Name: מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: למדו שיטת השתלה פשוטה ויעילה לעוברי דגי זברה לחקר מולקולות איתות והפקת מוטנטים של קו גרמלי. הפרוטוקול משתמש במכשיר בעלות נמוכה ומתאים גם לדגי מדקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך על ידי חברת מקס פלאנק וקיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס' 637840 (QUANTPATTERN) והסכם מענק מס ' 863952 (ACE-OF-SPACE)).

<ol><li>Spemann, H., Mangold, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+embryonic+primordia+by+implantation+of+organizers+from+a+different+species%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+for+Microscopic+Anatomy+and+Developmental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species.</a> Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).</li>
<li>Müller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336 (6082), 721-724 (2012).</li>
<li>Donovan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+Activin-A+signaling+promotes+melanoma+growth+and+metastasis+through+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion.</a> Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).</li>
<li>Pomreinke, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+BMP+signaling+and+distribution+during+zebrafish+dorsal-ventral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning.</a> eLife. 6, 25861(2017).</li>
<li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li>
<li>Soh, G. H., Pomreinke, A. P., Müller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Nodal+and+BMP+signaling+by+mutual+signaling+effector+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism.</a> Cell Reports. 31 (1), 107487(2020).</li>
<li>Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+reorganization+of+xanthophores+fine-tunes+and+colors+the+striped+pattern+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish.</a> Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).</li>
<li>Frohnhöfer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iridophores+and+their+interactions+with+other+chromatophores+are+required+for+stripe+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish.</a> Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+Nodal+signal+Squint+functions+as+a+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen.</a> Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).</li>
<li>Ciruna, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germline+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29.+4th+edn%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394(2009).</li>
<li>Capek, D., Müller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+information+and+tissue+scaling+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Positional information and tissue scaling during development and regeneration.</a> Development. 146 (24), 177709(2019).</li>
<li>Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+stability+in+living+zebrafish+embryos+using+fluorescence+decay+after+photoconversion+%28FDAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266(2015).</li>
<li>Carvalho, L., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yolk+syncytial+layer+in+early+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The yolk syncytial layer in early zebrafish development.</a> Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).</li>
<li>Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dechorionation+of+medaka+embryos+and+cell+transplantation+for+the+generation+of+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055(2010).</li>
<li>Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+restriction+and+multipotency+in+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate restriction and multipotency in retinal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

ההצלחה של ניסוי השתלה מסתמכת מאוד על הכישורים המוטוריים העדינים של הנסיין. כדי לבצע בהצלחה את ההליכים, יש צורך בתרגול. עם זאת, המכשיר המוצג כאן קל יחסית ללמוד ולהשתמש בהשוואה לאחרים בשוק, ובכלל, רק כמה ימים של תרגול נדרשים.
ההצלחה של הליך ההשתלה ניתן לשפר על ידי נקיטת מספר אמצעי זהירות. צעד אחד הוא להבטיח כי micromanipulator הוא באיכות טובה ומסוגל לפעולה חלקה. הוספת עינית עם הגדלה גבוהה יותר לסטריאומיקוסקופ יכולה לעזור למקם במדויק את המחט ביחס לעובר. שימוש בדגי זברה או מדאקה רבייה היטב כדי לרכוש עוברים בריאים ודואג לא לפגוע בעוברים במהלך הטיפול (במיוחד במהלך שלב ההפחתה ואחריו) ישפר גם את שיעור ההצלחה.
בעיות עם רעילות מושהית יכול להיות קשה יותר לפתור. אם עובר מת לאחר כמה שעות - אך לא מיד לאחר ההשתלה - ייתכן שהחלמון נפגע מהמחט (למשל, על ידי כניסה עמוקה מדי לעובר), או אולי התאים נפלטו בכוח רב מדי. רעילות מאוחרת ומוות עוברי יכולים לנבוע גם חלמון או פסולת תאים מוזרקים יחד עם התאים התורמים; סיבה נוספת יכולה להיות חיץ HEPES מתדרדר בפתרון של הצלצול. ניתן להתגבר על בעיות אלה על ידי שטיפת התאים (ראה שלב 1.3.8) או פשוט על ידי שימוש באצווה חדשה של חוצץ, בהתאמה. יתר על כן, עוברים מארח מעוות בניסויים השתלת נבטים עלול לנבוע ריכוזי מורפולינו גבוהים מדי. זה חיוני להשתמש מספיק מורפולינו כדי לפטור לחלוטין את הנבט מסוג הפרא של המארח, ובכך למנוע תאים אלה לתרום לצאצאים - אבל באותו זמן, ריכוזי מורפולינו גבוהים מדי יש להימנע. כמויות מורפולינו עקביות בכל העוברים המארחים המוזרקים (כמה מאות בניסוי טיפוסי) הן אפוא המפתח להצלחת השתלות נבטים. זה יכול להיות עזר על ידי שכשהם את תערובת הזרקת מורפולינו עם צבע מעקב גלוי בקלות14, אשר ניתן לעקוב תחת סטריאופיקוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח כי כל העוברים מקבלים את אותו נפח הזרקה.
ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה כוללים באופן בלעדי מניפולציות של תאים בדגי זברה בשלב blastula או בעוברי מדאקה, אך בעתיד, סביר להניח שניתן יהיה להתאים את המכשיר לשלבים ומינים שונים על ידי שינוי הקוטר והצורה של מחט ההשתלה.

