Name: הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למדו את שיטת ההקפאה הידנית לצורך הכנת דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד. שיטה זו מאפשרת שימור איכותי וחסכוני של מבנים תלת-ממדיים בקנה מידה גרעיני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדת הרציק על החשיבה הביקורתית ומתן משוב על כתב יד זה ותוכן הווידאו. M.A.H.Jr נתמך על ידי NIH R35 GM138206 וכמלומד סירל. H.P.M.N נתמך על ידי מענק אימון ביופיסיקה מולקולרית (NIH T32 GM008326). ברצוננו גם להודות לביל אנדרסון, צ'ארלס באומן וד"ר גבריאל לנדר במכון המחקר סקריפס על העזרה בתכנון, הרכבה ובדיקה של הבוכנה הידנית המוצגת בסרטון.

אין לנו מה לחשוף.

vitrification של דגימות ביולוגיות להדמיה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית חלקיק יחיד (cryoEM) נשאר צעד חשוב מאוד לקביעת מבנה מוצלחת. שיטת הכתם והצלילה הידנית המתוארת בפרוטוקול זה מייצגת שיטה חסכונית, אמינה וחזקה להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות בסרטים דקים של קרח שרץ להדמיית cryoEM. באמצעות השיטות המתוארות בכתב היד, החוקרים יוכלו להרכיב ולהפעיל את הבוכנה הידנית, להכין קריוגן המתאים לדגימות ביולוגיות הקפאת הבזק, ולהכתים ולצלוח באופן ידני רשתות EM המכילות דגימות ביולוגיות. בעוד שיטה זו היא די חזקה, יש לנקוט זהירות במ...

מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד (cryoEM) היא טכניקה מבנית רבת עוצמה שניתן להשתמש בה כדי לפתור מבנים של דגימות ביולוגיות דינמיות לרזולוציה כמעט אטומית1,2,3,4. ואכן, ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות גלאי אלקטרונים ישיר4,5,6,7,8,9,10, שיפורים במקורות אלקטרונים4,11,12,13,14 ויציבות עדשה אלקטרומגנטית15, יחד עם המשך הפיתוח של רכישת נתונים 16,17 וחבילות תוכנה לניתוח18,19, אפשרו לחוקרים לקבוע כעת באופן שגרתי מבנים של דגימות מחונכות היטב ל-3 רזולוציה של Å או טוב יותר4,11,13,14,20,21,22,23 . למרות יכולות הדמיה ועיבוד נתונים משופרות אלה, הכנת רשת CryoEM נותרה המכשול הגדול ביותר לקביעת מבנה מוצלח ברזולוציה גבוהה ולעתים קרובות משמשת צוואר בקבוק ניכר בזרימת העבודה EM24,25,26,27.
CryoEM מסתמכת על הדמיה של דגימות ביולוגיות בפתרונות מימיים שהוקפאו כדי ליצור סרט דק של קרח "דמוי זכוכית" - תהליך המכונה vitrification - המשמר את המצב הביוכימי המקומי. Vitrification של דגימות ביולוגיות עבור cryoEM שתחילתה מעל 40 שנים28,29,30 וטכניקות וציוד רבים שפותחו עבור תהליך זה מסתמכים על שיטת blot-and-plunge המפורטת במקור31,32,33,34,35 לפיו נפח קטן של מדגם (למשל, 1-5 μL) מוחל על רשת EM מיוחדת לפני הפתרון העודף מוסר באמצעות אינטראקציה פיזית של הרשת עם נייר סופג., התזמון של תהליך זה נקבע בדרך כלל אמפירית עבור כל דגימה כמרכיב קריטי של הקפאת דגימות הוא עובי סרט הקרח הזגג - אם הקרח סמיך מדי אז איכות ההדמיה מתדרדרת באופן דרמטי עקב פיזור מוגבר של קרן האלקטרונים בעוד קרח דק מדי יכול להגביל את אוריינטציות החלבון ו / או להוציא חלקיקים ממרכז חורי רדיד הרשת36 . הסתמכות זו על עובי הקרח המושלם עבור CryoEM חלקיק יחיד הובילה למגוון רחב של טכניקות וציוד שיכולים להקפיא דגימות, כולל רובוטיקה37,38, microfluidics42, והתקנים קוליים או ריסוס27,39,40,41,42,43,44 . בשנים האחרונות, חלק ממכשירי הכנת הדגימה הפופולריים ביותר מסתמכים על שימוש ברובוטיקה להקפאה אוטומטית של דגימות בטכניקת הכתם והצללה45. בעוד מכשירים אלה נועדו ליצור עובי קרח מתאים להדמיה, לעתים קרובות הם נשארים יקרים מדי עבור מעבדות בודדות לרכוש ולתפעול והם נמצאים בדרך כלל בתוך מתקני cryoEM בתעריפים לשעה לשימוש. בשנים האחרונות, טכניקת הכתם וצלילה הידנית המקורית חזרה לשימוש מוגבר3,47,48,49,50,51,52. ואכן, מכשיר כתם וצלילה המופעל באופן ידני יכול להשיג רשתות קריום באיכות גבוהה בשבריר מהעלות של עמיתים רובוטיים. יתר על כן, סופג ידני גם מציע למשתמשים יותר שליטה על סופג כמו חוקרים יכולים להתאים את סוג של blotting (כלומר, back-blotting של הרשת, החלקה קדמית של הרשת, וכו '), וזמן סופג בהתבסס על כל מדגם בודד ושאלות מחקר.
במאמר זה, אנו מספקים פרטים על איך להקפיא ביעילות דגימות ביולוגיות באמצעות מכשיר vitrification כתם וצלילה ידני מסורתי בשילוב עם פלטפורמת dewar מעוצבת בהתאמה אישית53. שיטות עבודה מומלצות, כולל הכנת קריוגן, טיפול ברשת, יישום מדגם, סופג, כמו גם מלכודות נפוצות והמלצות על איך להתגבר על משוכות אלה מסופקים. עצה כיצד להגדיל את עובי הקרח רבייה בין תכשירי רשת וכיצד לשנות כתמי מדגם בהתבסס על סוג הדגימה הביולוגית נדונים. בהתחשב בעלות הנמוכה הקשורה לרכישה ותפעול של הבוכנה הידנית המתוארת בכתב יד זה, מעבדות ברחבי העולם יכולות להכין דגימות ביולוגיות עבור cryoEM באופן חסכוני וניתן לשחזור.

