In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים
20 בנובמבר 2021
פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.
מטרת הליך זה היא להעריך את ארגון המיקרוטובלים ואת הדינמיקה ב- vivo. נוירונים הם תאים מקוטבים עם תאים אקסונליים, דנדריטיים וסינפטיים מובהקים, המתוחזקים על ידי הציטוסקלטון הבסיסי שלהם. Microtubules מהווים את רוב הציטוסקלטון העצבי, והדינמיקה והכיוון קובעים אירועים מרכזיים במהלך התפתחות עצבית והבשלה.
מיקרוטובולות מורכבות מהטרודימרים אלפא ובטא טובולין, ומקוטבות מטבען עם קצוות פלוס דינמיים מאוד ומינוס-קצוות יציבים. במהלך פילמור בקצוות פלוס, קומפלקס רב מולקולרי של חלבונים מחייבי קצה, לקשר ארעי עם protofilaments ולקדם את ההרכבה של dimers טובולין. טכניקה זו תעזור לנו לדמיין מיקרוטובולות עצביות ב vivo.
באמצעות טכניקה זו, ניתן לקבוע את הכיוון ופרמטרים אחרים של microtubules דינמי במהלך פיתוח והתחדשות של נוירון C.elegans. אנחנו בדרך כלל משתמשים בכתב הזה כדי לדמיין דינמיקה של מיקרוטובול בתאי עצב חושיים. עם זאת, ניתן לבטא כתב זה בסוגי תאים אחרים כגון שרירים ועור כדי לדמיין microtubules דינמי בתאים אלה.
חלבונים מחייבי קצה המסומנים באופן פלואורסצנטרי כמו EBP ל- GFP כאן, מופיעים כחליטים. הדינמיקה של שביטים אלה הייתה מתואמת עם צמיחה בו-חופית של המיקרוטובולות, ומחוון מפתח לאמוד דינמיקה וכיוון מיקרוטובולה. על מנת להתבונן בשביטים אלה בסוג תא מסוים, טרנסג'ן עם DNA של EBP-2 ו- GFP באים לידי ביטוי תחת מקדם ספציפי.
לביטוי בתאי העצב PLM, טרנסג'ן זה בא לידי ביטוי תחת להפוך עבור מקדם. תולעים מהונדסות אלה ניתן לראות תחת מיקרוסקופ סטריאו, עם פלואורסצנטיות להגדיר לפני מיון או הרכבה. עבור הרכבת התולעים עבור הדמיית שביט EBP, אנו עושים 10% ארגוס במאגר M9.
ומניחים טיפה על מגלשת זכוכית. שקופית נוספת משמשת ללחץ על הירידה לתוך סרט שמתמצק לתוך כרית. אנו משתמשים 0.1 מיקרון, חרוזי פוליסטירן כאמצעי הרכבה, כמה תולעים נקטפות ומושעות מחדש בתמיסת החרוזים.
פתק כיסוי הוא שלוק כדי לשתק את התולעים ונלקח להדמיה. ניתן לדמיין את אלה המותקנים על כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מצלמה להדמיה ברזולוציה גבוהה. ההתקנה מצוידת ביחידת דיסק מסתובבת לרכישה מהירה יותר והלבנת תמונות מופחתת ורעילות תמונה.
השקופית נשמרת על הבמה ושדה התולעים ממוקד ומרוכז באמצעות תאורת השדה הבהיר. מטרה בהגדלה נמוכה כמו 5X או 10X יכולה לשמש למטרה זו. ניתן להתמקד מחדש בתולעים במטרה להגדלה גבוהה כמו 63X באמצעות אותה תאורה.
מטרה זו מספקת רזולוציה מרחבית אופטימלית להדמיית השביטים. ריכוז קבוע של נוירון PLM נעשה תחת תאורת הפלואורסצנטיות כדי למנוע חשיפה מופרזת לאור והלבנת תמונה של ה- prum. לרכישת התמונה בה אנו משתמשים לשלוח תוכנה מאתרים.
באמצעות תצורת הדמיה חיה בערוץ Brightfield, אנו ממקדים את אזור הזנב של התולעת ומרכזים אותה בשדה התצוגה. זה ואחריו התמקדות של נוירון PNM באמצעות תצורת הדמיה קלה עם 488 ננומטר עירור אור. עבור רכישה של זמן-לשגות, נוצרת הגדרה ניסיונית שבה זמן החשיפה, משך הזמן לשגות והמרווח בין המסגרות מגדירים את כישורי הזמן של ההדמיה.