מהניסויים הקלאסיים של מנגולד ושפמן שהדגימו את קיומו של מארגן המורה על היווצרות ציר עוברי1, השתלת תאים בין עוברים הפכה לטכניקה מבוססת לחקר התפתחות עוברית2,3,4,5,6,7,8,9,10 . התקנה נפוצה להשתלה מורכבת ממזרק גז הדוק בכונן מיקרומטר המחובר למחזיק מיקרופיפט באמצעות צינורות גמישים ומאגר מלא בשמן מינרלי12,13. במערך זה, הבוכנה של המזרק מועברת דרך בורג. הלחץ שנוצר באופן זה מועבר למיקרופיט ומשמש לשאוב תאים מעובר אחד ולהפקיד אותם בעובר אחר. עם זאת, מכשיר זה המופעל הידראולי מורכב מחלקים רבים והוא מייגע להרכיב מאפס. מכשירים דומים ניתן לרכוש גם כסט עבודה מלא, נמכר בדרך כלל כמו Microinjectors ידני, וגרסאות מסחריות אלה בדרך כלל עולה יותר מ 1500 US$. הן בגרסה הביתית והן בגרסה המסחרית, המיקרופיט למניפולציה עוברית מופרד מהמכשיר לייצור לחץ (המזרק ההדוק בגז) באמצעות צינורות מלאים בנפט. המניפולציה של micropipette ואת התנועה של הבוכנה, ולכן, צריך להיות מופעל בנפרד עם ידיים שונות, הפחתת התפוקה ואת השירות. יתר על כן, המכשירים מסורבלים כדי להתכונן להשתלה מאז הצינורות צריך להיות מלא בזהירות עם שמן תוך הימנעות היווצרות של בועות. כאן, אנו מתארים מכשיר חלופי המופעל פנאומטית להסרת תאים והשתלה שהוא זול, קל להרכבה ופשוט לשימוש.
המכשיר המוצג כאן כולל מזרק 25 μL גז הדוק מצויד מחזיק micropipette ועולה פחות מ 80 $ בסך הכל. המכשיר מורכב בקלות על-ידי החדרת מחזיק המיקרופייט למזרק באמצעות התאמת מנעול לוהר (איור 1A). לאחר מכן המכשיר מותקן ישירות על מיקרו-מניפולטור, ומאפשר למשתמש לשלוט הן במיקום שלו והן בשאיבה ביד אחת ישירות במיקרו-מניפולטור. זה משאיר בנוחות את היד השנייה חופשית לייצב ולהזיז את צלחת ההשתלה המכילה עוברים תורם ומארח. המכשיר עובד על ידי יניקה ישירה עם אוויר ולא צריך להיות מלא בשמן מינרלי. בשל הכוחות האטרקטיביים בין המים לקירות מחט הזכוכית, תנועה גדולה בבוכנה של המזרק מתורגמת לתנועה קטנה יותר במפלס המים בתוך המחט, כל עוד מפלס המים נמצא בקצה המחודד של מחט הזכוכית. זה מאפשר שליטה מדויקת על מספר התאים השאפתניים ועל מיקום הכניסה שלהם.
כדי להדגים את התועלת של מכשיר זה, אנו מציגים שלושה יישומים בעוברי דגי זברה (דניו ריו). ראשית, אנו מראים כיצד ליצור מקורות מקומיים של מולקולות איתות מופרשות, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחקור היווצרות הדרגתית2,4,6. כאן, עוברים תורמים מוזרקים עם קידוד mRNA מולקולת איתות פלואורסצנטית. התאים התורמים המסומנים בפלואורסצנטיות מושתלים לאחר מכן בעוברים מארחים מסוג בר, שם ניתן לדמיין ולנתח את היווצרותו של שיפוע אות. שנית, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש במכשיר כדי להסיר תאים על ידי extirpation על מנת ליצור עוברים מופחת גודל5,13. לבסוף, אנו מראים כיצד לייצר מוטציות אימהיות-זיגוטיות על ידי השתלת תאים הנושאים כתב תא נבט קדמוני לעוברים מארחים שבהם קו הנבט היה אבלה 6,10. בעתיד, מכשיר ההשתלה המתואר כאן יכול להיות מותאם בקלות למניפולציות עובריות אחרות הדורשות הסרה או השתלה של תאים.

