Name: פיתוח רצועה חיסונית של זרימה רוחבית לגילוי מהיר וכמותי של תרכובות מולקולות קטנות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: למדו את שיטת סינתזת זהב קולואידלי ואת הרכבת רצועות אימונוכרומטוגרפיות לזיהוי מולקולות קטנות. פרוטוקול זה מספק כלי אבחון מהיר ואמין לחוקרים בתחום הביוכימיה והננוטכנולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרנות המיוחדות לקרנות מחקר יסודיות של מוסדות להשכלה גבוהה המזוהים עם מחלקות מרכזיות. אנו מעריכים את התמיכה של מרשם קלאסי צוות מחקר בסיסי של אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית.

כל ההליכים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לבדיקת אתיקה באוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית (מספר אישור 2017BZYYL00120).
1. הכנה ואפיון של זהב קולואידי
הערה: עבור סינתזת זהב קולואידי, כמו זהב קולואידי הוא נספג בקלות על הקיר הפנימי של הכלי והוא נוטה משקעים על ידי זיהומים, הכלי עבור סינתזה ואחסון של זהב קולואידי צריך להיות ניקה ביסודיות ספוג בחומצה (40 מ"ל של מים מזוקקים, 360 מ"ל של חומצה גופרתית מרוכזת, 20 גרם של אשלגן dichromate) או נתון לטיפול פסיבציה פני השטח. שיטה להפחתת חומצת לימון שימשה לסנתז זהב קולואידי.
<ol><li>מפעילים את המערבב המגנטי ומניחים את הבקבוק (250 מ"ל) על המיקסר.</li>
	<li>הכן 4% תמיסה חומצת כלוריד זהב ו 1% פתרון נתרן סיטראט, בהתאמה.</li>
	<li>מוסיפים 120 מ"ל של מים מזוקקים לבקבוקון התחתון העגול ומחממים אותו לרתיחה על מערבב מגנטי תרמוסטטי.</li>
	<li>שמור רותח, ולהוסיף במהירות 0.5 מ"ל של 4% חומצה כלורוארית ו 5 מ"ל של 1% נתרן ציטוטראט.</li>
	<li>שים לב לצבע הפתרון. תמיסה חומצה כלורוארית צהובה חיוורת הופכת יין אדום בתוך כמה דקות.</li>
	<li>ממשיכים לחמם במשך 10 דקות, עד שהפתרון משתנה מיין חסר צבע לאדום שקוף.</li>
	<li>כבה את העוצמה של המיקסר המגנטי התרמוסטטי, מצננים לטמפרטורת החדר ומעבירים את התערובת לבקבוק נקי. לאחסן אותו ב 4 °C (5 °F).</li>
	<li>קבע את הגודל והמורפולוגיה של AuNPs על ידי ספקטרוסקופיה אולטרה סגולה והדמיה TEM. הערה: בגדלים שונים של חלקיקי זהב קולואיד עבור יישומים שונים ניתן להשיג על ידי שינוי שיעור נתרן ציטוט וחומצה כלורוארית.</li>
</ol>2. סינתזה של התזת AuNPs-mAb
הערה: מאז נוגדנים להיקשר זהב קולואידי על ידי ספיחה אלקטרוסטטית, חיובים על פני השטח של חלבונים וזהב קולואידי משפיעים ישירות על עוצמת הכריכה; לכן, ערך ה- pH של המאגר הוא גורם חשוב המשפיע על יציבות ההצתה של הנוגדנים-קולואידיים של זהב. SSD ו- mAbs נגד SSD משמשים כדוגמאות בפרוטוקול זה.
<ol><li>הערכה של צימוד pH<ol>
<li>הוסף 100 μL של פתרון NaCl (10% m/v) לתוך שמונה צינורות.</li>
		<li>התאם את פתרונות AuNP ב- pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ו- 12 עם 0.1 M K2CO3.</li>
		<li>הוסף 100 μL של פתרון זהב קולואידי (pH מותאם 5-12) לשמונה צינורות המכילים NaCl.</li>
		<li>אפשר לפתרונות לעמוד מספר דקות לאחר המיזוג. שים לב לשינוי הצבע של כל פתרון צינור, ולתעד את הצינור שנשאר אדום.</li>
		<li>בחר את ערך ה- pH עם התוספת הנמוכה ביותר של K2CO3 וצבע פתרון יציב כערך pH האופטימלי להכנת מצומדי AuNP-mAb. הערה: אין להשתמש במד pH מכיוון שהגשוש עשוי להיהרס על-ידי AuNPs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הערכת כמות הנוגדנים<ol>
<li>הוסף 100 μL של פתרון NaCl (10% m/v) לשמונה צינורות.</li>
		<li>הוסף 100 μL של פתרון זהב קולואידי עם pH אופטימלי לכל צינור.</li>
		<li>הוסיפו את פתרונות הנוגדנים המונוקלונליים (ריכוז חלבונים 0.1 מ"ג/מ"ל-3.2 מ"ג/מ"ל) לשמונה הצינורות הנ"ל.</li>
		<li>אפשר לפתרונות לעמוד מספר דקות לאחר המיזוג. שים לב לשינוי הצבע של כל פתרון צינור, ולתעד את הצינור שנשאר אדום.</li>
		<li>בחר את כמות הנוגדנים עם הריכוז הנמוך ביותר של mAb וצבע פתרון יציב כמו כמות mAb אופטימלי להכנת מצומדים AuNP-mAb.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן את מאגר ההשתתפות מחדש: הוסף 1 M Tris-HCl (pH 8.8), 1% (w/v) BSA, 0.5% (v/v) Tween 20 ו- 1% (v/v) PEG 20000 ומיזוג היטב.</li>
	<li>סינתזה של התקהלות AuNP-mAb<ol>
<li>קח 10 מ"ל של פתרון זהב קולואידי והשתמש ב- 0.1 M K2CO 3 כדילהתאים את הפתרון לערך ה- pH האופטימלי.</li>
		<li>יש להוסיף לאט את ה-SSD mAbs בריכוזים המתאימים ולנער בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
		<li>צנטריפוגות התערובת ב 83 x גרם (1,000 סל"ד) במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F). הסר את המשקעים, אשר מכיל זיהומים או זהב קולואידי מזורם.</li>
		<li>צנטריפוגות התערובת ב 8,330 x גרם (10,000 סל"ד) במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F). השלך את supernatant, ואת המשקעים הוא קולואידי זהב-mAb ההמולה.</li>
		<li>הוסף את מאגר ההפצה מחדש כדי לנתק את המשקעים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. כינוס הרצועה
הערה: עבור חיסוני זרימה מאוחרים יותר, הבחירה והטיפל הממברנה ישפיעו ישירות על הבדיקה, אשר יש לחקור. הרצועה החיסונית מורכבת משטח דגימה, כרית מצומדת, קרום ניטרוצלולוז (NC), כרית סופגת ולוח PVC(איור 1). חומר הממברנה צריך להיבדק ולהעריך על ידי סטריאומיקרוסקופיה כדי לחסל את האינומוגניות.