<table><tbody><tr><td>תיבת אחסון רשת 4 חריצים</td><td>טד פלה</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>14 מד שטוח מתכת מחלק טיפ אמזון</td><td></td><td></td> B07M7YWWLT <td></td></tr><tr><td>22x22 מ"מ כיסוי זכוכית מרובעת</td><td>סיגמא</td><td>C9802-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ זכוכית צלחת פטרי לאחסון רשתות</td><td>פישר</td><td>08-747A</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי זכוכית 100 מ"מ לאחסון נייר ווטמן</td><td>פישר</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי זכוכית 150 מ"מ לאחסון נייר ווטמן</td><td>פישר</td><td>08-747F</td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל</td><td>פישר</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>קלקר כחול dewar</td><td>Spear Lab</td><td>FD-500</td><td></td></tr><tr><td>כלי אתאן פליז</td><td>Lasco</td><td>17-4075</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה הידוק</td><td>טד פלה</td><td>38825</td><td></td></tr><tr><td>מגבוני משימות עדינים</td><td>פישר</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>ווסת דו-שלבי עם שסתום בקרה</td><td>Airgas</td><td>Y12N245D580-AG</td><td></td></tr><tr><td>בסיס רשת Dewer</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת אתאן</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיכל פרופאן אתאן</td><td>Praxair</td><td>ET PR50ZU-G</td><td>אתאן (50%) : פרופאן (50%) במיכל בלחץ גבוה</td></tr><tr><td>מיכל אתאן</td><td>Praxair</td><td>UN1035</td><td>אתאן (100%)</td></tr><tr><td>זרוע גמישה אור משימה</td><td>Amscope</td><td>LED-11CR</td><td></td></tr><tr><td>רשתות (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 רשת)</td> <td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>Q325AR1.3</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אדים</td><td>יעד</td><td>719438</td><td></td></tr><tr><td>מד לחות</td><td>ThermoPro</td><td>B01H1R0K68</td><td></td></tr><tr><td>מעיל מעבדה</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חנקן נוזלי dewar</td><td>וורת'ינגטון</td><td>כפפות חנקן נוזלי LD4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>פישר</td><td>19-059-925</td><td></td></tr><tr><td>מעמד בוכנה ידני (מעמד שחור + דוושת רגל)</td> <td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mark 5 (פלטפורמת צלילה)</td> <td>כפפות ניטריל UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>82026-424</td><td></td></tr><tr><td>P20 פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>13-690-029</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR</td><td>אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E0030124286 טיפים לפיפטה</td><td>ibis מדעי</td><td>63300005</td><td></td></tr><tr><td>מנורת טבעת</td><td>אמזון</td><td>B07HMR4H8G</td><td></td></tr><tr><td>משקפי בטיחות</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>אמזון</td><td>פיסקרס 01-004761J</td><td></td></tr><tr><td>מברג</td><td>איירונסייד</td><td>354711</td><td></td></tr><tr><td>סרט</td><td>פישר</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה להעברת תיבת רשת</td><td>אמזון</td><td>LTS-3</td><td></td></tr><tr><td>צינורות טיגון</td><td>פישר</td><td>14-171-130</td><td></td></tr><tr><td>נייר ספיגה ווטמן</td><td>פישר</td><td>1001-090</td><td></td></tr></tbody></table>