<table><tbody><tr><td>נימי זכוכית 1.0 מ"מ, קצוות חתוכים ללא נימה</td><td></td><td></td><td>להכנת מחט ההשתלה</td></tr><tr><td>נימי זכוכית 1.0 מ"מ, קצוות חתוכים בנימה</td><td></td><td></td><td>להכנת מחטי הזרקה</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> זכוכית 200 מ"ל <td>לפירוק עוברים</td></tr><tr><td>צלחת</td><td></td><td></td> פלסטיק 24 בארות <td>לציפוי אגרוז על מנת לדגור עוברים</td></tr><tr><td>צלחת פטרי זכוכית בקוטר 5 ס"מ</td><td>לפירוק עוברים</td>צלחת פלסטיק 6 בארות לציפוי אגרוז על מנת לדגור עוברים אגרוז לציפוי כלי פלסטיק dnd1 מורפולינו כלי גנים רצף: GCTGGGCATCCATCTCTCCGAC CAT מדיום עובר <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>250 מ"ג/ליטר מלח אוקיינוס מיידי, 1 מ"ג/ליטר מתילן כחול במי אוסמוזה הפוכה מותאמים ל-pH 7 עם סטריאומיקרוסקופ NaHCO3</td></tr><tr><td>פלואורסצנטי עם מסנני GFP/RFP ומקור</td><td></td><td></td> אור <td>להערכת זריקות YSL והשתלות קו נבט</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה מזכוכית</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-1000</td><td>להכנת מחט ההשתלה</td></tr><tr><td>פיפטת</td> <td>פסטר זכוכיתקימבל צ'ייס (דרך פישר)</td><td>63A53WT</td><td>לפיפטינג עוברים; ניתן להדליק את הקצוות כדי להחליק את</td></tr><tr><td>חממת הקצה ב-28 מעלות; C</td><td></td><td></td><td>לדגירת עוברי דג הזברה</td></tr><tr><td>Luer tip 25 &mu; מזרק L המילטון, סדרת 1700</td><td>Hamilton</td><td>Ref: 80201</td><td>חלק ממכשיר ההשתלה</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור ידני עם 3 צירי תנועה</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>לשליטה במכשיר ההשתלה</td></tr><tr><td>משאבת פיפטינג ידנית</td><td>Bio-Tek</td><td>Cat. # 641</td><td>לשימוש עם פיפטות הזכוכית להעברת עוברים</td></tr><tr>בדיקה <td></td><td></td><td>לניתוח מתכת</td><td>לתנועה וסיבוב עוברי דג הזברה</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF2</td><td>להכנת מחט ההשתלה</td></tr><tr>מכשיר <td></td><td></td><td>מיקרו-הזרקה</td><td>להזרקת mRNA ומורפולינו לעוברים</td></tr><tr><td>תבניות מיקרו-הזרקה, חריצים משולשים</td><td>כלי מדע אדפטיבי</td><td>TU-1</td><td>להכנת צלחות מיקרו-הזרקה עם תבניות מיקרו-הזרקה אגרוז</td></tr><tr><td>, בארות בודדות</td><td>כלי מדע אדפטיביים</td><td>PT-1</td><td>להכנת לוחות השתלה עם</td></tr><tr><td>מחזיק מיקרופיפטה אגרוז עם התאמת לואר לנימים מזכוכית 1.0 מ"מ</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH6S10</td><td>חלק ממכשיר ההשתלה</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 ערכת שעתוק</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340M</td><td>ליצירת mRNA מכוסה להזרקה לעוברים</td></tr><tr><td>פלסמיד עם GFP-nos1 3'UTR </td><td></td><td></td><td>פלסמיד שניתן לתמלל לייצור mRNA המקודד GFP עם 3'UTR של nos1</td></tr><tr><td>צלחת פטרי מפלסטיק 100 מ"מ</td><td></td><td></td><td>לציפוי באגרוז על מנת להכין כלי הזרקה והשתלה</td></tr><tr><td>פרוטאז מStreptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td>לפירוק עוברים: הכינו ציר של 5 מ"ג/מ"ל והשתמשו ב-1 מ"ג/מ"ל כדי לפרק עוברים</td></tr><tr><td>רינגר' תמיסת</td><td></td><td></td> s <td>עבור 1 ליטר: הוסף 6.78 גרם NaCl, 0.22 גרם KCl, 0.26 גרם CaCl2 ו-1.19 גרם HEPES; לאחר מכן מלא ל-1 ליטר; התאם את ה-pH ל-7.2; עיקור על ידי</td></tr><tr><td>סינון סטריאומיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td>להזרקה והשתלה</td></tr></tbody></table>

