישיר והמהיר יחסית של דנ"א גנומי של Caenorhabditis elegans מבעל חיים אחד או כמה בעלי חיים באמצעות ערכת רקמה זמינה מסחרית. הכנת ה-gDNA המתקבלת היא תבנית מתאימה ל-PCR.

מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לתוספי שומנים בתרביות נוזליות ובתרביות על צלחת עבור Caenorhabditis elegans, יחד עם מחקרי אורך וניתוח שעתוק גנים מכמות גדולה או כמה תולעים ורקמות תולעים.

תוספי שומנים לאריכות ימים וניתוח שעתוק גנים ב - Caenorhabditis elegans

למדו לבודד תמצית גרעינית פעילה מ-Caenorhabditis elegans לחקר ביוכימי של תמלול גנים. השיטה משתמשת בהומוגניזטור Balch ומאפשרת ויזואליזציה של פעילות תמלול במבחנה.

בידוד של תמצית גרעינית פעילה של Caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה

גלה סרטונים נוספים