<ol><li>הדבק את קרום NC על לוח PVC 2 ס"מ מלבד קצה קצה היניקה של הלוח.</li>
	<li>הוסף SSD-BSA (2 מ"ג / מ"ל) טיפה לקרום NC (2 ס"מ מלבד הקצה העליון) כקו בדיקה (1 מ"מ רוחב), ולהוסיף עז נגד עכבר IgG (1.5 מ"ג / מ"ל) טיפה על קרום NC (2 ס"מ מלבד הקצה התחתון) כקו בקרה (1 מ"מ רוחב). לשלוט בכמות החלבון שנוסף.</li>
	<li>חבר את כרית הספיגה לגיליון PVC מעל קרום NC וחפוף אותו עם קרום NC על ידי 2 מ"מ.</li>
	<li>שקועים בקרום סיבי הזכוכית לתוך פתרון מצומד AuNPs-mAb. יבש את הממברנה הרטובה באינקובטור ב 37 °C (50 °F).</li>
	<li>חותכים את קרום סיבי הזכוכית לאורך 5 ס"מ ורוחב 2 ס"מ ומשתמשים בו כרפידה מצומדת.</li>
	<li>הדבק את כרית מצומד מטופל מראש מתחת לקרום NC. אורך החפיפה עם קרום NC צריך להיות 0.1 ס"מ. הערה: קרום סיבי הזכוכית יש יכולת חזקה לקשור ולשחרר חלבונים.</li>
	<li>חותכים את ההיתוך 3 ממברנה ל 1.8 ס"מ ארוך 3.5 ס"מ רוחב ולהשתמש בו כמו כרית מדגם.</li>
	<li>הדבק את משטח המדגם על לוח PVC וחפיפת אותו עם כרית מצומד על ידי 2 מ"מ.</li>
	<li>חותכים את לוח הנייר המורכב לרצועות ברוחב 3.5 מ"מ באמצעות מכונת חיתוך וקומפצים אותו באמצעות מערכת למינציה אצווה.</li>
	<li>לבסוף, מניחים את רצועות הבדיקה לתוך הקליפה, אוטמים אותן בשקית רדיד אלומיניום המכילה חיטוי, ומאחסנים אותן הרחק מהאור. ICSs מורכבים כעת. הערה: האמור לעיל הוא הליך המעבדה. בייצור, ציוד ריסוס זהב ומכשירים ממברנה צולבת משמשים לרסס זהב ולעשות את קווי T ו- C.</li>
</ol>4. זיהוי כמותי
<ol><li>זרוק 50 μL של פתרון מדגם על חור המדגם כדי לצפות בתהליך הכרומטוגרפיה. הערה: כתוצאה מהפעולה הנימית המונעת על ידי כרית הספיגה, הפתרון לדוגמה עובר לקצה השני של הרצועה. כאשר פתרון המדגם מגיע למשטח מצומד, ה- SSD (אנטיגן) במדגם מגיב כאשר AuNPs-mAb נטען מראש על הפנקס. כאשר הפתרון נודד ומגיע לקו ה- T, ניתן ללכוד את AuNPs-mAb ללא SSD באופן סלקטיבי על-ידי SSD-BSA (מצומד חלבון נושא אנטיגן), המוצג כצבע אדום בקו T. לאחר מכן, הפתרון עובר לקו C, שבו AuNPs-mAb נלכדים על ידי עז אנטי עכבר IgG באזור, ובכך מוצג כצבע אדום על קו C.</li>
	<li>נתח את הרצועות באמצעות קורא רצועות נייד. המכונה יכולה לספק את היחס בין קו הבדיקה לקו הבקרה (T/C).</li>
	<li>להעריך את הספציפיות, הרגישות, החזרה והיציבות של מבחן ICS. הערה: תחת זיהוי איכותי, קו אדום אחד מציין תוצאה חיובית (קו בקרה). שני קווים אדומים מציינים תוצאה שלילית (קווי בדיקה ובקרה). אם שורת הביקורת אינה קיימת, הבדיקה נחשבת ללא חוקית.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-based+lateral+flow+immunochromatographic+strip+with+nanoparticles+as+reporters+for+detection%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).</li>
<li>Chang, H. -F., Wang, J. -Q., Wang, B., Deng, A. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immune+chromatographic+assay+for+rapid+and+simultaneous+detection+of+levonorgestrel+and+methylprednisolone+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Chemical+Letters%22%5BJournal%5D)">An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples.</a> Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).</li>
<li>Lai, J. J., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+lateral-flow+immunoassay+%28LFIA%29+diagnostics+via+biomarker+enrichment+for+mHealth%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth.</a> Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).</li>
<li>Zhang, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+colloidal+gold-based+lateral-flow+immunoassay+for+the+rapid+simultaneous+detection+of+clenbuterol+and+ractopamine+in+swine+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+%26+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine.</a> Analytical & Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).</li>
<li>Kranthi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+colloidal-gold+based+lateral-flow+immunoassay+kit+for+%27quality-control%27+assessment+of+pyrethroid+and+endosulfan+formulations+in+a+novel+single+strip+format%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for 'quality-control' assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format.</a> Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).</li>
<li>Qian, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+immunochromatographic+strip+for+rapid+detection+of+capsid+protein+antigen+p27+of+avian+leukosis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus.</a> Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).</li>
<li>Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same. US Patent. , US20040184954A1 (2003).</li>