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

הדמיית דגימות ביולוגיות עם אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד (cryoEM) דורשת שכבה דקה של קרח זגוגי המכיל את הביומולקולים של עניין. למרות התפתחויות טכנולוגיות רבות בשנים האחרונות שדחפו את CryoEM של חלקיק יחיד לחזית הביולוגיה המבנית, השיטות שבאמצעותן דגימות מתחדשות להדמיה ברזולוציה גבוהה נשארות לעתים קרובות הצעד המגביל את הקצב. למרות שמאמצים רבים שנעשו לאחרונה סיפקו אמצעים להתגבר על משוכות שנתקלו בהן לעתים קרובות במהלך vitrification דגימה, כולל פיתוח של תמיכה מדגם חדשני ומכשור ויטרציה חדשני, הבוכנה המסורתית המופעלת ידנית נשארה מרכיב עיקרי בקהילת cryoEM בשל העלות הנמוכה לרכישה וקלות הפעולה. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות לשימוש במכשיר סטנדרטי בסגנון גיליוטינה המופעל באופן ידני כתם וצלילה להתחדשות של דגימות ביולוגיות להדמיה ברזולוציה גבוהה על ידי קריום חלקיק יחיד. בנוסף, בדרך כלל נתקל בבעיות והמלצות פתרון בעיות כאשר הכנה סטנדרטית נכשלת להניב דגימה מתאימה מתוארים גם.

ביצוע מוצלח של פרוטוקול הכתם והצללה המתואר כאן יביא לשכבה דקה ואחידה של קרח זגוגית, נטולת קרח משושה, מזהמים ושיפועים גדולים של קרח בלתי שמיש שניתן לצפות בהם תחת מיקרוסקופ האלקטרונים (איור 3). מגע לא עקבי של נייר הכתמים עם משטח הרשת, הסרה מוקדמת של נייר הכתם, או הזזת נייר הכתם במהלך מגע רשת יכול להקטין את איכות הקרח הזגג ולהוביל לעובי קרח לא עקבי על פני רשת EM (איור 4)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg...

כתב יד זה מתאר את שיטת הכתם וצלילה להקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד.

