Name: In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: למד הערכת דינמיקת מיקרוטובולות וכיווניותן בנוירונים של Caenorhabditis elegans באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה וחלבון EBP מתויג ב-GFP. שיטה זו מאפשרת ניתוח התנהגות מיקרוטובולות במהלך התפתחות עצבית ותהליכי התחדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לישי ג'ין ואנדרו צ'יזהולם על התמיכה הראשונית והמתח ששימש במחקר. זן החיידקים OP50 היה הועיל מסחרית מהמרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC) במימון משרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). אנו מודים גם לדהרמנדרה פורי על התקינה של ההליכים הניסיוניים. המחקר ממומן על ידי מענק הליבה של המרכז הלאומי לחקר המוח (נתמך על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה, הממשלה של הודו), מענק קריירה מוקדמת של ברית הודו DBT/Wellcome Trust India (מענק # IA/E/18/1/504331) ל- S.D., מענק הביניים של ברית ברית הודו של Wellcome Trust-DBT (מענק # IA / IA / I/13/1/500874) ל- A.G.-R ומענק מוועדת המחקר המדעי וההנדסי (SERB: CRG/2019/002194) ל-א.ג.-ר

1. זן עיתונאי: תרבות ותחזוקה
הערה: כדי למדוד את הדינמיקה microtubule ואת הכיוון נוירונים PLM, השתמשנו בזן התולעת מבטא EBP-2::GFP תחת נוירון מגע ספציפי מקדם mec-4 (juIs338 allele)18,25,26. אנו משתמשים בתרבית תולעים סטנדרטית ושיטות תחזוקה עבור זן זה27.
<ol><li>הכן את מדיום הצמיחה של נמטודה (3.0 גרם/ליטר נתרן כלורי, פפטונה 2.5 גרם/ל', 20.0 גרם/ליטר אגר, 10 מ"ג/ל' כולסטרול (מדולל מתמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל)) במים ומחלק אוטומטית את התערובת.</li>
	<li>מצננים את התערובת בקצרה במשך 10-15 דקות לפני ההשלמה עם 1 mM סידן כלורי, 1 mM מגנזיום סולפט ו 25.0 mM אשלגן פוספט pH מונובסי 6.0.</li>
	<li>יוצקים סביב 9 מ"ל של התערובת לתוך 60 מ"מ פטרי מנות באמצעות מתקן סטרילי ואחריו אחסון בטמפרטורת החדר ותנאים סטריליים ליום ואחסון לאחר מכן ב 4 °C (50 °F).</li>
	<li>הכן 50 מ"ל של מרק B (5.0 גרם / L נתרן כלורי, 10.0 גרם / L Bacto-טריפטון), autoclave ולקרר אותו לפני חקינה עם מושבה אחת של Escherichia coli (זן OP50).</li>
	<li>תרבית החיידקים ב 37 °C (50 °F) במשך 12 שעות. הביאו את לוחות ה-NGM בקירור לטמפרטורת החדר לזריעה ושימוש בממרח זכוכית מעוקר הופכים את ההדבקה של חיידקי OP50 על צלחת ה-NGM.</li>
	<li>שמור על לוחות NGM מחוסנים ב 37 °C (50 °F) במשך 12 שעות, אשר יאפשר היווצרות של דשא חיידקי עבור culturing של C. elegans. צלחות אלה ניתן לאחסן בחממה 20 °C עד השימוש.</li>
	<li>תחלקו את הזן הטרנסגני על לוחות הגז הטבעיים.</li>
	<li>עקר תיל פלטינה על להבה ובחר 20-25 הרמפרודיטים בוגרים gravid להעברה לצלחת זרעים טריים.</li>
	<li>לאחר ההעברה, להעביר את הצלחת לאינקובטור 20 °C במשך 1 שעה. לאחר מכן, לחלץ את המבוגרים מן הצלחות האלה. צלחות אלה יכילו כעת ביצים המותאמות לגיל.</li>
	<li>להעביר את הצלחות לחממה 20 °C לגידול עד שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי של עניין אשר במקרה זה הוא שלב L4 ב 43.5 שעות לאחר הטלת ביצה. לתולעים נוספות, יש כוויות מרובות אחוריות כדי להימנע מצפיפות.</li>
	<li>בשלב ההתפתחותי הרצוי, תולעים אלה ניתן להרכיב עבור הדמיה של שביט EBP-2::GFP.</li>