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

מניפולציות עובריות קלאסיות, כגון הסרת תאים והשתלת תאים בתוך העוברים או בין, הן טכניקות רבות עוצמה לחקר תהליכים התפתחותיים מורכבים. עוברים דגי זברה מתאימים באופן אידיאלי למניפולציות אלה מכיוון שהם נגישים בקלות, גדולים יחסית בגודלם ושקופים. עם זאת, מכשירים שפותחו בעבר להסרת תאים והשתלה מסורבלים לשימוש או יקרים לרכישה. לעומת זאת, מכשיר ההשתלה המוצג כאן הוא חסכוני, קל להרכבה ופשוט לשימוש. בפרוטוקול זה, אנו מציגים לראשונה את הטיפול במכשיר ההשתלה, כמו גם את הרכבו מחלקים זמינים מסחרית ונרחבת. לאחר מכן אנו מציגים שלושה יישומים לשימוש בו: יצירת שיבוטים חוץ רחמיים לחקר פיזור אותות ממקורות מקומיים, פירוק תאים לייצור עוברים מופחתי גודל, והשתלת נבטים כדי ליצור מוטציות אימהיות-זיגוטיות. לבסוף, אנו מראים כי הכלי יכול לשמש גם עבור מניפולציות עובריות במינים אחרים כגון medaka דג אורז יפני.