<li>Miočević, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Lateral+Flow+Assays+for+Salivary+Biomarker+Assessment%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative Lateral Flow Assays for Salivary Biomarker Assessment: A Review.</a> Frontiers in Public Health. 5, 1-13 (2017).</li>
<li>Lisa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+based+dipstick+immunoassay+for+the+rapid+detection+of+dichlorodiphenyltrichloroethane%3A+an+organochlorine+pesticide%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane: an organochlorine pesticide.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25 (1), 224-227 (2009).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibody-Europium+Conjugate-Based+Lateral+Flow+Time-Resolved+Fluoroimmunoassay+for+Quantitative+Determination+of+T-2+Toxin+in+Cereals+and+Feed%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed.</a> Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+synthesis+of+high-quality+CuInZnxS2%2Bx+core%2Fshell+nanocrystals+and+their+application+for+detection+of+C-reactive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Facile synthesis of high-quality CuInZnxS2+x core/shell nanocrystals and their application for detection of C-reactive protein.</a> Journal of Materials Chemistry. 22 (35), 18623-18630 (2012).</li>
<li>Xiang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+double+antibody+sandwich-lateral+flow+immunoassay+for+the+rapid+and+simple+detection+of+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot-based+immunochromatography+test+strip+for+rapid%2C+quantitative+and+sensitive+detection+of+alpha+fetoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid, quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein.</a> Biosensors & Bioelectronics. 30 (1), 145(2011).</li>
<li>Song, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fluorescent+lateral-flow+immunoassay+for+hepatitis+B+virus+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping.</a> Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot-based+lateral-flow+immunoassay+for+rapid+detection+of+rhein+using+specific+egg+yolk+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Cells%2C+Nanomedicine%2C+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).</li>
<li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Lateral-Flow+Immunoassay+for+the+Quantum+Dot-based+Detection+of+GsRerarin%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Clinical+Application+of+a+Rapid+IgM-IgG+Combined+Antibody+Test+for+SARS-CoV-2+Infection+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis.</a> Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).</li>
<li>Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+application+value+analysis+of+the+2019-coronary+virus+disease+was+analyzed+by+the+whole+blood+Sars-COV+2+specific+antibody+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Science+Edition%22%5BJournal%5D)">The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection.</a> Natural Science Edition. 42, (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Monoclonal+Antibodies+Against+Natural+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products.</a> Journal of Visualized Experiments. , e57116(2019).</li>
<li>Sai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Enzyme-Linked+Immunosorbent+Assay+and+Immunoaffinity+Column+Chromatography+for+Saikosaponin+d+Using+an+Anti-Saikosaponin+d+Monoclonal+Antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody.</a> Planta Medica. 82, 432-439 (2016).</li>
<li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Sensitive+Immunochromatographic+Strip+Test+for+Rapid+and+Quantitative+Detection+of+Saikosaponin+d%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d.</a> Molecules. 23 (2), 338(2018).</li>
<li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Lateral-Flow+Immunoassay+for+the+Quantum+Dot-based+Detection+of+Puerarin%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot-based+lateral-flow+immunoassay+for+rapid+detection+of+rhein+using+specific+egg+yolk+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Cells%2C+Nanomedicine%2C+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול להכנת mAbs נגד מולקולות קטנות טבעיות המופקות ממוצר. הצעדים החיוניים והעניינים הזקוקים לתשומת לב בהליך תוארו, והדגמנו את התועלת של פרוטוקול זה באמצעות המולקולה הקטנה SSD כדוגמה. ספקטרום לדוגמה, תמונות TEM, תוצאות כמותיות וחקירות מתודולוגיות מוצגים בנתונים מייצגים. לפיכך, הוכחנו כי ייצור הזהב הקולואידי, הטיות AuNP-mAb ואסטרטגיית הרכבת רצועה המוצגת כאן גורמות ליצירת אימונואזיה חדשנית שניתן להשתמש בה כדי לזהות במהירות את מולקולת היעד.
קל לתפעול רצועות אימונוכרומטיות,...

