Name: ויסות תאי גזע מזנכימליים של מקרופאג פאגוציטוזיס; כמות והדמיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: למד שיטת תרבית משותפת לכימות פאגוציטוזה במקרופאג'ים תחת ויסות של תאי גזע מזנכימליים באמצעות חלקיקים פלואורסצנטיים רגישי pH. הטכניקה מספקת כלי אמין לחקר מנגנוני החסינות המולדת ומאפשרת ניתוח בתפוקה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מנגנון מכשיר המחקר העיקרי של NSF תחת מספרי מענקים 1626093 1919583.

<ol><li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Mesenchymal+stem%2Fmultipotent+stromal+cells%3A+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li>
<li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+sensors+and+switchers+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li>
<li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4%28%2B%29+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li>
<li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988(2011).</li>
<li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li>
<li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65(2013).</li>
<li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+paradigm%3A+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088(2010).</li>
<li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E%282%29-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li>
<li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252(2010).</li>
<li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive%2Fanti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li>
<li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages%3A+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li>
<li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56(2015).</li>
<li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1%2FM2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70(2014).</li>
<li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257(2017).</li>
<li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li>
<li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 3-23 (2010).</li>
<li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B3+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c%2FEBP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li>
<li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li>
<li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li>
<li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye%2C+pHrodo-SE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

ניתוח של פאגוציטוזיס באמצעות חלקיקים ביולוגיים הצומדים לצבע רגיש ל- pH הוא כלי חדש יחסית שהוכיח יתרון על פני חלקיקים מסורתיים המסומנים פלואורסצנטית12,19,20. עם חלקיקים מסורתיים המסומנים בפלואורסצנט, רק ניתוח נקודת קצה אפשרי. הזיהוי מתבצע באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ו/או ספקטרופלואורומטריה לאחר כביסה או מרווה חלקיקים שלא נלקחו על ידי הפאגוציט. לנתונים כמותיים הנגזרים מספקטרופלואורומטריה יש פוטנציאל לזהות חלקיקים שאינם נבלעים...

תאי גזע מזנכימליים (MSC) הם תאי אבות המעוררים תאי רקמת חיבור. MSC נמצאים ברקמות יונקים בוגרים וניתן לבודדם ממח העצם1. בשל תכונות האימונומודולטוריות שלהם, תאים אלה נחקרים באופן נרחב2. מחקרים מוקדמים התמקדו בוויסות MSC של תאי T3,4,5,6 אבל לאחרונה, הרגולציה שלהם של תאי מקרופאגים (MΦ), מרכיב תאי מרכזי של חסינות מולדת, קיבל תשומת לב מוגברת7,8,9,10,11,12,13,14 . החשיבות של אינטראקציה MSC-MΦ בטיפול במחלות דלקתיות מודגמת על ידי העובדה כי דלדול של מונוציטים / מקרופאגים שולל את ההשפעות הטיפוליות של MSC במודלים בעלי חיים8. כאן, המוקד הוא אינטראקציית הקשר הסלולרי של MSC עם MΦ. MSC יש את היכולת לווסת את הפנוטיפ של MΦ על ידי קידום המעבר מתגובות דלקתיות לאנטי דלקתיות, המוביל לפעילויותתיקון רקמות 8,9,10,11, והרבה נעשה כדי להדגים מנגנוני רגולציה אלה. בנסיבות אחרות, MSC יכול לתמוך או להחמיר תגובה דלקתית מונעת MΦ12,13 ולשפר את הפעילות הפאגוציטית MΦ14,15. עם זאת, קיים מחסור קריטי בנתונים קיימים המזהים את המנגנונים לפיהם ואת התנאים שבהם MSC מסדיר את הפעילות הפאגוציטית MΦ.
MΦ יש משפחות של קולטנים המזהים אופוסונום (נוגדן או משלים מצופה) או פתוגנים שאינם אובזוניים המובילים phagocytosis16. ההפעלה והפעילות של האחרון הוא פחות נחקר היטב17. בסביבה לא דלקתית במבחנה, MSC לשפר MΦ phagocytosis של פתוגנים שאינם אוסוניסטים13. עם זאת, זיהוי של פתוגנים שאינם opsonized על ידי MΦ עשוי להיות מופחת לאחר חשיפה לסביבה דלקתית המיוצר על ידי לימפוציטים במהלך תגובה חיסונית אדפטיבית. IFN-γ, שוחרר על ידי תאי רוצח טבעי לימפוציטים אפקט, יש השפעה מעכבת על MΦ phagocytosis של חלקיקים לא opsonized18. מודל תרבות משותפת פותח כדי ללמוד את המנגנונים של MSC רגולציה מגע ישיר של MΦ phagocytosis. מטרת הניסוי המוצג כאן היא לקבוע אם MSC לווסת MΦ phagocytosis של פתוגנים שאינם אוסוניסטים לאחר MΦ נחשפו IFN-γ (איור 1).