עבור מדידות כמותיות חלק מהסרטים של כוכבי שביט EBP יש לנתח על תמונה J, שהיא תוכנת קוד פתוח. זמן ההפסקה שנרכשה נפתח כגדיל מרובה תמונות, שניתן להציג בתצוגה מקדימה כסרט. בעידן מסוים זה, ניתן לראות שביטים בגוף התא, בתהליך הקדמי והאחורי של נוירון PLM.
כוכבי השביט שמתרחקים מגוף התא מסווגים כ"פלוס-סוף החוצה", ואלה הנעים לכיוון גוף התא מסווגים כ"מינוס-סוף החוצה". כדי להתחיל את הניתוח קו מקוטע נמשך על פני אזור העניין, אשר במקרה זה הוא התהליך הפנימי של נוירון PLM. מקטע קו זה מומר לקימוגרף באמצעות פונקציית השריד של תמונות.
קימוגרף הוא תמונת זמן מרחוק עם קמטים אלכסוניים המייצגים את כוכב השביט הנע. ניתן לצייר מקטעי קו ישר במעקבים אלה וניתן להגדיר פרמטרי מדידה באמצעות תפריט הניתוח. ניתן להמיר פרמטרים אלה לכמויות ויחידות הניתנות למדידה רגילות בתוכנית ניתוח הנתונים כגון Excel.
רוחב המעקב תואם את אורך הצמיחה. הרמה מייצגת את משך הצמיחה, וזווית הקמט נותנת את כיוון השביט. שביטים אלה יכולים להיות מסווגים עוד יותר לתוך פלוס-סוף החוצה ומינוס סוף החוצה, כדי למצוא את הכיוון היחסי של microtubules.
ביטוי מהונדס של EBTA GFP יכול להיות מותאם להתבונן בדינמיקה microtubule בהקשרים תאיים שונים, כגון התחדשות חדשה. כדי לבחון את הדינמיקה של המיקרוטובלים באזור דירוג אקסונים, האקסון נפגע באמצעות לייזר פמטו-שניות, אשר יכול לנתק את האקסון בדיוק מבלי לגרום נזק משני מסיבי. בעקבות הפציעה, ניתן לשחזר את התולעים על לוחות מנוע זרעים לתצפיות מאוחרות יותר.
נוירונים PLM להראות התחדשות אקסונרית חזקה, אשר ניתן לראות כבר שש שעות לאחר הפציעה. כדי למנוע פוטוטוקסיה ליצירה מחדש של זכויות חדשות, הדמיה חיה מתבצעת במיקרוסקופ דיסק מסתובב. רכישות בזמן לשגות של האקסונים המתחדשים ניתן להמיר מאוחר יותר לקימוגרפים לניתוח של שביט.
לאחר מכן ניתן לפרש את משך המרחק והכיוון של כוכב השביט במונחים של אוריינטציה ודינמיקה של מיקרוטובול. הכיוון והדינמיקה הקריטיים שלי הם קובעי מפתח של תהליכים תאיים אזרחיים כמו חלוקת תאים, הגירה ותחזוקה של ארכיטקטורה סלולרית. למרות שיש כלים רבים זמינים למדידה של דינמיקת microtubule במדידת vivo יכול להיות מאתגר.
פלופרחות אוטומטית, רעילות תמונה, חפץ ביטוי יתר ועוצמות מדווחות משתנות הם חלק מהקשיים בהם נתקלו במהלך התבוננות חיה בחלבונים מחייבי קצה, כדי להעריך את הדינמיקה של המיקרוטובול. על ידי שימוש מהונדס משולב עם ריכוז נמוך של DNA מגורש והדמיה תאורה נמוכה, מחקר זה התייחס שיטות כדי למתן חלק מהאתגרים האלה. מודולי ההדמיה והניתוח המתוארים כאן יכולים להיות מורחבים כלפי כתבים מבוססי מיקרוטובולות אחרים והובלת חלבונים.
זה לא חל רק על נוירונים C.elegance, אבל ניתן להחיל על סוגי תאים אחרים ומערכות מודל.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לצילום חי של מיקרוטובולים דינמיים באמצעות חלבון קישור סוף (EBP) מסומן בפלואורסצנטיות בנוירון מיקרוטובולים רוחבי צדדי קדמי (PLM) של C. elegans. הפרוטוקול נועד לדמיין את הדינמיקה של המיקרוטובולים, ומאפשר לחוקרים להעריך את הכיוון וההתנהגות של מבני השלד התאי הללו במהלך התפתחות ושיקום עצבי.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- דינמיקה של השלד התאי
- צילום פלואורסצנטי
רקע
- מיקרוטובולים הם חלק בלתי נפרד מהמבנה והתפקוד העצבי, ומשפיעים על התפתחות והתבגרות.