רצועות אימונוכרומטוגרפיות זרימה לרוחב מבוססות ממברנה (ICSs) הן כלים שימושיים לזיהוי בעלות נמוכה ומהירה. קרום הניטרוצלולוז כנשא וזהב קולואידי כסמנים של ריאגנטים אבחון מהיר כרומטוגרפיה חיסונית הם שיטת POCT (נקודת הטיפול) הנפוצה ביותר, ואת היקף הבדיקה של הפרויקט הוא רחב יותר. מהיישום המקורי שלהם בניטור במהלך ההריון, השימוש בהם הוארך כדי לפקח על מצב קרישת הדם1,2, פגיעה בשריר הלב3,תרופה וטרינרית 4, שאריות חומרי הדברה5, מחלות זיהומיות6 וריכוזים סמים. ניתן להעריך סוגים נוספים של דגימות, כולל שתן, רוק, דם שלם, סרום ונוזלים אחרים בגוף7,8,9.
בשנים האחרונות פותחו בדיקות חדשניות רבות לאיתור סמנים ביולוגיים באבחון הפרעות, כולל HPLC, UPLC, LC-MS ו- ELISA, שהם רגישים ומדויקים, אמינים וספציפיים. עם זאת, שיטות אלה דורשות מכשור מתוחכם, עיבוד מקדים מורכב וטיפולים גוזלי זמן9. לפיכך, פיתוח אסטרטגיית אבחון מהירה ונוחה יותר של נקודת טיפול לגילוי עצמי ובזמן אמת של תרכובות פעילות מרפא הוא דחוף10,11.
הפופולריות של ICSs, במיוחד עבור בדיקות נפוצות, מונעת על ידי קלות השימוש שלהם, כפי שהם אינם דורשים אנשי מקצוע או הגדרות אינסטרומנטליות משוכללות12. במילים אחרות, אנשים שאין להם הכשרה מיוחדת יכולים להפעיל רצועות או בדיקות עצמיות13. את תוצאות הבדיקה ניתן להשיג בתוך 5 דקות, מה שאומר שזה יכול לשמש לבדיקות באתר14. יתר על כן, על פי החישובים שלנו, העלות של רצועות יכול להיות נמוך יותר מ 1 RMB15, כלומר הבדיקות זולות כדי לקדם16. לפיכך, ICS הוא מכשיר חד פעמי מדויק יחסית, פשוט וזול. ICSs המבוסס על זהב קולואידי17,18 מיושמים גם בגילוי מהיר COVID-19.
העיקרון של ICS ניתן לחלק כריך ICS ו- ICS תחרותי. איור 1A הוא תרשים סכמטי של כריך ICS, המשמש בעיקר לאיתור חומרים מקרומולקולריים כגון חלבונים, כולל סמני גידול, גורמים דלקתיים וגונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG, אנטיגן הריון מוקדם). בשיטה זו, נוגדנים מזווגים המיועדים לאפיטופים שונים של האנטיגן משמשים, ונוגדן הלכידה מיובש על קרום NC כקו בדיקה. נוגדן שכותרתו מיובש על כרית מצומד, ונוגדן משני משמש כקו הביקורת.
איור 1B הוא תרשים סכמטי של ICS תחרותי, המשמש בעיקר לזיהוי חומרים של מולקולות קטנות (MWCO &lt; 2000 Da). אנטיגן הציפוי קבוע על קרום NC כקו בדיקה, ואת הנוגדן המסומן מיובש על כרית מצומד. במהלך הזיהוי, המדגם והתווג הנוגדנים זורמים דרך קו הזיהוי תחת פעולה נימית, והאנטיגן המצולף קושר באופן תחרותי אנטיגן חינם במדגם ומפתח צבע אדום בקו הזיהוי.
לאחרונה, תיארנו את ההליך של ייצור נוגדנים חד שבטיים נגד מוצרים טבעיים19. בעבודה זו, פיתחנו אימונואזיה זרימה לרוחב רומן המבוסס על mA20 מוכן נגד SSD לגילוי מהיר באתר. התוצאות מצביעות על כך שבדיקת החיסונים היא כלי חיוני ונוח לאיתור תרכובות טבעיות המופקות ממוצר.
<img alt="דיאגרמת בדיקה חיסונית של זרימה רוחבית; ממחיש עיבוד דגימה עם נוגדנים מסומנים, קווי בדיקה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62754/62754fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1 תרשים סכמטי של בדיקת החיסונים (A)רצועות בדיקה אימונוכרומטיות של כריך. (B)רצועות בדיקה כרומטוגרפיות חיסון עקיפות. נתון זה שונה מ ג'אנג ואח', 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62754/62754fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>תמיסת חומצה כלורואורית (HAuCl4)</td><td>טיאנג'ין פו צ'ן ריאגנטים כימיים מפעל</td><td>JY-SJ102</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>AMRESCO</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td></td> צינור צנטריפוגה 430645 <td></td><td>קורנינג</td></tr><tr><td>50 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>צלחות ELISA, 96 באר</td><td>NUNC</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Sinopharm</td><td>H5072</td><td></td></tr><tr><td>ממברנות סיבי זכוכית</td><td>Jieyi</td><td>XQ-Y6</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי עכבר נוגדן IgG</td><td>applygen</td><td>C1308</td><td></td></tr><tr><td>ממברנות ניטרוצלולוזה</td><td>Millipore</td><td>millipore 180</td><td></td></tr><tr><td>ovalbumin</td><td>בייג'ינג BIODEE</td><td>5008-25g</td><td></td></tr><tr><td>PEG20000</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td></td>RNBC6325</tr><tr><td>פיפטה 10 מ"ל</td><td>COSTAR</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה 25 מ"ל</td><td>FALCON</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>יריעות PVC חצי קשיחות</td><td>Jieyi</td><td>JY-C104</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>בייג'ינג עבודות כימיות</td><td>C1034</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פריודאט</td><td>סינופארם כימי</td><td>BW-G0008</td><td></td></tr><tr><td>סולפו-GMBS</td><td>Perbio Science גרמניה</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>טיפ וואן טיפים 1,000 ומיקרו; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Solarbio</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Solarbio</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח רצועה חיסונית של זרימה רוחבית לגילוי מהיר וכמותי של תרכובות מולקולות קטנות