<table><tbody><tr><td>96 בארות פוליסטירן שחור מיקרופלייט</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>0.4% תמיסה כחולה טריפאן</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל 15 מ"ל ו-50 מ"ל צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים</td><td>ThermoFisher</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>4 בארות כיסוי עם בארות שאינן ניתנות להסרה</td><td>ThermoFisher</td><td>155382PK</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (100X)&nbsp; Gibco</td><td>ThermoFisher</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Axiobserver 7 מערכת הדמיה</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A8806-1G</td><td></td></tr><tr><td>מרים תאים</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3008-100EA</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית, תרבית רקמות מטופלות, שטח פנים 75&nbsp; cm2, צוואר משומר, עם מכסה,</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7231-120EA</td><td></td></tr><tr><td>D1 ORL UVA [D1]</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>עכבר MSC Cell Line</td></tr><tr><td>DMEM, סרום בקר עוברי ThermoFisher 11965092</td><td></td><td></td><td></td>עם גלוקוז גבוה</tr><tr><td>, מוסמך, מומת בחום</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>FisherScientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>I-11.15</td><td>ATCC</td><td>CRL-2470</td><td>עכבר M&Phi; קו תאים</td></tr><tr><td>LADMAC קו תאים</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td>תאי LADMAC מפרישים את הגורם המגרה של מושבת גורם הגדילה 1 (CSF-1).</td></tr><tr><td>פתרון הדמיה של תאים חיים</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Green Zymosan Bioparticles מצומד</td><td>ThermoFisher</td><td>P35365</td><td></td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים IFN-&gamma;</td><td>Preprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax i3X</td> מכשירים <td></td><td></td><td>מולקולריים</td></tr> סטריליים <tr><td>יחידות מסנן ואקום לשימוש חד פעמי, 250 מ"ל, 0.2 ומיקרו; m</td><td>ThermoFisher</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>מסנני מזרק סטריליים, 0.2 מיקרומטר</td><td>ThermoFisher</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית שטופלו בתרבית רקמות, 100 מ"מ x 20 מ"מ</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS430167-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

ויסות תאי גזע מזנכימליים של מקרופאג' פאגוציטוזיס; כמות והדמיה

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

תאי גזע Mesenchymal (MSC) נחקרו באופן מסורתי עבור תכונות התחדשות שלהם, אבל לאחרונה, המאפיינים החיסוניים שלהם היו בחזית. הם מתקשרים ומווסתים את פעילות תאי החיסון. המוקד של מחקר זה הוא הרגולציה MSC של פעילות פגוציטית מקרופאג '. פאגוציטוזיס מקרופאג' (MΦ) הוא חלק חשוב מהתגובה המולדת של מערכת החיסון לזיהום, והמנגנונים שבאמצעותם MSC לווסתים תגובה זו נמצאים תחת חקירה פעילה. מוצג כאן היא שיטה לחקור MΦ phagocytosis של חלקיקי זימוסן לא אוזונסה מצומדים למולקולה פלואורסצנטית רגישה ל- pH בזמן שהם נמצאים בתרבית משותפת עם MSC. ככל שהפעילות הפגוציטית גדלה וחלקיקי הזימוסן המסומנים סגורים בסביבה החומצית של הפגוליסום, עוצמת הפלואורסצנטיות של המולקולה הרגישה ל- pH עולה. עם אורכי הגל המתאימים של עירור ופליטה, פעילות פאגוציטית נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי ונתונים קינטיים מוצגים כשינויים ביחידות פלואורסצנטיות יחסית על פני תקופה של 70 דקות. כדי לתמוך בנתונים כמותיים אלה, השינוי בפעילות הפאגוציטית מוצג באופן חזותי באמצעות הדמיה דינמית. תוצאות בשיטה זו מראות כי כאשר בתרבות משותפת, MSC לשפר MΦ phagocytosis של זימוסן לא opsonized של נאיבי ו IFN-γ מטופל MΦ. נתונים אלה מוסיפים לידע הנוכחי של ויסות MSC של המערכת החיסונית המולדת. שיטה זו יכולה להיות מיושמת בחקירות עתידיות כדי לתוות באופן מלא את המנגנונים התאיים והמולקולריים הבסיסיים.