הצלחה וכישלון בשימוש במכשיר ההשתלה עבור שלושת היישומים שתוארו לעיל ניתן להעריך בקלות על ידי בדיקה חזותית תחת סטריאומיקוסקופ. בהשתלות מוצלחות, העובר צריך להיראות נורמלי ודומה בצורתו ובהירות החלמון לעוברים לא מושתלים, ללא קרעים גדולים בפיצוץ. אם העובר ניזוק באופן ניכר (איור 4B), הוא לא יתפתח כרגיל. באופן אידיאלי, תאים מושתלים המבטאים סמן פלואורסצנטי אמורים להופיע כעמודה רציפה כאשר הם נצפים תחת סטריאוטירסקופ פלואורסצנטי (איור 2A, איור 4A). אם העמודה מקוטעת, זה מצביע על כך שהתאים נטענו על ידי היניקה למחט ההשתלה או שהתצהיר של התאים נעשה במרץ רב מדי. ניתן למנוע זאת על ידי הזזת הבוכנה לאט ובעדינות רבה יותר.
למרות שמכשיר ההשתלה שימש בעיקר על עוברים של דגי זברה בשלבי בלטולה 5,6, השתלה וכיבוי תאים פועלים באותה מידה עבור עוברים בשלבי בלטולה של דג האורז היפני מדאקה (Oryzias latipes) (איור 2B). מלבד dechorionation העובר, אשר תואר על ידי פורזינסקי, S. R. et al.17, ניתן לעקוב אחר אותם הליכים כפי שתואר לעיל ניתן לעקוב אחר.
במקרה הספציפי של השתלת נבטים, השתלה טובה תגרום לעובר עם עמוד אופקי ארוך של תאים ישירות מעל שולי החלמון (איור 4A). עם זאת, ניתן להעריך אם תאי נבט הושתלו בהצלחה רק למחרת (איור 4C-F) בשל ביטוי רקע של GFP בשלבי בלטולה (איור 1F). תאי הנבט הקדמוניים יופיעו כספירות פלואורסצנטיות קטנות בחריץ ישירות מעל הרחבת החלמון (איור 4C-E). נוכחותם של תאים אלה במיקום הנכון מצביעה על השתלת נבט מוצלחת. תאים בעלי צורה שונה אינם תאי נבט (למשל, תאים מוארכים הם בדרך כלל תאי שריר, איור 4F). כמו כן, אם תאי נבט קדמוניים נמצאים מחוץ לחריץ, משמעות הדבר היא שהם לא הצליחו לנדוד כראוי, והם לא יוכלו לתרום לנבט של העובר. לבסוף, המורפולוגיה הכללית של עוברים מושתלים צריכה להיראות דומה לעוברים לא מושתלים (איור 4D); אין לעוות את הזנב, ואין לכווץ את הראש או חסר עיניים (איור 4E). פגמים אלה נובעים בדרך כלל ריכוזי מורפולינו גבוהים מדי או מנזק עוברי במהלך ההשתלה. ניסויי השתלת נבטים כמתואר כאן בדרך כלל יגרמו ל-1-2 מתוך 6 עוברים מארחים עם תאי נבט שהושתלו בהצלחה עבור 60%-80% מהעוברים התורמים, בהתאם לניסיון של הנסיין. לכן, תאים מ 40-50 עוברים תורם הומוזיגוס צריך להיות מושתל לתוך 200-300 עוברים מארחים לגדל כ 30 אנשים עם תאי נבט מוטנטי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig01.jpg"> איור 1: הרכבה ושימוש במכשיר ההשתלה. (א) מכשיר ההשתלה מורכב על ידי חיבור מזרק הדוק בגז עם מחזיק מיקרופיפט באמצעות התאמת מנעול לור. מחט הזכוכית להשתלה מוכנסת לאחר מכן למחזיק המיקרופיט. (ב) צילום של מכשיר ההשתלה שהורכב מותקן על