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

שיטת הצלילה הידנית המתוארת כאן היא שיטה חסכונית ואמינה להכנת דגימות למיקרוסקופיית אלקטרונים שידור. בסרטון זה, אנו להדגים כיצד להגדיר את הבוכנה הידנית, להכין קריוגן, ולבצע סופג ידני וצלילה של רשתות EM. הכן את סביבת הצלילה הידנית.הליך זה צריך להתבצע בחדר קר המתוחזק ב 40 מעלות צלזיוס עם לחות של יותר מ 95%אנו ממליצים להשתמש בחומרים המוצגים כאן וכפי שתואר בפרוטוקול המקוון עבור סופג ידני וצלילה. הכן את הקריוגן דיואר ואת הבוכנה הידנית. כדי להרכיב את קריוגן דיואר, ראשית להתקין את בסיס הפלטפורמה בתחתית הקלקר הכחול דיואר, להבטיח כי הוא שטוח ורמה.לאחר מכן מניחים את מחזיק כלי האתאן על גבי בסיס הרציף ומכניסים את כלי האתאן מפליז. לבסוף, למקם את פלטפורמת אחסון רשת ספינינג. לאחר מכן, אתר את דיואר צולל לבסיס הבוכנה הידנית.מרכז את ספינת האתאן מתחת לזרוע הצוללת ואבטח את דיואר צולל לבסיס. כדי להגדיר את גובה הצלילה הידני, תחילה חבר סרט טרי לבסיס הזרוע הצוללת. לאחר מכן, הדק זוג פינצטה מהדקת על ידי גלישה מאובטחת של הקלטת סביב הזרוע הצוללת ובסיס הפינצטה.ודא פינצטה מחוברים בחוזקה על ידי הקשה עליהם בקלילות. החזק את זרוע הצלילה והורד לאט לאט את הפינצטה לתוך כלי האתאן מפליז על ידי דיכוי דוושת הרגל. התאם את המיקום של דיואר הצולל כך פינצטה לאתר לאמצע כלי האתאן פליז.קצות פינצטה לא צריך ליצור קשר עם הגודל או התחתון של כלי האתאן פליז כדי למנוע נזק פינצטה בוכנה ידנית. לאחר המיקום מוגדר, לאפס את זרוע הצלילה הידנית. הכן את הקריוגן.הכנת קריוגן צריכה להתבצע בחדר מאוורר היטב וציוד מגן אישי מתאים צריך להיות משוחק בכל עת. בתור התחלה, חנקן נוזלי עני ישירות לתוך Dewar צולל, עצירה כאשר רמת החנקן הנוזלי מגיע לחלק העליון של כלי האתאן פליז. המערכת צריכה להיות קרה מספיק כדי להמשיך לאחר החנקן הנוזלי מפסיק לבעבע באלימות.זה ייקח בערך חמש דקות. אתאן מגיע כגז דחוס וצריך לדחוס אותו. כדי להגדיר את זרימת הגז עבור עיבוי אתאן אופטימלי, להכניס את קצה קו הגז אתאן לתוך מים 250 מל ולצפות המבעבע.זרימת הגז צריכה לייצר זרם קבוע של בועות שאינו משבש באלימות את פני המים. כדי להתחיל לדחוס אתאן, מניחים את קצה קו הגז אתאן בתחתית כלי האתאן מפליז. מערבבים לאט את קצה המתכת ומתחילים להניך את האתאן.ברגע שהאתאן יתחיל להתקרר, זה יעשה רעש נשמע. מלא את כלי האתאן מפליז לשלושה רבעים מלאים באתאן נוזלי. תמלא את דיואר הצוללת בחנקן נוזלי, מה שמבטיח שהוא ייגע בכלי האתאן מפליז אך לא יישפך לתוכו.תוספת של חנקן נוזלי הכרחית להקפאת אתאן אחידה. מניחים את מכסה הקצף על דיואר הצולל הכחול, ומאפשרים לאתאן להתמצק לחלוטין. הפעל מחדש את זרימת גז האתאן והכניס בזהירות את קצה קו הגז לאתאן המוצק.חשוב למקם את הקצה אנכית לתוך הכלי ולחלק אתאן בתחתית. מערבבים לאט את קצה המתכת כדי להמיס את האתאן ולהביא את רמת האתאן הנוזלי עד לחלק העליון של הכלי. סוגרים את המכסה כדקה ומאפשרים לאתאן להתגבש סביב קצוות כלי הפליז עד שניים עד שלושה מילימטרים של אתאן מוצק נראים.האתאן נמצא כעת בטמפרטורה אידיאלית להקפאת דגימות ביולוגיות. חבר את דיואר צולל בזהירות לבסיס הבוכנה הידנית. הדקו זוג פינצטה מהדקת על ידי עטיפת הסרט סביב הזרוע הצונחת ובסיס הפינצטה.