לאחר חישוב ממוצע ± SEM עבור כל קבוצה בכל נקודות הזמן, הנתונים מוצגים בתבנית גרף קו עם ציר ה- Y כעוצמה פלואורסצנטית יחסית וציר ה- X כזמן. קובץ משלים 1 מספק דוגמה לנתונים גולמיים מקריאה קינטית של לוחית 96-well בתבנית גיליון אלקטרוני.
במחקר זה, התוצאות האופטימליות המוצגות באיור 3A, וטבלה 3 מדגימות כי 1) תרבות משותפת עם MSC משפרת את הפעילות הפגוציטית של המקרופאג', 2) טיפול IFN-y מפחית את הפעילות של המקרופאג', ו -3) תרבות משותפת עם MSC...

מוצג כאן פרוטוקול לכמת ולייצר תמונות דינמיות של תאי גזע מזנכימליים (MSC) רגולציה מתווכת של מקרופאגים (MΦ) פאגוציטוזיס של חלקיקי שמרים לא אוסונים (זימוסן) המצומדים למולקולה פלואורסצנטית רגישה ל- pH.

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

שיטת תרבות משותפת זו תסייע לענות על שאלות מרכזיות סביב מנגנוני הקשר לתאים מאחורי ויסות תאי גזע מזנכימליים של פאגוציטוזיס מקרופאגים, ולכן להאיר את תפקידו של MSC בוויסות חסינות מולדת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת ניתוחים בעלי תפוקה גבוהה. החלקיקים הביולוגיים מצומדים לצבעים רגישים ל-pH פלואורסצ'ה רק בסביבות פאגוליסום חומציות.לפיכך, יש צורך בשטיפה ובהרווים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על מגוון מודלים של תרבות משותפת הכוללים נויטרופילים ופגוציטים אחרים. מדגים את ההליך יהיה איתן Chetkof, תואר ראשון כרגע במעבדה שלי.ראשית, שימו לב למפגש של תאי גזע מזנכימליים בתרבית. כאשר 70-80% השפעה מושגת, לשאוף את מדיום הצמיחה מן התאים התרבותיים בצלחת 100 מ"מ ולהוסיף חמישה מיליליטר של PBS. לאחר שאיפה PBS, להוסיף שני מיליליטר של 0.05%טריפסין פתרון EDTA ולדגירה על התאים במשך שלוש דקות.לאחר שלוש דקות, בדוק את ניתוק התא באמצעות מיקרוסקופ הפוך. ואם התאים אינם מנותקים, דגירה במשך 1 עד 2 דקות שוב. לאחר כל התאים מנותקים, להוסיף חמישה מיליליטר של מדיום צמיחה טרי לצלחת.לאחר שטיפה של הצלחת באמצעות תערובת טריפסין בינונית, להשתמש פיפטה סרולוגית סטרילית כדי לאסוף תאים לתוך צינור חרוט נקי, סטריליטר 50 מיליליטר. לאחר מכן, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר שאיפת supernatant, resuspend גלולה התא ב 10 מיליליטר של מדיום צמיחה טרי על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה.לספירת תאים, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של השעיית תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל 30 מיקרוליטרים של תמיסת טריפן כחולה 0.4%, ולאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטרים של התערובת מתחת לכיסוי של תא ספירת המוציטומטר. תחת המיקרוסקופ ההפוך או ברייטפילד, ספר את התאים הקיימים שאינם נגועים באמצעות עדשה אובייקטיבית של פי 10 וארבעה תאים של מילימטר מרובע אחד וחשב את מספר התא כמתואר בכתב היד של הטקסט. השתמש במשוואה C1V1 שווה C2V2 כדי לקבוע את הנפח הרצוי של המתלים הבינוניים והתאים הטריים הנדרשים להכנת השעיית התא בריכוז סופי של פעם אחת כפול 10 לתאים החמישיים למיליליטר.השתמש micropipetter רב ערוצית כדי להוסיף 100 microliters של השעיית התא בבארות של צלחת 96-well על פי עיצוב הצלחת. השתמש micropipette כדי להוסיף 530 microliters של השעיית התא לכל שקופית התא על פי עיצוב הצלחת ודגורה לילה. הכן 10 מיליליטר של אמצעי הפעלה המכיל גמא אינטרפרון בריכוז של 250 ננוגרם למיליליטר להפעלת תאי המקרופאג 'בצלחת אחת 100 מ"מ.שאפו את מדיום הצמיחה מתרביות תאי המקרופאג' ושטפו את התאים בחמישה מיליליטר של אמצעי ההפעלה נטולי אינטרפרון גמא. לאחר שאיפה מדיום שטיפה בצלחת ניסיונית, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום הפעלה בתוספת אינטרפרון גמא. ובצלחת הבקרה, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום הפעלה ללא אינטרפרון גמא, ולאחר מכן לדגור על התאים במשך 16 עד 24 שעות.בסוף הדגירה, להכנת תרביות משותפות, להסיר את מדיום ההפעלה מתאי המקרופאגים ולהוסיף חמישה מיליליטר של מדיום צמיחה טרי. השתמש מרים תאים בעדינות לגרד את התאים ולאסוף את התאים לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. לאחר מכן, לספור את התאים באמצעות החרגת כחול טריפן והמוציטומטריה, ואחריו הכנת שליטה ומטופלים השעיות תא מקרופאג בריכוז של פעמיים 10 עד התא החמישי למיליליטר כפי שהודגם בעבר עבור תאי גזע mesenchymal.שאפו בעדינות את המדיום מהבארות הניסיוניות המכילות תאי גזע מזנכימליים. השתמש micropipette רב ערוצית כדי להוסיף 100 microliters של מטופלים ואת התליות תא מקרופאג 'בקרה בבארות הניסוי המתאימות על פי עיצוב הצלחת ודגורה לילה כפי שהוכח. שאפו בעדינות את המדיום מהמגלשה התאית בעלת ארבעת החומות המכילה תאי גזע מזנכימליים.השתמש micropipette כדי להוסיף 530 microliters של השעיית תא מקרופאג לבארות המתאימות על פי העיצוב ודגרה בן לילה. הוסף מיליליטר אחד של מדיום הדמיה של תאים חיים ל בקבוקון המכיל מיליגרם אחד של חלקיקי זימוסאן ולאסוף את תערובת החלקיקים הבינוני לתוך צינור תרבות זכוכית. לאחר שטיפה של בקבוקון עם מיליליטר נוסף של פתרון הדמיה, להעביר את מדיום הדמיה שטוף בצינור הזכוכית, ולאחר מכן להוסיף שלושה מיליליטר של פתרון הדמיה נוסף כדי להשיג 0.2 מיליגרם לכל השעיית חלקיקים זימוסאן מיליליטר.