אופטימיזציה של ההגדרה והתנאים עבור אלקטרורטינוגרמה של Ex Vivo כדי לחקור את תפקוד הרשתית בעיניים קטנות וגדולות
27 ביוני 2022
שינוי של מערך multielectrode קיים או ציוד מהדק תיקון עושה את ex vivo electroretinogram נגיש יותר. שיטות משופרות לתיעוד ושמירה על תגובות אור ex vivo מקלות על חקר תפקוד התאים הפוטורצפטורים וה-ON-דו-קוטביים ברשתית הבריאה, מודלים של בעלי חיים של מחלות עיניים ורשתיות של תורמים אנושיים.
פרוטוקול זה מדגים את התנאים הדרושים לשמירה על תפקוד הרשתית ב- ex vivo ERG, במיוחד גל B הרגיש ביותר המיוצר על ידי תאי ON-bipolar. עם ex vivo ERG, אנו יכולים למדוד את התפקוד של סוגים שונים של נוירונים ברשתית עם יחס אות לרעש גבוה תוך מתן אפשרות להכנסה קלה של סוכנים פרמקולוגיים. שיטה זו מקובלת במיוחד לכימות היעילות של חומרים פרמקולוגיים על תפקוד הרשתית ומחלות.
כדי להתחיל, המירו מערך רב-אלקטרודות על ידי חיבור מחזיק הדגימה ex vivo ERG למגבר דיפרנציאלי באמצעות במת ראש. יש לחבר את המגבר לכניסה האנלוגית של לוח הממשק של מערכת המערך מרובת האלקטרודות. השתמש בתוכנת ההקלטה עבור מערך האלקטרודות המרובות כדי להקליט ולאחסן את נתוני הקלט מ- ex vivo ERG.
הגדר את הרווח של מגבר הדיפרנציאל ל-100 והוסף הגברה נוספת של מתח פי 10, בהתאם למפרט הדיגיטייזר. הגדר את מסנן המעבר הנמוך ל- 100 הרץ. לחלופין, כדי להמיר מערך מהדק טלאי, חבר את מחזיק הדגימה ex vivo ERG באמצעות במת ראש למגבר דיפרנציאלי, אשר חייב להיות מחובר לבמת הראש של מגבר מהדק התיקון.
השתמש בתוכנת מערכת מהדק התיקון ובדיגיטציה כדי להקליט ולאחסן את נתוני הקלט מ- ex vivo ERG. הגדר את הפרמטרים כפי שהוצג קודם לכן. חבר נורות LED עם אורכי הגל המתאימים למיקרוסקופ.
כדי לשלוט בגירויים של אור, השתמש בדרייבר LED הנשלט על-ידי יציאות אנלוגיות מדיגיטייזר. שלוט בנורות ה- LED באמצעות תוכנת הקלטה שתאפשר הפעלה של גירויים קלים. לאחר מכן, כייל את תפוקת האור של נוריות ה-LED במיקום הרשתית במחזיק הדגימה באמצעות פוטודיודה.
במידת הצורך, הכנס מסנני צפיפות ניטרליים כדי לעמעם את עוצמת האור בנתיב האור. כדי להכין את האלקטרודה, הכנס אלקטרודת גלולת כסף כסופה כלוריד למחבר פיתיון מושחל. מלא את החלק הפנימי של מחבר הפיתיון בדבק חם, והכנס שקע של שני מילימטרים לתוך הדבק החם מהצד שאינו מושחל.
הלחמה חוט כסף של אלקטרודת EP-1 לשקע שני המילימטרים. הברג את האלקטרודה המוגמרת עם טבעת O על החוט ליציאות האלקטרודה של מחזיק הדגימה ex vivo ERG. עבור עיניים גדולות, כולל עיניים תורמות אנושיות, נקה את הגלובוס של רקמת החיבור הנותרת והסר את החלק הקדמי ואת העדשה.
השתמש באזמל כדי לבצע חתך כשלושה מילימטרים מהלימבוס. הכנס מספריים דיסקציה מעוקלים לתוך החתך לחתוך לאורך הלימבוס כדי להסיר את החלק הקדמי של העין עם העדשה. השג דגימות רשתית עבור אלקטרורטינוגרפיה ex vivo עם אגרוף ביופסיה חד פעמית של שלושה עד שישה מילימטרים.