החזק את זרוע הצלילה ולהוריד לאט את פינצטה לתוך האתאן הנוזלי על ידי מדכא את דוושת כף הרגל. התאם את המיקום של Dewar צולל כך פינצטה לאתר לאמצע האתאן הנוזלי, הימנעות ממגע עם טבעת האתאן מוצק. הכן חומרים ואביזרים צוללים.הכן את נייר הכתמים על ידי חיתוך כל נייר סינון עגול לרצועות ברוחב של סנטימטר אחד. הימנעו מלגעת במרכז נייר הכתמים והשליכו את חתיכות הקצה הקטנות יותר. חשוב לוודא כי רצועות הנייר הכתומים יבשות, נקיות וללא מזהמים.לפני הצלילה, מניחים את תיבות הרשת לתוך דיואר צולל לתוך החריצים הנכונים. ודא שהרשת מכסה את היכולת שלנו להסתובב. הכן דגימות CryoEM על ידי הקפאת צלילה.בשל המגוון של רשתות ותכשירי רשת, בצע פרוטוקולים מומלצים לעיבוד הרשתות הידרופיליות. כדי לטפל כראוי ברשתות, השתמש פינצטה נקיה ויבשה כדי להרים את הרשתות ההידרופיליות בטבעת החיצונית. החלק את מלחצי הפלסטיק כדי לאבטח את הרשת והקש בעדינות על פינצטה כדי להבטיח שהרשת מהודקת כראוי.החל שלושה microliters של מדגם על החלק הקדמי של הרשת מוחזק פינצטה מהדק. חברו את הפינצטה בחוזקה לזרוע הצלילה הידנית על ידי עטיפת הקלטת סביב בסיס הפינצטה. המדגם מוכן כעת להימחק ולצלל קפוא.החזק כל קצה של רצועה נקייה של נייר סופג בין האצבעות והאגודלים. הנח את ידיך על קצה דיואר צולל כדי לבסס עמדה יציבה. נייר הכתמים צריך להיות בערך סנטימטר אחד מפני השטח של הרשת.כופפו את נייר הכתמים עד שהמרכז יצור קשר עם הרשת. חשוב כי נייר סופג מקביל משטח הרשת כדי לאפשר מגע אפילו ולמנוע נזק לרשת. כאשר חזית הנוזל הנייד מפסיקה להתפשט, התחל לספור.כתם הרשת במשך חמש שניות. הצמידו את אצבעותיכם לגזרים, מתחו את הנייר המנופח והסירו אותו במהירות מפני השטח של הרשת. בו זמנית, לחץ על דוושת הרגל כדי לשחרר את זרוע הצלילה הידנית, צולל את הפינצטה מחזיקה את הרשת לתוך האתאן הנוזלי.תוך שמירה על הרשת הקפואה הטרייה באתאן הנוזלי, ניתקו בזהירות את פינצטה מזרוע הצלילה הידנית. בזהירות לבטל את פינצטה כך הרשת נשלפת. העבר את הרשת לתוך מאגר החנקן הנוזלי מתחת לכלי האתאן מפליז בתנועה מהירה אחת מהאיתאן לחנגן הנוזלי.מקם את הרשת בתיבת הרשת. תוצאות מייצגות. מתוך וידאו זה, חוקרים צריכים להיות מסוגלים להכין רשתות CryoEM, כגון זה, עם ריבועים רבים המכילים סרטים דקים של קרח הזגום להדמיה ברזולוציה גבוהה.ניתן להתאים את ריכוז הדגימה ואת זמן ההחלקה כדי למטב את צפיפות החלקיקים. כאן, אנו להדגים את זרימת העבודה המלאה להקפאת דגימות CryoEM באמצעות שיטת blot וצלילה. השתמש פינצטה מהדק נקי כדי להרים רשת חדשה ולאבטח את הרשת במקום.החל שלושה microliters של מדגם בצד ההידרופילי של הרשת ופינצטה מאובטחת לזרוע הצלילה הידנית על ידי גלישת הקלטת סביב ידית פינצטה. מקם את נייר הכתמים במקביל למשטח הרשת וכופף בעדינות את נייר הכתמים לכיוון הרשת כדי ליזום כתמים. לאחר פרק הזמן הרצוי, הזז את נייר הכתם בתנועת הצמדה הרחק מפני הרשת תוך כדי דיכוי דוושת כף הרגל כדי לשחרר את הזרוע הצוללת, צולל את הרשת לתוך האתאן הנוזלי.בזהירות לשחרר את הקלטת מסביב פינצטה וזרוע הצלילה הידנית. בתנועה מהירה אחת, העבירו במהירות את הרשת מכלי האתאן למאגר החנקן הנוזלי. מקם את הרשת בתיבת האחסון של הרשת ועטוף את פינצטה ב-Kim Wipe כדי להתייבש;חזור.