מערבולת השעיית זימוסאן באמצעות פולסים מהירים במשך 30 עד 60 שניות, ולאחר מכן להשתמש sonicator בדיקה כדי sonicate ההשעיה עם 60 פולסים מהירים. לאחר שאיפת המדיום, לשטוף את הבארות הניסיוניות ובארות ריקות ריאגנט עם 100 microliters של פתרון הדמיית תאים חיים. לאחר מכן, שאפו את פתרון הדמיית התא החי מהבארות והוסיפו 100 מיקרוליטרים של ההשעיה הזימוסאית.פתח את מגש הלוחות של קורא הפלואורסצנטי באמצעות ממשק משטח המגע. הגדר את הצלחת ללא המכסה במגש עם הבאר A1 בפינה השמאלית העליונה. סגור את המגש באמצעות משטח המגע ולחץ על לחצן הקריאה הירוק בתפריט העליון.כדי לערוך את בדיקות phagocytosis, לאחר שטיפה הבאר הניסיונית הראשונה עם 750 microliters של מדיום הדמיה, להוסיף 400 microliters של השעיית זימוסאן עוזב את הבארות הנותרות במדיום הצמיחה. לאחר מכן, הנח את השקופית על השלב הדגירה של מערכת ההדמיה. השתמש בתוכנת ההדמיה.בחר באפשרות ברייטפילד תחת הכרטיסיה איתור ולאחר מכן לחץ על סמל העין. עם המטרה 10X במקום, להשתמש בעין ואת הידית התמקדות להתמקד בתאים. בחר את הכרטיסיה רכישה.פתחו את התפריט הנפתח של הניסוי ובחרו קבוצה של אורכי גל הכוללים מסנן EGFP המוגדר להכיל עירור של 509 ננומטר ואורכי גל פליטה של 533 ננומטר של הצבע הרגיש ל- pH. כאשר נותרו כשתי דקות על הטיימר, לחץ על סמל 20X בתפריט האובייקטיבי כדי לשנות את המטרה ל- 20X, ולאחר מכן לחץ על תפריט הערוצים, בחר מסנני EGFP ובתפריט החשיפה, הגדר את זמן החשיפה ל - 400 אלפיות השנייה כדי לזהות את הפלורופור הירוק הרגיש ל- pH ולאחר מכן לחץ על חי. לאחר התאמת המוקד, לחץ על עצור כדי לכבות את האור וסמן את התיבה לצד ההגדרה הניסיונית העליונה של זמן לשגות.בתפריט אסטרטגיית המיקוד, בחר מיקוד אוטומטי של התוכנה ומהתפריט הנפתח, בחר הגדרות חכמות וליבה כדי לקצר את זמן החשיפה לאור בזמן שהמיקוד האוטומטי פועל. בתפריט זמן-לשגות, הגדר את מספר הרכישות הרצוי ל- 30 עד 60, את זמן המרווח לדקה אחת ולאחר מכן לחץ על לחצן התחל ניסוי כדי להתחיל את הרכישה. ההשפעה של אינטרפרון גמא על התרבות המשותפת נחקרה.התוצאות הייצוגיות מראות כי התרבות המשותפת של מקרופאגים עם תאי גזע מזנכימליים משפרת את הפעילות הפגוציטית של המקרופאג'. טיפול אינטרפרון גמא מפחית את הפעילות של המקרופאג'. עם זאת, בנוכחות תאי גזע מזנכימליים, הפעילות הפגוציטית המקרופאג' חולצה חלקית.צפיפות התאים האופטימלית היא קריטית במחקרים אלה. וכאשר תאי המקרופאגים היו מצופים בצפיפות נמוכה מדי, לא זוהו שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות. כאשר תאי המקרופאגים היו מצופים בצפיפות גבוהה, עוצמת הפלואורסצנטיות הועלתה במהירות בכל הקבוצות ולא הבחינו בהבדלים.אחד הדברים החשובים ביותר במהלך הליך זה הוא להבטיח כי צפיפות התאים הם אופטימיזציה ונשמר עקבי בין ניסויים.