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

רצועות אימונוכרומטוגרפיות זרימה לרוחב מבוססות ממברנה (ICSs) הן כלים שימושיים לאבחון עצמי בעלות נמוכה ויושמו ביעילות על רעלן, אינדקס פיזיולוגי וזיהוי סמנים ביולוגיים קליניים. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור מפורט של השלבים לפיתוח אימונואסי מהיר, רגיש וכמותי לרוחב (באמצעות AuNPs כסמן ו- mAbs כגשוש). ההליך מתאר את ההכנה והאפיון של זהב קולואידי, סינתזה של מצומד AuNP-mAb, הרכבה של הרצועה החיסונית, וחקירה מתודולוגית של ההסתה. התוצאות הראו כי ניתן להשתמש ברצועות הסופיות עוד יותר לאבחון עצמי מהיר ונוח של מולקולה קטנה, אשר עשויה לספק כלי חלופי בניתוח מהיר ומדויק של מדדים פיזיולוגיים וביולוגיים.

אפיון של זהב קולואידי פתרונות הזהב הקולואידיים המוכנים היו אדומים קלארט. ניתוחי TEM שימשו לקביעת המורפולוגיה והצורה של AuNPs(איור 2A-D). איור 2A ואיור 2B חושפים שהחלקיקים הם בעלי צורה פוליהדרלית ומופצים באופן אחיד. הקוטר הממוצע של AuNPs נמצא כ 14 ננומטר(איור 2C). תמונת TEM ברזולוציה גבוהה (HRTEM) של AuNPs מוצגת באיור 2D </strong...