- הם מורכבים מטובולין אלפא ובטא ומציגים התנהגות דינמית חיונית לתהליכים עצביים.
- חלבוני קישור סוף ממלאים תפקיד מכריע בקידום הרכבת המיקרוטובולים והדינמיקה שלהם.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לדמיין את הדינמיקה של המיקרוטובולים חי.
- לנתח את התנהגות המיקרוטובולים במהלך התפתחות עצבית ושיקום ב-C. elegans.
- להתאים את הטכניקה לשימוש בסוגי תאים שונים מעבר לנוירונים.
שיטות ששימשו
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם יחידת דיסק מסתובבת שימשה לצילום.
- C. elegans שימשה כמודל ביולוגי, תוך התמקדות בנוירונים PLM.
- שימוש בביטוי טרנסגני של EBP-2 המותך ל-GFP לצורך סימון.
- תולעים הורכבו באמצעות כדורי פוליסטירן ונצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- צילום זמן-חלף וניתוח בוצעו באמצעות ImageJ למדידות כמותיות של דינמיקת המיקרוטובולים.
תוצאות עיקריות
- השביטים שנצפו מייצגים מיקרוטובולים דינמיים, כאשר התנועה מסווגת כ-plus-end-out או minus-end-out.
- השיטה אפשרה הערכת כיוון הגידול, המשך והדינמיקה של המיקרוטובולים, במיוחד לאחר פגיעה באקסונים.
- התצפיות הצביעו על שיקום חזק של האקסונים עם דפוסים ברורים של כיוון המיקרוטובולים.
מסקנות
- מחקר זה מאפשר ויזואליזציה וניתוח של דינמיקת המיקרוטובולים בנוירונים, ומקדם את ההבנה של ההתנהגות העצבית במהלך התפתחות ותגובות לפציעה.
- לממצאים יש השלכות לחקר מנגנונים עצביים ופלסטיות בהקשרים ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding microtubule dynamics in neurons provides critical insights into axonal integrity and regeneration, which are central to neurodegenerative disease mechanisms and neuroprotective target validation. This in vivo assay enables quantitative assessment of cytoskeletal behavior, supporting early-stage hypothesis testing in neuronal health and repair pathways. The approach offers a scalable, genetically tractable system for de-risking targets involved in cytoskeletal regulation and neuronal resilience.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microtubule orientation and dynamics as functional readouts for target engagement in neuronal models.
- Operational Value: Provides a quantitative, imaging-based assay to assess compound effects on axonal microtubule behavior in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantitative readouts of microtubule growth direction and dynamics via comet analysis in kymographs.
- Operational Value: Establishes a standardized, adaptable platform for live imaging that can be applied across genetic backgrounds and neuronal subtypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking microtubule dynamics to axonal regeneration outcomes following injury.
- Operational Value: Facilitates longitudinal assessment of repair processes, enabling predictive modeling of neurotherapeutic efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional cytoskeletal readouts that inform target validation and lead optimization in neuroscience programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microtubule-regulating targets through direct visualization of plus-end dynamics in axons.
- Screening: Enables assay-ready systems with quantifiable outputs (comet trajectory, orientation) for compound screening in neuronal models.
- Analytics: Generates measurable parameters (growth velocity, duration, direction) from kymograph analysis to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects dynamic microtubule behavior to regenerative capacity, supporting continuity from hit identification to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: The transgenic reporter system can be redeployed across cell types and disease models, enhancing platform sustainability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking molecular perturbations to functional cytoskeletal outcomes in neurons.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible imaging protocols with minimal variability through controlled mounting and low-phototoxicity acquisition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-based biomarkers of axonal health and regenerative potential.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in cytoskeletal stability and neuronal repair mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic C. elegans handling, fluorescence microscopy, and kymograph-based image analysis.
- Dependent on spinning disk confocal or equivalent high-speed, low-phototoxicity imaging systems for longitudinal studies.
- Necessitates standardization of promoter-driven expression and mounting protocols across labs for reproducible comet detection.
- Adaptation to other cell types requires validation of promoter specificity and microtubule reporter compatibility.
- Practical limitations include potential overexpression artifacts and photobleaching, mitigated by low-expression transgenes and controlled illumination.