</ol>2. הכנת מדגם: הרכבה של תולעים להדמיה של שביט EBP-2
הערה: כדי לאפשר תצפית חיה של שביט EBP בתאי העצב PLM, הרכבנו את התולעים על רפידות אגרוז כדי למזער את הניידות שלהם מבלי להתפשר על הפיזיולוגיה של הנוירון. בין שיטות immobilization השונות, בחרנו 0.1 מיקרומטר פתרון חרוזים פוליסטירן זמין מסחרית. תיארנו את הליך ההרכבה המשמש במיוחד עבור EBP-2:: GFP תצפית.
<ol><li>הכן פתרון של 10% אגרוז על ידי המסת 0.2 גרם של אגרוז ב 2 מ"ל של 1x M9 חוצץ (0.02 M KH2PO4, 0.02 M Na2HPO4, 0.008 M NaCl, 0.02 M NH4Cl) במבחנת זכוכית 5 מ"ל מעל להבה. מבחנה זו יכולה בקלות להתאים לבלוק חימום אשר שומר על agarose במצב מותך עד השימוש.</li>
	<li>באמצעות טפטפת רחבת פה, לחלק טיפה (סביב 100 μL) של אגרוז מותך זה מעל שקופית זכוכית נקייה של 35 מ"מ x 25 מ"מ מידות.</li>
	<li>בעוד זה במצב מותך, לחץ על הטיפה עם שקופית זכוכית אחרת כדי ליצור סרט דק של agarose בין שקופיות הזכוכית. האגורוז מתמצת כסרט בעובי של כ-0.5 עד 1.0 מ"מ בתוך כ-30 שניות.</li>
	<li>ברגע שהאגורז מתמצק, החזק את השקופית התחתונה ביד הלא דומיננטית ואת החלק העליון ביד הדומיננטית. הפוך את השקופית העליונה תוך החזקת השקופית התחתונה יציבה וכתוצאה מכך משטח האגורוז נדבק לאחת משתי השקופיות.</li>
	<li>אם כרית אגרוז שנוצר גדול יותר מגודל כיסוי (18 מ"מ x 18 מ"מ), ואז לקצץ את הקצוות של כרית כדי לקבל את הממדים הנדרשים כדי להבטיח מיקום נכון של כיסוי. רפידות אגרוז אלה מיועדות לשימוש מיידי ולא להיות מאוחסנות.</li>
	<li>בדוק חזותית את כרית האגורוז למשטח חלק שהם לחים ומתאימים להרכבה. אם כרית האגורוז נחשפת לאוויר ומתייבשת, פני השטח של כרית האגורוז נראים מקומטים. בתרחיש כזה, להכין כרית אגרוז טרי כאמור בשלבים 2-6 של סעיף זה.</li>
	<li>על כרית אגרוז, לשים 2 μL של 0.1 מיקרומטר פתרון חרוז פוליסטירן כאמצעי הרכבה.</li>
	<li>בחר 3-4 תולעים באמצעות פיק חוט פלטינה ולהעביר אותם על צלחת NGM לא מנוצל. תהליך זה מבטיח הסרה של חיידקי פני השטח המעכבים את ההשתקה במהלך הרכבה.</li>
	<li>ברגע שהתולעים זוחלות מתוך חיידקי פני השטח שלהן, הרימו אותן להרכבה באמצעות תיל פלטינה וחילצו אותן מחדש בטיפת חרוזי פוליסטירן על כרית האגורוז.</li>
	<li>בזהירות, מניחים כיסוי 18 מ"מ x 18 מ"מ על התולעים. כדי למנוע הוצאת המעיים של התולעים המותקנות, אל תזיז את כיסוי לאחר המיקום.</li>
	<li>הר את השקופית המוכנה על המיקרוסקופ להדמיה.</li>
</ol>3. הגדרת ורכישה הדמיה
הערה: שביט EBP לנסוע במהירות משוערת של 0.22 מיקרומטר/s כפי שנצפו בנוירונים יונקים ו PLM של C. elegans16,18. כדי לדגום באופן אופטימלי את האירועים ברכישה בזמן לשגות לפי קריטריוני Nyquist28, סולמות מרחביים וטמפורליים של 0.09 מיקרומטר ו 0.43 s, בהתאמה, נדרשים. למניעת פוטוטוקסיה או להלבנה, השתמשנו ברכישת ספינינג דיסק. תיארנו את הגדרות הגדרת ההדמיה והרכישה שלנו להלן.
<ol><li>לכוד את התמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד ביחידת דיסק מסתובבת ומצלמה. הפעל את ההתקנה בהתאם להוראת היצרן.</li>
	<li>הפעל את התוכנה השולטת בהתקנה.</li>
	<li>מכיוון שמדובר במיקרוסקופ הפוך, הנח את השקופית עם התולעים המותקנות על הבמה עם יעד הגדלה נמוך (פי 5 או 10x) כאשר כיסוי הפנים כלפי מטה.</li>
	<li>הגדר את נתיב האור לעין או מצב גלוי המשתמש בתאורה מנורת הלוגן עבור אור מועבר ומנורת קשת כספית לאור משתקף.</li>