mesenchymal-stem-cell-regulation-macrophage-phagocytosis-quantitation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה חדשנית להשיג מקרופאגים מתרבות העיקרי של תאים בכבד חולדה מתואר. שיטה זו מנצלת את ריבוי של מקרופאגים בתרבות, ואחריו רעד של צלוחיות תרבות וטיהור על ידי התקשרות סלקטיבית מנות פלסטיק. טכניקה זו יעילה מספק מקרופאגים הכבד ללא ציוד מיומנויות מורכבות.

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

סרטון זה מדגים בדיקה לחקר ויסות תאי גזע מזנכימליים (MSC) של מקרופאגים פגוציטוזה בתרבית משותפת. לאחר תרבית משותפת של MSC עם מקרופאגים, חלקיקים זימוזניים לא אופסוניים מצומדים לפלואורופור הרגיש ל- pH מתווספים לפאגוציטוזה על ידי המקרופאגים. עם העלייה בפאגוציטוזה, עוצמת הפלואורסצנטיות עולה, ומאפשרת לקבוע רגולציה בתיווך MSC של פעילות פגוציטית.

בדיקה לחקר הרגולציה של פגוציטוזה מקרופאגים על ידי תאי גזע מזנכימליים

המאמר מתאר את הסתגלות קלה...

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

אנו מציגים שיטות כדי להעריך את יכולת phagocytic של ראשי מאתר הנגזרות מח עצם מקרופאגים באמצעות פסולת מיאלין fluorescently שכותרתו השומנים תאיים droplet מכתים.

במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לכמת את פעילות כימוטקטיק של דם מונוציטים בדגמי העכבר, כדי להעריך את ההשפעות של התערבויות תזונתיות, תרופתי וגנטי על מונוציט דם ולאפיין את מונוציטים בדם נגזר מקרופאגים ב מודלים לעכבר באמצעות חלבון מונוציט-כימוסטנט-1 (MCP-1)-העמיסו במרתף ממברנה ממברנות ג'ל הנגזר.

הכמת של פעילות כימוכתית מונוציט בVivo ואפיון מקרופאגים הנגזרים מונוציט

פעילות מקרופאג phagocytic נגד תאים סרטניים, במיוחד 4T1 עכבר קרצינומה של החלב בתאי, היה בתמונה במחקר זה. מודל התרבות של התאים החיים הוקם ונצפה בשילוב של מיקרוסקופ פלורסנט והפרעות דיפרנציאליות. הערכה זו היתה תמונה באמצעות תוכנת דימות כדי לפתח וידאו לפקיעה מרובה נקודות.

הדמיה הזמן 2D דימות של פעילות Phagocytic ב-M1 מקרופאג-4T1 עכבר קרצינומה של החלב תאים במשותף תרבויות

פרוטוקול זה מתאר את הדור החזק של מקרופאגים מתאי גזע המושרה האדם pluripotent ושיטות לאפיון הבאים שלהם. ביטוי לסמן תא המשטח, ביטוי הגנים, ומוסר פונקציונלי משמשים כדי להעריך את הפנוטיפים ואת התפקוד של מקרופאגים הנגזרות iPSC.

הפקה ואפיון של מקרופאגים האדם מ Pluripotent תאי גזע

פרוטוקול זה מספק שיטה לעכל עיניים שלמות לתוך השעיית תא יחיד לצורך ניתוח ציטומטרי זרימה רב-פרמטרית על מנת לזהות אוכלוסיות פיגוציטיות מונונוקולריות עיניות ספציפיות, כולל מונוציטים, מיקרוגליה, מקרופאגים ותאים דנדריטיים.

עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים

מחלות ניווניות קשורות לתפקודי מיקרוגליה דיסרגטיים. מאמר זה מתאר במבחנה של פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה על ידי iPSC-מקרופאגים. קריאות מיקרוסקופיה כמותית מתוארות הן עבור הדמיה בזמן-זמן של תאים חיים והן עבור הדמיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים.

במבחנה הדמיה כמותית אסאי עבור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים על ידי iPSC-מקרופאגים

כאן, אנו מתארים בפירוט שיטות לחילוץ מקרופאגים ממח העצם, הטחול והלב האוטם, ולאחר מכן הערכת שטף מטבולי בתאים חיים.

ניתוח שטף מטבולי ex vivo במקרופאגים של הטחול והלב, ומונוציטים של מח העצם

למד שיטת תרבית משותפת לכימות פאגוציטוזה במקרופאג'ים תחת ויסות של תאי גזע מזנכימליים באמצעות חלקיקים פלואורסצנטיים רגישי pH. הטכניקה מספקת כלי אמין לחקר מנגנוני החסינות המולדת ומאפשרת ניתוח בתפוקה גבוהה.

ויסות תאי גזע מזנכימליים של מקרופאג' פאגוציטוזיס; כמות והדמיה

גלה סרטונים נוספים