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

הנוהל מתאר את הכנת הזהב הקולואידי והרכבה של הרצועות החיסוניות. ראשית, חומצה כלורואורית ונתרן סיטראט שימשו לסינתזה של זהב קולואידי. נתרן סיטראט נוסף תמיסה חומצה כלורואורית מבושל כדי לקבל זהב קולואידי עם גודל החלקיקים המתאים.סינתזה, הנוגדן לזהב הקולואידי מצומד. לאחר צנטריפוגה, חלקיקי זהב קולואידי הומסו בתמיסה מתאימה ולאחר מכן resuspended כדי לקבל פתרון זהב קולואידי. שקועים בקרום סיבי הזכוכית לתוך ההטיה כדי להכין את כרית הצומד.זרוק אנטיגן מלאכותי ונוגדנים משניים על קרום NC כמו קו T וקו C. חבר את קרום NC, קרום סופג, כרית מדגם, ואת קרום סיבי הזכוכית לתוך לוח PVC בהתאמה. חותכים את לוח הנייר המורכב לרצועה ברוחב 3.5 מילימטרים.תדביקו תמיסה של חומצת כלוריד זהב ו-1%sodium citrate בהתאמה. מפעילים את המערבב המגנטי ומניחים את הבקבוקון על מערבל. מוסיפים 120 מיליליטר מים מזוקקים לבקבוקון עגול ומחממים אותו לרתיחה על מערבב מגנטי תרמוסטטי.שמור רותחים במהירות להוסיף 0.5 מיליליטר של חומצה כלורוארית אחוז מלא וחמישה מיליליטר של 1% נתרן ציטוטט. המשך חימום במשך חמש עד 10 דקות. שים לב לצבע הפתרון המשתנה מצהוב חיוור לאדום יין.לכבות את הכוח של המערבל המגנטי התרמוסטטי, להתקרר לטמפרטורת החדר ומניחים את התערובת לבקבוק נקי. חנות בארבעה סנטיגרד. חלקיקי הזהב מראים את אפקט טינדל.הגודל והמורפולוגיה של חלקיקי הזהב נקבעו על ידי ספקטרוסקופיה אולטרה סגולה והדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הוסף 100 מיקרוליטרים פתרון נתרן כלורי לשמונה צינורות. התאימו את פתרונות הזהב הקולואידי ל-pH 5 עד 12 באמצעות 0.1 מול לליטר אשלגן פחמתי.הוסף 100 מיקרוליטרים של תמיסת זהב קולואידי לשמונה צינורות המכילים נתרן כלורי. עמדו על עמוד מספר דקות לאחר המיזוג. שים לב לשינוי הצבע של כל פתרון צינור ולתעד את הצינור שנשאר אדום.בחר את ערך ה- pH עם הכמות הנמוכה ביותר של אשלגן פחמתי מוסף וצבע פתרון יציב כערך ה- pH האופטימלי להכנת מצומד. התאים את אותה גישה. התבונן בשינוי הצבע ותיעד את הצינור שנשאר אדום.בחר את כמות הנוגדנים עם הריכוז הנמוך ביותר של mAB וצבע פתרון יציב ככמות mAB אופטימלית. קח 10 מיליליטר תמיסת זהב קולואידי ולהשתמש 0.1 מול לליטר אשלגן פחמתי כדי להתאים את הפתרון לערך ה- pH האופטימלי. מוסיפים לאט MABs SSD עם הריכוז המתאים ומנערים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.צנטריפוגות התערובת ב 2000 סל"ד במשך 20 דקות בארבעה centigrade. הסר את המשקעים המכילים זיהומים של זהב קולואידי מזורם. צנטריפוגות התערובת ב 10, 000 סל"ד במשך 40 דקות.זרוק את סופר-טבעי. המשקעים הוא הונאת MAB זהב קולואידי. הוסף חומצה הידרוכלורית טריס, BSA, Tween 20, ו PEG 20, 000, ולאחר מכן לערבב היטב כדי להכין חוצץ resuspension.הוסף את מאגר ההפצה מחדש ונתק את המשקעים. רצועת החומר הממברנה, כולל קרום תאית זכוכית, קרום תאית פוליאסטר, ואת לוח PVC. חומר הממברנה, צריך לעקוב ולהעריך על ידי מיקרוסקופ סטרילי כדי להיפטר inhomogeneity.