מיקרו-מניפולטור (שים לב שהרקע והתוויות הוסרו מהתמונה). (ג) בעת שימוש במכשיר ההשתלה, חשוב לוודא כי מפלס המים במחט ההשתלה נשאר בקצה המחודד. (D) המכשיר משמש תחת סטריאומיקוסקופ כדי לסגת ולהכניס תאים מעוברי טלוסט ואליו המוצבים בבארות בודדות של צלחת השתלה. (ה) עבור הדור של מקורות חוץ רחמיים, תאים נלקחים מקוטב החיה של עובר תורם (i-ii) ומועברים לקוטב החיה של עובר מארח (iii-vi). (ו) להשתלת נבטים, מספר גדול יותר של תאים נלקח משולי העובר התורם (i-ii), שבו נמצאים תאי הנבט. לאחר מכן, התאים מועברים לשולי העוברים המארחים (iii-vi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig02.jpg"> איור 2: יצירת שיבוטים על ידי השתלת תאים. (A) דוגמה לשיבוט כפול שנוצר על ידי השתלה רציפה של תאים פלואורסצנטיים (ירוקים) מתורם דגי זברה לעובר מארח של דגי זברה. ניתן להשתמש בשיבוטים יחידים וכפולים כדי לחקור כיצד מולקולות איתות מופרשות יוצרות שיפועים spatiotemporal2,4,5,6. (ב) דוגמה לשיבוט יחיד שנוצר על ידי השתלת תאים מתורם מדאקה מהונדס (ווימבלדון)17 למארח מדאקה מסוג בר. סרגלי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig02large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig03.jpg"> איור 3: יצירת עוברים מופחתי גודל על ידי סילוק תאים. (A) לפני הסרת תאים על ידי extirpation, YSL יכול להיות מתויג על ידי הזרקת צבעים פלואורסצנטיים לשני צדדים מנוגדים של YSL. (ב) דוגמה לעובר לאחר הזרקת YSL. (C) כדי ליצור עוברים מופחתים בגודל, תאים מקוטב החיות מוסרים על ידי extirpation5. (D) דוגמה לעובר לאחר כיבוי תאים. שים לב כי YSL נשאר שלם. סרגלי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig03large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig04.jpg"> איור 4: השתלת נבטים. (א) דוגמה להשתלה מוצלחת של תאים תורמים (ירוקים) לאזור השולי של הפונדקאי. (ב) דוגמה להשתלה לא מוצלחת. החלמון של העובר המארח נפגע קשות, והעובר לא יוכל להתפתח כרגיל. (C) ב 30 כ"ס, תאי נבט מושתלים בהצלחה יימצאו אך ורק ב mesoderm גונדל באזור העורפי של הרחבת החלמון. (ד) דוגמה להשתלה מוצלחת שבה מספר תאי נבט תורמים המסומנים על ידי GFP אכלסו את תולם העתיד של הפונדקאי. (ה) דוגמה להשתלה לא מוצלחת. למרות שתאי הנבט הגיעו למסודרם הגונאדל, העובר המארח מעוות קשות ולא יתפתח כרגיל. (ו) דוגמה להשתלה לא מוצלחת. תאי נבט פלואורסצנטיים שלא הצליחו לעבור למיקום הנכון לא יאכלסו מחדש את חטיפים. סרגלי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. תמונות ב- D-F צולמו בהגדלה כוללת של כ - 50x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