	<li>התמקד ומרכז תולעת בשדה התצוגה מתחת לברייטפילד.</li>
	<li>שים את שמן הטבילה ושנה את ההגדלה ל-63x (1.4NA/שמן) ומיקד מחדש את זנב התולעת בשדה הבהיר עבור הנוירונים PLM.</li>
	<li>הפעל את הפלואורסצנטיות של מנורת קשת הכספית למיקוד מחדש קצר של נוירוני PLM. מקם את ערכת מחזירי ההשתקפות הנכונה (AF488) בנתיב האור להדמיה של GFP.</li>
	<li>הגדר את המיקרוסקופ לרכישת המצלמה על-ידי הפניית נתיב האור למצלמה. הערה: שליטה בשלבים הנ"ל 4-7 באמצעות מסך טרנזיסטור הסרט הדק (TFT) של המיקרוסקופ היא מהירה ומונעת חשיפה מיותרת לתאורה. לחלופין, לשלוט בתאורה, רפלקטור באמצעות התוכנה.</li>
	<li>לאחר המיקוד של נוירון PLM בשדה התצוגה, בממשק התוכנה לבחור את התאורה של לייזר 488 ננומטר עם 30% כוח וחשיפה 300 ms עבור המצלמה עם אלקטרון רבייה (EM) להשיג ערך 70. בהתאם לביטוי הכתב, שנה פרמטרים אלה כנדרש. אחסן את ההגדרות כתצורה עבור הפעלות הדמיה עוקבות.</li>
	<li>הכרטיסיה ערוצים מאחסנת את הרצועות כל אחת עם הגדרת תאורה ומצלמה ספציפית. הרצועה המסומנת מאפשרת תצוגה חזותית חיה ואילו לרכישת תמונה יש לסמן את הרצועה. סמן ערוץ עם Brightfield (DIC) להמחשה חזותית חיה של זנב התולעת בסביבת העבודה. המדגם ממוקד וממורכז בחלון ההדמיה החיה של סביבת העבודה.</li>
	<li>הדגש את הערוץ עם עירור לייזר 488 ננומטר למיקוד מהיר של נוירון PLM בחלון ההדמיה החיה. לאחר התמקדות, התחל את הזמן לשגות רכישה על ידי הגדרת הפרמטרים סידרת הזמן כפי שהוזכר בשלב הבא.</li>
	<li>באמצעות תאורת לייזר של 488 ננומטר, קבע ניסוי בסדרת זמן למשך 2 דקות וללא מרווח זמן בין מסגרות. כדי לשמור על סולמות הזמן של רכישת תמונה, רכשנו רק פלואורסצנטיות GFP בלבד.</li>
	<li>באמצעות הכרטיסיה התחלת ניסוי, התחל את הרכישה. שימוש בהגדלה של פי 63 מגביל את הרזולוציה המרחבית ל- 0.21 מיקרומטר הנדגמת על-ידי המצלמה בגודל פיקסל של 0.09 מיקרומטר. השג זמן לשגות ב 3.3 פריימים/s עבור דגימה אופטימלית של האירוע. לתמונת הזמן לשגות היו 396 מסגרות זמן שנרכשו במשך 2 דקות. לאחר הרכישה, שמור את התמונה בתבנית ברירת המחדל, שאליה ניתן לגשת מאוחר יותר על-ידי תוכנת ברירת המחדל או ImageJ.</li>
</ol>4. התבוננות וניתוח
<ol><li>הצג בתצוגה מקדימה את רכישת timelapse בתוכנת ברירת המחדל או פתח אותה בתמונה J באמצעות תוסף Bioformats שלה. הערה: תיארנו את תהליך ניתוח התמונה בתמונה J.</li>
	<li>התקן את יישום התוסף של Bioformats ImageJ.<ol>
<li>לחלופין, יצא את קובץ התבנית המוגדר כברירת מחדל .tif לתאימות קבצים ב- ImageJ. פונקציית הייצוא ב-ZEN2 גורמת למסגרות בודדות של התמונה כקבצי .tif נפרדים. אנו נמנעים משיטת זה כדי למנוע היווצרות של מספר רב של קבצים.</li>
	</ol></li>
	<li>פתח את התמונה בתבנית '.czi' ישירות בתמונה J באמצעות תוסף 'Bioformats' שלה. התמונה נפתחת כערימה מרובת תמונות. אם אתה משתמש בפונקציה "ייצוא" של תוכנת ברירת המחדל, ולאחר מכן ערוך מחדש את התמונות כערימה מרובת תמונות באמצעות זרימת העבודה הבאה ב- ImageJ: ImageJ Program > תפריט תמונה > תפריט המשנה ערימות > תמונות לערום.</li>
	<li>הצג את התמונה בתצוגה מקדימה כסרט באמצעות סמל הפעל בפינה הימנית התחתונה של חלון התמונה. שביט ניתן לראות כמו punctae נייד בהיר בגוף התא ותהליכים של נוירון PLM. אם כוכב השביט גלוי בבירור, המשך לשלב 8 אחרת בצע את שלבים 5-7 של סעיף זה.</li>