כדי להרכיב את הרקמה על מחזיק הדגימה, הניחו את החצי התחתון של מחזיק הדגימה לתוך צלחת פטרי גדולה, ומלאו אותה במדיום איימס מחומצן כך שהכיפה של מחזיק הדגימה פשוט שקועה. תופסים בזהירות את קצה הרשתית עם מלקחיים עדינים ומעבירים את הרשתית על הכיפה של מחזיק הדגימה ex vivo, צד הפוטורצפטור פונה כלפי מעלה. הרם את מחזיק הדגימה מהפתרון של איימס, ודאג שהרשתית תישאר במקומה.
ייבש לחלוטין את הצלחת של מחזיק הדגימה כדי למזער רעשים, crosstalk חשמלי, ו shunting אותות. לאחר מכן הרכיבו את שני חצאי מחזיק הדגימה עם ארבעה ברגים וחברו את קו הזליפה. להניע את האלקטרודה בחצי התחתון של מחזיק הדגימה ולחבר את כבל האנודה לצד הרשתית הפנימית ואת כבל הקתודה לצד הפוטורצפטור.
השתמשו במחזיק הדגימה עם לפחות מיליליטר אחד לדקה של איימס מחומצן למשך 10 עד 20 דקות כדי לאפשר לתגובות האור להתייצב. Ex vivo ERG אפשר הקלטה של תגובות אור פוטורצפטור ותאי ON-דו-קוטביות מרשתית העכבר. הקלטה של תגובות פוטורצפטורים מרשתיות של תורמים אנושיים הייתה אפשרית עם עיכוב של עד חמש שעות לאחר המוות של enucleation ועיכוב של פחות מ-20 דקות עבור תגובות תאים ON-bipolar.
בתנאים אידיאליים, אמפליטודות התגובה והקינטיקה בשני סוגי התאים היו יציבות יחסית לאורך זמן, אך הראו ירידה איטית 40 עד 45 דקות לאחר שהרשתיות הורכבו על מחזיק הדגימה. טמפרטורה מופחתת במחזיק הדגימה האטה מאוד את הקינטיקה של קולטני פוטו ותאי ON-bipolar. עם זאת, הוא הפחית את המשרעת של גל B אך לא את גל A.
לעומת זאת, האטת קצב הזליפה הפחיתה את המשרעת של תגובות קולטני הצילום ותאי ON-bipolar, אך לא השפיעה על הזמן המרומז של גל A או B. הפסקת הזליפה למשך 10 דקות ולאחריה רפרפוזיה הביאה לאובדן מוחלט של תפקוד התאים הדו-קוטביים עם תגובות פוטורצפטור משומרות. מהירות זלוף מספקת וטמפרטורה פיזיולוגית הן קריטיות לקבלת תגובות יציבות, בפרט, מתאים ON-bipolar ב- ex vivo ERG.
פרוטוקול זה מאפשר לחקור לעומק את ההבדלים בתפקוד הפוטורצפטור במקולרי ובפריפריה האנושית, תוך מענה על שאלות שבעבר יכלו להתבצע רק בפרימטים שאינם אנושיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לשיפור שיטות הקלטה של אלקטרוטרטינוגרם (ERG) אקס וויו (ex vivo) כדי לחקור את תפקוד הנוירונים ברשתית. הגישה מתמקדת בתאי ביפולר ON ובתפקוד הפוטורצפטורים תוך שימוש בתצורות שונות, ומספקת תובנות לגבי השפעות פרמקולוגיות על הרשתית במצבים בריאים וחולים.
רכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- אלקטרופיזיולוגיה
- נוירו-מדעים
- ביולוגיה של הרשתית
רקע
- אתגרים בהקלטה יעילה של תפקוד הרשתית בהגדרות אקס וויו.
- חשיבותם של תאי ביפולר ON ופוטורצפטורים לבריאות הרשתית ולמחלות.
- הצורך בשיטות אמינות לכמת התערבויות פרמקולוגיות.
- טכניקות קיימות לרוב חסרות נגישות ודיוק.
מטרת המחקר
- לשפר את ההקלטה של תגובות רשתית לאור תוך שימוש בציוד משופר.
- להקל על הניתוח של תפקוד פוטורצפטורים ותאי ביפולר ON.