מניפולציות עובריות כגון סילוק והשתלת תאים הן כלים חשובים לחקר ההתפתחות המוקדמת. פרוטוקול זה מתאר מכשיר השתלה פשוט ויעיל לביצוע מניפולציות אלה בעוברי דגי זברה.

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

הטכניקה מאפשרת לחקור את התפקוד והטווח של מולקולות איתות במהלך העובר על ידי השתלת מקורות איתות חוץ רחמיים. זה גם מקל על הדור היעיל של מוטציות נבטים. הפרוטוקול יכול להיות מיושם על דגי זברה שלב blastula ועוברי מדאקה, וכנראה גם על שלבים עובריים אחרים ומינים TDO.כדי להרכיב את מכשיר ההשתלה, חבר קצה פיתיון 25 מזרק הדוק גז מיקרוליטר למחזיק פיפטה מיקרו באמצעות התאמת מנעול הפיתוי. לאחר מכן התקן את ההתקן ישירות על מיקרו מניפולטור ידני. כדי להשתמש במכשיר ההשתלה, מקם את מניפולטור המיקרו עם ההתקן המורכב ליד מיקרוסקופ סטריאו.ואז להסיר את הבוכנה ולהכניס את מחט ההשתלה. מנמיכים את המחט לצלחת מלאה בתמיסה של רינגר בזווית של 45 מעלות עד שקצה המחט שקוע. הכנס את הבוכנה בערך באמצע הדרך כדי לשטוף את הפתרונות של הצלצול, משאיר רק נפח קטן של מים בחלק הדק המחודד של המחט.בעת שימוש במחט השתלה בפעם הראשונה, מצפים את החלק הפנימי של המחט על ידי ציור עול מעובר שהוקרב וסילוק חומר העול לחלוטין. לאחר מכן, באמצעות מחט השתלה, למקם בעדינות את העובר התורם, ולאחר מכן למקם את המחט פתיחת אורתוגונל על פני השטח העובר בזהירות למשוך את הבוכנה כדי למשוך את התאים לתוך המחט. לאחר מספר התאים הרצוי נמשך, להפסיק את היניקה על ידי דוחף בעדינות את הבוכנה למטה ולהסיר את המחט מן העובר על ידי jerking המחט לצד בתנועה קצרה ומהירה.השאר פתרון כלשהו של רינגר משני צדי עמודת התא על-ידי הגבלת התאים לקצה המחודד של המחט. נקה את כל החלמון או פסולת התא הנותרים על ידי הזזה איטית של הבוכנה למעלה ולמטה ושטיפת התאים עם הפתרון של רינגר. לאחר מכן, להזיז את צלחת ההשתלה עם היד הלא דומיננטית כדי למקם את המחט אורתוגונל על פני השטח של העובר המארח.החל לחץ קל על העובר על ידי סחיטה בזהירות על הקירות. לאחר מכן בתנועה חדה ומהירה, לנקב את השכבה העוטפת של העובר המארח דואג לא לגרד את החלמון עם המחט. ברגע שהמחט בפנים, דחפו בעדינות את הבוכנה כדי להגליד את עמוד התאים לתוך העובר, ולאט לאט לסגת מהמחט בו זמנית.להשתלה של תאי נבט, מלאו צלחת השתלה בתמיסה של רינגר, ואז העבירו את הכדור המופחת לעוברי שלב הכיפה לצלחת ההשתלה והמקמו את העובר המארח והתורם בעמודים מתחלפים להשתלת התאים מעובר תורם אחד לשישה עוברים מארחים שונים. כדי לבצע את ההשתלה, לכוון את העוברים עם השוליים לכיוון מחט ההשתלה. להשתלת נבטים, יש לקחת את תאי המקור מהשוליים ולהפקיד אותם באותו מיקום בעובר המארח.לאחר השלמת ההשתלה, אפשר לעובר להתאושש בתמיסה של רינגר למשך 30 דקות עד שעה. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי, בדוק את התאים המושתלים. לאחר מכן, להעביר את העוברים לתוך צלחת מצופה אגרוז 24 היטב עם עובר בינוני קיבוץ כל העוברים המארחים שקיבלו תאים מאותו תורם לאותה באר.ואז לדגור על העוברים ב 28 מעלות צלזיוס עד למחרת. במידת הצורך, העבר את העוברים התורמים לרצועות PCR מסומנות עבור genotyping. 30 שעות לאחר ההפריה, לסנן את העוברים המארחים להשתלות נבט מוצלחות תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי.תאי הנבט צריכים להיות נוכחים בחריץ מעל הרחבת החלמון. לגדל את הזחל המושתל בהצלחה למכסה המנוע למבוגרים על פי תנאי גידול סטנדרטיים. בהשתלות מוצלחות, העובר נראה נורמלי ודומה בצורתו ובהירות החלמון לעוברים לא מושתלים ללא קרעים גדולים בפיצוץ.לעומת זאת, אם העובר ניזוק באופן ניכר במהלך ההשתלה, הוא לא יתפתח כרגיל. למרות מכשיר ההשתלה שימש בעיקר על עוברים דג זברה בשלבי blastula, ההשתלה וחיסול התא יכול להתבצע גם בעוברי שלב blastula dechorionated של medaka דג אורז יפני. במקרה הספציפי של השתלת נבטים, השתלה טובה גורמת לעובר עם עמודה אופקית ארוכה של תאים ישירות מעל שולי החלמון.עם זאת, הצלחה של ההליך ניתן להעריך רק לאחר 24 עד 30 שעות של הפריה כאשר תאי הנבט נבדלים פלואורסצנטיות שלהם מתאים סומטיים. תאי הנבט הקדמונים יופיעו כספירות פלואורסצנטיות קטנות בחריץ ישירות מעל הרחבת החלמון. נוכחותם של תאי נבט אלה במיקום הנכון מצביעה על השתלת נבט מוצלחת.דוגמאות להשתלות לא מוצלחות מוצגות כאן. בדוגמה הראשונה, למרות שתאי הנבט הגיעו למסודרם הגונאדל, שכן העובר המארח מעוות קשות, הוא לא יתפתח כרגיל. בדוגמה השנייה, תאים פלואורסצנטיים מזוהים רק מחוץ לחריץ.תאים אלה הם תאים סומטיים או תאי נבט שלא עברו כראוי. ושני סוגי התאים לא יתרמו לקו החיידק של העובר. זה קריטי כדי למנוע נזק לתאים המושתלים ואת העובר המארח.תאים צריכים להיערך לאט, להיות נקיים של כל חלמון שנותר, ולהיות מוכנס בזהירות. שיטה זו מספקת דרך קלה להשתיל תאים בעוברי דגי זברה, והיא תהיה שימושית ליצירת מקורות חוץ רחמיים ומוטנטים נבטים. היתרון העיקרי של מכשיר זה, הוא עלות נמוכה, והוא הרבה ושימושים.