	<li>המרת פרופיל הצבע של התמונה באמצעות טבלת בדיקת מידע (LUT) לתמונה בגווני אפור: תוכנית ImageJ > תפריט תמונה > תפריט המשנה טבלאות בדיקת מידע > בחירת אפורים.</li>
	<li>היפוך פרופיל LUT של התמונה לפריט חזותי קל: תוכנית ImageJ > תפריט תמונה > תפריט המשנה טבלאות בדיקת מידע > הפוך LUT.</li>
	<li>כוונן את הבהירות ואת הניגודיות של התמונה לצפייה בסבכי: תוכנית ImageJ > תפריט תמונה > התאמת תפריט המשנה > בהירות/ניגודיות.<ol>
<li>הזז את המחוונים של מינימום, מקסימום, בהירות וניגודיות לקבלת קנה המידה הרצוי של החוצמות לאורך התמונה. כימתנו את התמונות עם שביטים הנראים בבירור.</li>
	</ol></li>
	<li>הגירסה הבסיסית של ImageJ כוללת כלי אתחול המיוצגים כסמלים. אתר את הסמל באמצעות שורה עם שורה ולחץ עליו באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לפתוח תפריט נפתח ולבחור את השורה 'מקוטעת'. צייר את הקו המפולח על אזורי העניין (ROI) עם מקורו על או ליד גוף התא של הנוירון.<ol>
<li>לשיקולים מאוחרים יותר, שמור את ההשערה על השורה המפולחת באמצעות מנהל ההשערות באמצעות זרימת העבודה הבאה: ImageJ > לנתח > > מנהל ההשערות > > בחר את המעקב המצויר בתמונה ולחץ על הוסף בחלון מנהל ההשערה > עוד בחלון מנהל ההשערה > שמור.</li>
	</ol></li>
	<li>לפני יצירת הקימפוגרף, כאשר הסולמות המרחביים והטמפורליים שונים להסיר את קנה המידה כדי להשיג את המדידות בפיקסלים באמצעות הבאים: > ניתוח > קבע קנה מידה > לחץ כדי להסיר > קנה מידה אישור.</li>
	<li>באמצעות הפונקציה Reslice תחת התפריט הנפתח תמונה > ערימות, צור קימוגרף. הקימוגרף הוא ייצוג של ההשערות המפולח בזמן. הציר האופקי מייצג את המרחק והציר האנכי מייצג את השעה. העקבות האלכסוניים מייצגים את כוכב השביט הנע. בדרך כלל, הקימולוגרפיה לוקחת את פרופיל הצבע של התמונה אחרת להקצות פרופיל צבע כמתואר בשלבים הקודמים 5-6 עבור תצוגה חזותית של עקבות אלכסוניים.</li>
	<li>באמצעות הפונקציה קו ישר בתפריט הנפתח של הכלי Line (עיין בשלב 9 של מקטע זה) צייר קווים ישרים מעל כל אחד מהמעקבות האלכסוניים וצרף אותם למנהל ההשערות.</li>
	<li>תחת הכרטיסיה ניתוח, עבור אל הגדרת מדידות ובחר פרמטרים של עוצמה ממוצעת ומלבן תוחם למדידת המעקבים.</li>
	<li>בחלון מנהל ההשערה, לחץ על מדידה שתפתח חלון תוצאה אשר יניב את העוצמה הממוצעת של ROI, קואורדינטות X ו- Y של עקבות הקו, רוחב, גובה, זווית ואורך של עקבות הקו. ניתן לשמור חלון זה כתבנית .csv ולאחר מכן לייבא אותו לתוכנית ניתוח נתונים.</li>
	<li>בתוכנית הגיליון האלקטרוני, חלון התוצאות נפתח עם הערכים המופצים בשורות ובעמודות. הערכים הרלוונטיים הם הרוחב, הגובה והזווית של המעקבים. הרוחב מעניק את ההעתקה של המעקב, הגובה נותן את משך הזמן והזווית מייצגת את הווקטור. כאשר ערכי הרוחב והגובה נמצאים בפיקסלים, הכפל אותם עם הסולמות המרחביים והטמפורליים, בהתאמה, לקבלת הפרמטרים הניתנים למדידה הסטנדרטיים.</li>
	<li>כמו הצד השמאלי של הקימוגרף הוא קרוב לגוף התא, בהתאם לזווית, לסווג שביט לתוך פלוס-סוף החוצה או מינוס סוף החוצה (כלומר, הרחק מגוף התא או לכיוון גוף התא, בהתאמה). לסווג זוויות בין 1° ל- -89° ו- -91° עד -179° כ- plus-end-out ו- minus-end-out, בהתאמה. איסוף נתונים מקימאוגרפים מרובים בגיליון אלקטרוני למחקר ומייצגים סטטיסטית.</li>
</ol>