- להעריך תגובות פרמקולוגיות בתאי רשתית.
שיטות ששימשו
- הפרוטוקול משתמש ב-ERG אקס וויו עם מערכי אלקטרודות מרובים או מערכות Patch Clamp.
- רשתית עכבר ורשתית של תורמים אנושיים משמשות כמודלים ביולוגיים.
- לכל תצורה יש פרמטרים קריטיים להגברה ולסינון כדי להבטיח הקלטות מדויקות.
- הדגש על שמירה על טמפרטורה וקצבי פריפוזיה במהלך הניסוי.
- כיול תפוקות אור באמצעות פוטודיודות חיוני לגירוי מבוקר.
תוצאות עיקריות
- שיטות משופרות מאפשרות הקלטות יציבות הן מפוטורצפטורים והן מתאי ביפולר ON.
- התגובות נשארות עקביות, עם ירידות קלות שנצפו לאחר זמני הרכבה ממושכים.
- טמפרטורה וקצב פריפוזיה משפיעים באופן משמעותי על עוצמת התגובות, במיוחד של גל B.
- ממצאים מבהירים את ההבדלים בתפקוד פוטורצפטורים באזורי רשתית אנושיים שונים.
מסקנות
- מחקר זה מדגים שיטה אמינה לחקר תפקוד נוירונים ברשתית.
- נגישות משופרת מאפשרת מחקרי פרמקולוגיה מתקדמים הרלוונטיים לבריאות הרשתית.
- הממצאים מגבירים את ההבנה של מנגנונים נוירוניים ופוטנציאל להתערבויות למחלות רשתית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Optimizing ex vivo ERG conditions enables stable, high-fidelity recording of retinal neuronal responses, particularly from ON-bipolar cells and photoreceptors, supporting mechanistic de-risking in retinal target validation. The method allows quantitative assessment of pharmacological interventions in isolated tissue, reducing systemic variability and improving predictive confidence in preclinical models. This positions the technique as a translational bridge for evaluating retinal therapeutics across species, including human donor tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of retinal neuronal cell-type-specific contributions to light responses, supporting target hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Facilitates pharmacological agent introduction to quantify efficacy on retinal function, improving target de-risking.
- Predictive Value: Stabilized ON-bipolar cell B-wave recordings allow assessment of compound effects over time, supporting lead identification and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Optimized perfusion speed and physiological temperature maximize response amplitude and stability, enabling reliable compound screening.
- Quantitative Output: Provides high signal-to-noise measurements of photoreceptor and ON-bipolar cell responses, supporting dose-response and kinetic analyses.
- Scalability: Adaptable to retina samples from small and large eyes, including human donor tissue, supporting cross-species assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables comparison of photoreceptor function between human macular and peripheral retina, supporting biomarker alignment.
- Disease-Relevant System: Maintains retinal function ex vivo for up to five hours postmortem, allowing evaluation of pathological changes and therapeutic interventions.
- Mechanistic De-risking: Isolates tissue-intrinsic retinal responses, minimizing confounding systemic influences in preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The optimized ex vivo ERG method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, supporting data-driven go/no-go decisions in retinal therapeutic development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of retinal neuronal mechanisms and pathway-specific contributions to visual function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative light response readouts enabling reliable compound evaluation in retinal assays.
- Analytics: Generates kinetic and amplitude data (A and B waves) that allow comparison of treatment effects across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects findings from model systems to human donor retina, supporting preclinical-to-clinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for retinal functional assessment across discovery and preclinical teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on retinal cell-type-specific responses, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardized perfusion and temperature controls improve reproducibility and reduce variability in retinal function measurements.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by improving predictive confidence in retinal target engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of retinal therapeutics by de-risking mechanistic uncertainty in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal tissue dissection, electrophysiology, and pharmacological agent handling.
- Dependent on specialized equipment including differential amplifiers, LED drivers, photodiodes, and perfusion systems.
- Necessitates standardized protocols for tissue mounting, perfusion speed (at least 1 mL/min), and physiological temperature maintenance.
- Adaptation across model systems requires optimization of biopsy punch size and dissection techniques for varying eye dimensions.
- Practical limitations include gradual decline in response stability after 40–45 minutes post-mounting, necessitating timely experimental execution.