manual-blot-plunge-freezing-biological-specimens-for-single-particle

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנחנו כאן להמחיש כיצד להשתמש אלקטרונים cryotomography (ECT) כדי ללמוד את ultrastructure של תאים חיידקיים של כמעט ילידי מדינות, כדי "macromolecular" (~ 4 ננומטר) החלטה.

אלקטרונים Cryotomography של תאים חיידקיים

אנו מתארים שיטה לאיתור חלבונים מתויגים fluorescently בmicrographs אלקטרונים. פלואורסצנטי הוא מקומי הראשון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה המופעל על חלקי Ultrathin. תמונות אלה אז מיושר לmicrographs אלקטרונים של אותו הסעיף.

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

Cryo אלקטרונים מיקרוסקופים, או סורק (SEM) או הילוכים (TEM), נמצא בשימוש נרחב לאפיון של דגימות ביולוגיות או חומרים אחרים עם תכולת מים גבוהה 1. SEM / אלומת יונים ממוקדת (FIB) משמשת לזיהוי תכונות של עניין בדגימות ולחלץ lamella להעברה לcryo-TEM דק, אלקטרונים שקופים.

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

כתב יד זה מתאר שיטה קלה לשימוש בעלות הנמוכה cryofixation המאפשרת הדמית תאי השעיה ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים.

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

מכשיר ושיטות ההכנה של אמצעי אחסון מדגם בגודל nanoliter במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מוצג. אין מדרגות נייר סופג נדרשים, וכך להימנע ההשלכות מזיקה שיכולה להיות חלבונים, הפחתת הדגימה אובדן ולאפשר הניתוח של תא בודד lysate עבור פרוטאומיקס חזותי באופן משמעותי.

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשילוב שני דוגמת עיבוד טכניקות, בלחץ גבוה מקפיא מדגם בסיוע מיקרוגל עיבוד, ואחריו שרף מינימלי הטבעה לרכישת נתונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה קרן (שיקרתי-SEM) יון ממוקד. הוכח באמצעות העכבר העצב הטיביאלי מדגם Caenorhabditis elegans.

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

קביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים באמצעות cryoEM הפכה לשגרה עבור סוגים מסוימים של חלבונים ומתחמים. כאן, צינור זה מסוכם (הכנה לדוגמה, סינון, רכישת נתונים ועיבוד) והקוראים מופנים למשאבים ומשתנים מפורטים נוספים שעשויים להשתנות במקרה של דגימות מאתגרות יותר.

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

כאן אנו מראים כיצד להשתמש במכשיר הקפאת הכריך להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים בתרבית, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. אנו גם מראים כיצד להכין דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה.

הקפאה מהירה באמצעות מכשיר הקפאת כריך לשימור אולטרה-מבני טוב של דגימות ביולוגיות במיקרוסקופיית אלקטרונים

כאן, אנו מציגים צינור לכרסם קרן יונים ממוקדת מתאם תלת-ממדי על הנחיית הכנת דגימות תאיות לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית. המיקום התלת-ממדי של חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי נקבע תחילה על ידי מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, ולאחר מכן מיועד לכרסום. הפרוטוקול מתאים לתאי יונקים, שמרים וחיידקים.

הכנת הדגימה על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת תלת-ממדית לטומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה

טכניקת הקילוף-כתם היא שיטת הכנה לרשת cryo-EM המאפשרת הפרדת דגימות ביולוגיות רב-שכבתיות ומרוכזות לשכבות בודדות כדי להפחית את העובי, להגדיל את ריכוז הדגימה ולהקל על עיבוד התמונה.

טכניקת ה-peel-blot: שיטת הכנת דגימות Cryo-EM להפרדת שכבות בודדות מדגימות ביולוגיות רב-שכבתיות או מרוכזות

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליישום שכבה אחת של גרפן על רשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים וכיצד להכין אותם לשימוש בקביעת מבנה cryoEM.

ייצור רשתות מצופות גרפן חד-שכבתיות למיקרוסקופ קריואלקטרון

למדו את שיטת ההקפאה הידנית לצורך הכנת דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד. שיטה זו מאפשרת שימור איכותי וחסכוני של מבנים תלת-ממדיים בקנה מידה גרעיני.

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

גלה סרטונים נוספים