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

הבנת הדינמיקה של המיקרוטובלים הייתה מוקד מרכזי בתחום חקר הציטוסד לאורך השנים. Microtubules לעבור התגרענות וקטסטרופה יחד עם תהליך מתמשך של חוסר יציבות דינמית44,45,46,47. הרבה מידע זה הושג באמצעות מבינות כמו קריאות פיזור אור של טובולין חופשי לעומת פולימרי, בדיקות צמיחה microtubule מ טובולין פלואורסצנטי, וכו'48. בעוד שהתצפית החיה של מיקרוטובולות...

לנוירונים יש ארכיטקטורה משוכללת עם תאים מיוחדים כמו דנדריטים, גופי תאים, אקסונים וסינפסות. הציטוסקלטון העצבי מורכב מהמיקרוטובולות, המיקרופילמנטים והנוירופילמנטים והארגון הייחודי שלהם תומך בתאים העצביים מבחינה מבנית ותפקודית1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . במהלך השנים, ארגון microtubule זוהה כגורם מכריע של קוטביות עצבית ותפקוד. כאשר נוירונים עוברים שיפוץ מבני במהלך הפיתוח או ההתחדשות, הדינמיקה והכיוון של microtubule קובעים את הזהות, התחבורה המקוטבת, הצמיחה והפיתוח של תאים עצביים שונים7. לכן, חובה להעריך את הדינמיקה והכיוון של המיקרו-קוטביות ב-vivo כדי לתאם עם תהליך השיפוץ העצבי.
Microtubules מורכב פרוטופילמנטים של הטרודימרים α β טובולין עם קצוות פלוס דינמיים ומינוס יציב יחסית מסתיים11,12. גילוי קומפלקס הקצה פלוס וחלבונים מחייבים הקשורים לקצה אפשרו פלטפורמה להעריך את ארגון microtubule13. חלבונים מחייבים בסופו של דבר (EBP) מקשרים באופן ארעי עם הקצוות הגדלים פלוס של microtubule ואת הדינמיקה עמותה מתואמים לצמיחה של protofilaments microtubule14,15. בשל שיוך תכופים וניתוק של קומפלקס קצה פלוס עם microtubule, פונקציית התפשטות הנקודה של GFP מתויג EBP מופיע כמו "כוכב שביט" בסרט timelapse15,16. מאז התצפית החלוצית בתאי העצב של היונקים16, חלבונים מחייבים בסופו של דבר מתויגים עם חלבונים פלואורסצנטיים שימשו לקביעת דינמיקת microtubule על פני מערכות מודל שונות וסוגי נוירונים17,18,19,20,21,22,23.
בשל מערכת העצבים הפשוטה שלה הגוף השקוף, C. elegans הוכיח להיות מערכת מודל מעולה ללמוד שיפוץ עצבי במהלך פיתוח והתחדשות ב vivo. כאן אנו מתארים שיטות לתיוג, תמונה וניתוח הדינמיקה והצמיחה של המיקרוטובלים במהלך הפיתוח וההתחדשות של נוירוני מגע ב- C. elegans. באמצעות EBP-2::GFP מקודד גנטית, צילמנו את המיקרוטובולות בנוירון PLM, מה שאיפשר לנו לקבוע את הקוטביות של המיקרוטובולות בשני נוריטים שונים של הנוירון הזה24. שיטה זו מאפשרת התבוננות וכימות של שביט EBP כמדד לדינמיקת מיקרוטובול בהקשרים תאיים שונים, לדוגמה, ניתן להעריך את השינויים המקומיים בהתנהגות המיקרוטובלים היוזמת התחדשות אקסון בעקבות אקסוטומיה באמצעות הפרוטוקול שלנו. בדיקה זו יכולה להיות מותאמת כדי לחקור את הרגולציה של דינמיקת microtubule בתהליכים תאיים שונים בסוגי תאים מגוונים ורקעים גנטיים.

<table><tbody><tr><td>CZ18975 זן תולעת</td><td>Yishi Jin מעבדה</td><td>CZ18975</td><td>נוצר על ידי Anindya Ghosh-Roy</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>תולעי הרכבה</td></tr><tr><td>Coverslip (18 מ"מ x 18 מ"מ)</td> <td>Zeiss</td><td>474030-9010-000</td><td>תולעי הרכבה</td></tr><tr><td>אמבטיה יבשה עם בלוק חימום</td><td>Neolab</td><td></td><td>תולעי הרכבה</td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית (35 מ"מ x 25 מ"מ)</td> <td>כוכב</td><td></td> <td>כחולתולעים הרכבה</td></tr><tr><td>תמיסת חרוזי פוליסטירן (4.55 x 10^13 חלקיקים/מ"ל במדיום מימי עם חומר פעילי שטח מינימלי)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876</td><td>תולעים