a-simple-and-effective-transplantation-device-for-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מדריך צעד אחר צעד כדי ליצור ממוקד עוברי דג הזברה chimeric על ידי השתלת בשלב blastula או gastrula.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

דג הזברה השתלת מאפשר שילוב של גנטיקה אמבריולוגיה ליצור מפלצות רקמות ספציפיות. וידאו זה מדגים gastrula מבוים השתלות תא אפשרו במעבדה שלנו כדי לחקור את התפקידים של אוכלוסיות astroglial ו רמזים הנחיות ספציפיות במהלך היווצרות השליכה בקידמתו.

ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

אנו להדגים פרוטוקול ליצור עוברי דג הזברה chimeric להתנהגות הדמיה לחיות הסלולר במהלך embryogenesis.

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

דג הזברה הוא מערכת מודל מצוינת למחקרים גנטיים והתפתחותיים. השתלת חרוזים היא טכניקה חשובה למניפולציה של רקמות שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנוני התפתחות על ידי הכנסת שינויים בסביבות תאיות מקומיות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע השתלת מיקרו-חרוזים בעובר דג הזברה.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

כאן, אנו מראים את התהליך של יצירת קו דג זברה כתב מתח חשמלי הסלולר להמחיש את התפתחות, תנועה, דגים גידול תאים ויוו.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

כאן, אנו מציגים לפרוטוקול תכנון, הרכיבו את העובר דג זברה סידור במערך תבנית, ולאחריו נוהל מפורט על השימוש של תבנית כזו עבור תפוקה גבוהה דג זברה סידור במערך העובר לתוך צלחת 96-ובכן.

תלת-ממדי (3D)-להדפיס תבנית עבור תפוקה גבוהה דג זברה העובר סידור במערך

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

אנו מתארים פרוטוקול להשתלת קסנו בחלמון של עוברי דגי זברה שקופים המותאם בשיטת היערכות פשוטה ומהירה. ניתוחים לאחר הזרקה כוללים הישרדות והערכת נטל המחלה של תאים מושתלים על ידי ציטומטריית זרימה.

שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברים ובזחלים של דגי זברה בכל שלב בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה.

השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

למדו שיטת השתלה פשוטה ויעילה לעוברי דגי זברה לחקר מולקולות איתות והפקת מוטנטים של קו גרמלי. הפרוטוקול משתמש במכשיר בעלות נמוכה ומתאים גם לדגי מדקה.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

גלה סרטונים נוספים