ראשית, למקם את קרום NC על לוח PVC שני סנטימטרים מקצה החלק של הלוח. שנית, זרוק שני מיליגרם למיליליטר SSd-BSA על קרום NC בשני סנטימטרים מהקצה העליון כקו בדיקה ושחרר 1.5 מיליגרם למיליליטר זהב אנטי עכבר IgG על קרום NC בשני סנטימטרים מהקצה התחתון כקו בקרה. חבר את כרית הספיגה לגיליון PVC מעל קרום NC וחפיפה עם קרום NC בשני מילימטרים.חותכים את קרום סיבי הזכוכית לאורך חמישה ס"מ ורוחב של שני ס"מ ומנצלים כרפד מצומד. שקועים בקרום סיבי הזכוכית לתוך ננו-חלקיקי הזהב mAB מצומדים. להשרות במשך זמן מה כדי להפוך את חלקיקי הזהב mAB ספיגה.יבש את הממברנה הרחבה באינקובטור ב 37 מעלות. הדבק את כרית מצומד מטופל מראש מתחת לקרום NC ואת האורך החופף עם קרום NC צריך להיות 0.1 ס"מ. חותכים את קרום ההיתוך3 ל באורך 1.8 ס"מ ורוחב 3.5 ס"מ ולהשתמש כרפד המדגם.לאחר מכן, מניחים את משטח המדגם על לוח PVC וחופפים עם כרית מצומדת בשני מילימטרים. חותכים, מרכיבים את לוח הנייר לרצועות ברוחב 3.5 מ"מ באמצעות מכונת חיתוך וקומפקטיים באמצעות מערכת למינציה אצווה. לבסוף, מניחים את רצועות הבדיקה לתוך הקליפה.אוטמים אותם בשקית רדיד אלומיניום המכילה חיטוי והחנות הרחק מהאור. ICS מורכב כעת. זרוק 50 מיקרוליטרים של פתרון מדגם על חור המדגם כדי לצפות בתהליך הכרומטוגרפיה.לאחר מכן, נתח את הרצועות באמצעות קורא רצועות נייד. המחשב יכול לספק את היחס בין שורת הבדיקה לקו הבקרה. הערך את הספציפיות, הרגישות, יכולת החזרה והיציבות של מבחן ICS.פתרונות הזהב הקולואידיים המוכנים נקראו. ניתוחי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור גילו כי החלקיקים היו polyhedral בצורתם חולקו באופן אחיד עם קוטר ממוצע של 14 ננומטר. תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ברזולוציה גבוהה הראו דפוס שוליים רציף עם מרווח של 0.117 ננומטר של חלקיקי זהב.ספיגה אולטרה סגולה הנראית ציינה כי בגדלים שונים של חלקיקי זהב קולואידליים ניתן להשיג על ידי שינוי הפרופורציה של נתרן סיטראט וחומצה כלורוארית. בניסוי הכמותי, הרצועות עם תוצאות הבדיקה של saikosaponin D נסרקו באמצעות קורא ICS נייד. חישבנו עקומה סטנדרטית על ידי התייחסות לא ריכוזים של saikosaponin D לספיגה המתאימה בכל ריכוז.לאחר חקירה מתודולוגית, ניתן ליישם את השיטה לגילוי כמותי וחצי איכותי של תרכובות מולקולות קטנות. הליך זה כולל הכנת זהב קולואידי, סינתזה של חלקיקי זהב mAB מצומדים, הרכבת הרצועה וחקירה מתודולוגית. עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט לפיתוח רצועה חיסונית לשימוש בזיהוי מהיר וכמותי של מולקולה קטנה.לאחר צפייה בסרטון זה אני מקווה שיש לך הבנה טובה להכנת הרצועה החיסונית. תודה שצפיתם ובהצלחה על הניסויים שלכם.

development-lateral-flow-immunochromatographic-strip-for-rapid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Droplet מבוססי פלטפורמות microfluidic הם המועמדים המבטיחים לניסויים תפוקה גבוהה שכן הם מסוגלים להפיק, picoliter עצמית מידור כלי ובזול בשיעורים קילוהרץ. באמצעות שילוב עם מהירות, רגישות גבוהה שיטות ספקטרוסקופיות ברזולוציה פלואורסצנטי, כמויות גדולות של מידע שנוצר בתוך מערכות אלה ניתן לחלץ ביעילות, לרתום ולנצל אותו.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב פותח לשימוש כאבחון מולקולרי. השבב מבצע חילוץ חומצות גרעין, transcriptase ההפוכה, וה-PCR. שיטות לבודה והפעלת השבב מתוארות.

ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

פרוטוקול זה מתאר את התפתחותם של שני נוגדנים חד-שבטיים מסוג IgG (mAbs) המגיבים חזק למיוגלובין של יונקים ימיים. mAbs אלה מיושמים על רצועת בדיקה אימונוכרומטוגרפית זהב קולואידית המבוססת על פורמט הסנדוויץ' כדי להבדיל בין ה-Mb של יונקים ימיים לבין כלבי ים ובעלי חיים אחרים.

פיתוח של קולואיד זהב מבוסס Immunochromatographic מבחן ברצועה עבור איתור של מיוגלובין cetacean

כדי לחקור גישות ייצור פשוטות לצרכי בדיקה מרובים, יצרנו מערכת תעלות סופגת נוזלים העשויה מחומר כותנה. מכשיר זה שימש להקמת פלטפורמת זיהוי מרובה, ולפתרון בעיות זיהום המשפיעות בדרך כלל על מכשירים ביו-רפואיים מבוססי זרימה רוחבית, לבדיקת שתן קלינית של ניטריט, חלבון כולל ואורובילינוגן.

בודה כותנה התקנים אנליטית

פלטפורמה ביוסנסור microfluidic תוכנן של מפוברק בטכנולוגיית photoresist הסרט יבש בעלות נמוכה עבור כימות מהיר ורגיש של analytes שונים. מערכת זו לשימוש יחיד מאפשרת מדידה אלקטרוכימי של--צ'יפ-משותק מבחני מקושרים-אנזים באמצעות הטכניקה להפסיק זרימה.

פלטפורמה מבוססת Photoresist ביוסנסור אלקטרוכימי Microfluidic הסרט יבש: ייצור המכשיר, הכנה על שבב Assay, ותפעול המערכת

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לתאר את התפתחות ואימות מולקולה בודדת מערך דיגיטלי אליסה assay, אשר מאפשרת הזיהוי לאולטרה רגישות כל סוגי IFN-α בדגימות אנושי.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

Microfluidics הוא כלי רב עוצמה לפיתוח בדיקות אבחון. עם זאת, ציוד וחומרים יקרים, כמו גם טכניקות ייצור וטיפול מייגע, נדרשים לעתים קרובות. כאן אנו מפרטים את פרוטוקול הייצור של התקן מיקרופלואידי אקרילי עבור אימונו-אנליזות מגנטיות מבוססות מיקרו וננו-חלקיקים בסביבה זולה ופשוטה לשימוש.

מיקרומילינג בקרה נומרי ממוחשב של מכשיר אקרילי מיקרופלואידי עם הגבלה מדורגת עבור בדיקות חיסוניות מבוססות ננו-חלקיקים מגנטיים

מענה לצרכים דחופים לאבחון דנגי, כאן אנו מציגים מכשיר אנליטי מבוסס נייר דנגי NS1 משולב באפליקציית סמארטפון (DEN-NS1-PAD) לכימות ריכוז האנטיגן של דנגי NS1 בדגימות סרום / דם קליניות. חדשנות זו משפרת את ניהול הדנגה על ידי סיוע בקבלת החלטות קליניות במסגרות בריאות שונות, אפילו מוגבלות במשאבים.

Immunoassay נייד מבוסס נייר בשילוב עם יישום הטלפון החכם לזיהוי Colorimetric וכמותי של אנטיגן Dengue NS1

פרוטוקול זה מתאר בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas, המאפשרת אבחון סרטן נקודתי באמצעות ניתוח ex vivo של פעילויות פרוטאז הקשורות לגידול.

בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas לאבחון נייד

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להכנת ננו-חרוזי נקודה קוונטית (QDNB) ולזיהוי סמנים ביולוגיים של מחלות באמצעות רצועות חיסון מבוססות זרימה צידית מבוססות QDNB. ניתן להעריך את תוצאות הבדיקה באופן איכותי תחת תאורת אור UV ולמדוד כמותית באמצעות קורא פס פלואורסצנטי תוך 15 דקות.

זרימה צידית פלואורסצנטית Immunoassay מבוסס על נקודות קוונטיות ננו-חרוזים

למדו את שיטת סינתזת זהב קולואידלי ואת הרכבת רצועות אימונוכרומטוגרפיות לזיהוי מולקולות קטנות. פרוטוקול זה מספק כלי אבחון מהיר ואמין לחוקרים בתחום הביוכימיה והננוטכנולוגיה.

פיתוח רצועה חיסונית של זרימה רוחבית לגילוי מהיר וכמותי של תרכובות מולקולות קטנות

גלה סרטונים נוספים