הרכבה</td></tr><tr><td>מבחנות מבחנות</td><td></td><td></td><td>תולעים הרכבה</td></tr><tr><td>OP50 זן חיידקי</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td> <td>OP50</td><td>טיפול בתולעים</td></tr><tr><td>60 מ"מ לוחות פטרי</td><td>Praveen Scientific</td><td>20440</td><td>שואב טיפול בתולעים</td></tr><tr><td>/ נימי</td><td>VWR</td><td>53432-921</td><td>חממה לטיפול בתולעים</td></tr><tr><td></td><td>Panasonic</td><td>MIR554E</td><td>טיפול בתולעת</td></tr><tr><td>חוט</td><td></td><td></td> פלטינה <td>טיפול בתולעת</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ עם חיבור פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td>טיפול בתולעים</td></tr><tr><td>0.3% נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>71376</td><td>גידול נמטודות בינוני</td></tr><tr><td>0.25% פפטון</td><td>T M מדיה</td><td>1506</td><td>נמטודה גידול בינוני</td></tr><tr><td>10 מ"ג/מ"ל כולסטרול</td><td>סיגמא</td><td>C8667</td><td>גידול נמטודות בינוני</td></tr><tr><td>1 מ"מ סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סיגמא</td><td>223506</td><td>גידול נמטודות</td></tr><tr><td>בינוני 1 מ"מ מגנזיום סולפט הפטאהידרט</td><td>סיגמא</td><td>M2773</td><td>גידול נמטודות בינוני</td></tr><tr><td>2% אגר</td><td>T M מדיה</td><td>1202</td><td>מדיום גידול נמטודה</td></tr><tr><td>25 מ"מ מונו-בסיסי אשלגן דימימן פוספט</td><td>סיגמא</td><td>P9791</td><td>מדיום גידול נמטודות</td></tr><tr><td>0.1M מונו-בסיסי אשלגן דימימן פוספט</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>1X M9 מאגר</td></tr><tr><td>0.04M נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>71376</td><td>1X M9 מאגר</td></tr><tr><td>0.1M אמוניום כלוריד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>21405</td><td>1X M9 מאגר</td></tr><tr><td>0.2M דייסודיום מימן פוספט הפטהידראט</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>1X M9 מאגר</td></tr><tr><td>בקבוקי זכוכית</td><td>Borosil</td><td></td><td>אחסון מאגר</td></tr><tr><td>488 ננומטר לייזר</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>5X אובייקטיבי</td><td>Zeiss</td><td></td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>63X אובייקטיבי</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצלמת</td><td>הדמיה פוטומטריה</td><td>Evolve 512 Delta</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Computer System for Spinning Disk unit</td><td>HP</td><td>Intel &reg; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td><td>Zeiss</td><td>Observer.Z1</td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>מנורת הלוגן</td><td>Zeiss</td><td></td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>כספית מנורת קשת</td><td>Zeiss</td><td></td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>יחידת דיסק מסתובב</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>ZEN2 תוכנה</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Image J (פיג'י גרסה)</td><td></td><td></td><td>ניתוח ועיבוד תמונה</td></tr><tr><td>Adobe Creative Cloud</td><td></td><td></td><td>Adobe ניתוח ועיבוד תמונות</td></tr><tr><td>מערכת מחשב לניתוח תמונות</td><td>Dell</td><td>Intel &reg; ליבה ומסחר; i7-9700 מעבד 3.00GHz</td><td>עיבוד/ייצוג תמונה</td></tr></tbody></table>

in vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב caenorhabditis elegans נוירונים

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

בתאי עצב, אוריינטציה microtubule היה מעריך מפתח לזהות אקסונים שיש להם פלוס סוף החוצה microtubules ו דנדריטים כי בדרך כלל יש אוריינטציה מעורבת. כאן אנו מתארים שיטות לתיוג, תמונה וניתוח הדינמיקה והצמיחה של המיקרוטובלים במהלך הפיתוח וההתחדשות של נוירוני מגע ב- C. elegans. באמצעות כתבים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית של טיפים מיקרוטובולים, צילמנו את microtubules האקסוני. ניתן לכמת את השינויים המקומיים בהתנהגות המיקרוטובול היוזם התחדשות אקסון בעקבות אקסוטומיה באמצעות פרוטוקול זה. בדיקה זו ניתנת להתאמה לנוירונים אחרים ורקעים גנטיים כדי לחקור את הרגולציה של דינמיקת microtubule בתהליכים תאיים שונים.

כדוגמה מייצגת, תיארנו בהתבוננות ב- vivo של שביט EBP במצב יציב וחדשות האקסונים של נוירוני PLM. נוירונים PLM ממוקמים באזור הזנב של התולעת עם תהליך ארוך הקדמי היוצר סינפסה ותהליך אחורי קצר. נוירוני PLM גדלים בכיוון הקדמי-אחורי קרוב לאפידרמיס ואחראים לתחושת המגע העדינה בתולעים. בשל המבנה הפשוט שלהם, ואת נוחות הדמיה ומיקרוכירורגיה, נוירונים PLM נחקרו בהרחבה עבור cytoskeleton microtubuleeשלהם, תחבורהאקסונית30,31, והתחדשות19</su...

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

מטרת הליך זה היא להעריך את ארגון המיקרוטובלים ואת הדינמיקה ב- vivo. נוירונים הם תאים מקוטבים עם תאים אקסונליים, דנדריטיים וסינפטיים מובהקים, המתוחזקים על ידי הציטוסקלטון הבסיסי שלהם. Microtubules מהווים את רוב הציטוסקלטון העצבי, והדינמיקה והכיוון קובעים אירועים מרכזיים במהלך התפתחות עצבית והבשלה.מיקרוטובולות מורכבות מהטרודימרים אלפא ובטא טובולין, ומקוטבות מטבען עם קצוות פלוס דינמיים מאוד ומינוס-קצוות יציבים. במהלך פילמור בקצוות פלוס, קומפלקס רב מולקולרי של חלבונים מחייבי קצה, לקשר ארעי עם protofilaments ולקדם את ההרכבה של dimers טובולין. טכניקה זו תעזור לנו לדמיין מיקרוטובולות עצביות ב vivo.באמצעות טכניקה זו, ניתן לקבוע את הכיוון ופרמטרים אחרים של microtubules דינמי במהלך פיתוח והתחדשות של נוירון C.elegans. אנחנו בדרך כלל משתמשים בכתב הזה כדי לדמיין דינמיקה של מיקרוטובול בתאי עצב חושיים. עם זאת, ניתן לבטא כתב זה בסוגי תאים אחרים כגון שרירים ועור כדי לדמיין microtubules דינמי בתאים אלה.חלבונים מחייבי קצה המסומנים באופן פלואורסצנטרי כמו EBP ל- GFP כאן, מופיעים כחליטים. הדינמיקה של שביטים אלה הייתה מתואמת עם צמיחה בו-חופית של המיקרוטובולות, ומחוון מפתח לאמוד דינמיקה וכיוון מיקרוטובולה. על מנת להתבונן בשביטים אלה בסוג תא מסוים, טרנסג'ן עם DNA של EBP-2 ו- GFP באים לידי ביטוי תחת מקדם ספ

in-vivo-assessment-microtubule-dynamics-orientation-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Doser, R., et al. הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי in vivo. J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מדגים הדמיה in vivo של שטף סידן תת-תאי בנוירונים של חוט העצב הגחוני של זני Caenorhabditis elegans טרנסגניים. נעשה שימוש בשני מדדי סידן נפרדים: אינדיקטור ציטופלזמי בזן אחד ואינדיקטור מיטוכונדריאלי באחר. נוירונים נצפים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לנטר שינויים בזמן אמת בעוצמת הקרינה בתוך הציטופלזמה העצבית והמיטוכונדריה, המשקפים שטף סידן במהלך פעילות עצבית ספונטנית.

הדמיית דינמיקת סידן תת-תאית בתאי עצב של Caenorhabditis elegans

עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים...

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא מודל טוב ללמוד תחבורה עצב, תאיים. . הנה, אני מתארת פרוטוקול ויוו הקלטה וניתוח התחבורה עצב, intraflagellar C. elegans.

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש Ca2 + כתבים מקודדים גנטית כדי לרשום שינויים בפעילות העצבית מתנהג Caenorhabditis elegans תולעים.

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

שיטה זו מספקת דרך לזוג אלקטרואופטיקה וחיישני סידן מקודד גנטית לתמונה בסיסית ציטוסולג רמות סידן ושינויים בארעיות הסידן מעורר בשרירי הגוף של האורגניזם מודל ג. אלגיה.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

מחקר זה מתאר את המידות הכמותיות של גודל ולוקליזציה, מורפולוגיה שרירים וצורה מיטוכונדרילית ב -C. אלגיה באמצעות כלים זמינים לעיבוד תמונות באופן חופשי. גישה זו מאפשרת לימודים עתידיים ב -C. אלגיה להשוות בין היקף רקמות ושינויים מבניים כתוצאה מוטציות גנטיות.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

במאמר זה, אנו מציגים כיצד להשתמש במערכת ניקוד של שבע נקודות כדי לכמת באופן עקבי שינויים במורפולוגיה של נוירון דנדריט דופאמין ב- C. elegans. מערכת זו מיועדת לנתחים של בדיקות ניוון עצבי דופאמין באמצעות מודלים גנטיים, כימיים ומבוססי גיל של הפרעות ניווניות.

כימות רמות של נוירון דופאמין שינוי מורפולוגי ניוון ב elegans Caenorhabditis

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

המאמר מתאר אופטימיזציה של פרמטרים לרכישת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להמחיש את ההובלה האקסונלית של מטענים מסומנים אנדוגניים ברזולוציה של נוירון יחיד בנמטודה חיה.

אופטימיזציה של ויזואליזציה של הובלה אקסונלית של מטען אנדוגני על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב Caenorhabditis elegans חי

למד הערכת דינמיקת מיקרוטובולות וכיווניותן בנוירונים של Caenorhabditis elegans באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה וחלבון EBP מתויג ב-GFP. שיטה זו מאפשרת ניתוח התנהגות מיקרוטובולות במהלך התפתחות עצבית ותהליכי התחדשות.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

גלה סרטונים נוספים