מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

הטכניקה מאפשרת לחקור את התפקוד והטווח של מולקולות איתות במהלך העובר על ידי השתלת מקורות איתות חוץ רחמיים. זה גם מקל על הדור היעיל של מוטציות נבטים. הפרוטוקול יכול להיות מיושם על דגי זברה שלב blastula ועוברי מדאקה, וכנראה גם על שלבים עובריים אחרים ומינים TDO.

כדי להרכיב את מכשיר ההשתלה, חבר קצה פיתיון 25 מזרק הדוק גז מיקרוליטר למחזיק פיפטה מיקרו באמצעות התאמת מנעול הפיתוי. לאחר מכן התקן את ההתקן ישירות על מיקרו מניפולטור ידני. כדי להשתמש במכשיר ההשתלה, מקם את מניפולטור המיקרו עם ההתקן המורכב ליד מיקרוסקופ סטריאו.

ואז להסיר את הבוכנה ולהכניס את מחט ההשתלה. מנמיכים את המחט לצלחת מלאה בתמיסה של רינגר בזווית של 45 מעלות עד שקצה המחט שקוע. הכנס את הבוכנה בערך באמצע הדרך כדי לשטוף את הפתרונות של הצלצול, משאיר רק נפח קטן של מים בחלק הדק המחודד של המחט.

בעת שימוש במחט השתלה בפעם הראשונה, מצפים את החלק הפנימי של המחט על ידי ציור עול מעובר שהוקרב וסילוק חומר העול לחלוטין. לאחר מכן, באמצעות מחט השתלה, למקם בעדינות את העובר התורם, ולאחר מכן למקם את המחט פתיחת אורתוגונל על פני השטח העובר בזהירות למשוך את הבוכנה כדי למשוך את התאים לתוך המחט. לאחר מספר התאים הרצוי נמשך, להפסיק את היניקה על ידי דוחף בעדינות את הבוכנה למטה ולהסיר את המחט מן העובר על ידי jerking המחט לצד בתנועה קצרה ומהירה.

השאר פתרון כלשהו של רינגר משני צדי עמודת התא על-ידי הגבלת התאים לקצה המחודד של המחט. נקה את כל החלמון או פסולת התא הנותרים על ידי הזזה איטית של הבוכנה למעלה ולמטה ושטיפת התאים עם הפתרון של רינגר. לאחר מכן, להזיז את צלחת ההשתלה עם היד הלא דומיננטית כדי למקם את המחט אורתוגונל על פני השטח של העובר המארח.

החל לחץ קל על העובר על ידי סחיטה בזהירות על הקירות. לאחר מכן בתנועה חדה ומהירה, לנקב את השכבה העוטפת של העובר המארח דואג לא לגרד את החלמון עם המחט. ברגע שהמחט בפנים, דחפו בעדינות את הבוכנה כדי להגליד את עמוד התאים לתוך העובר, ולאט לאט לסגת מהמחט בו זמנית.

להשתלה של תאי נבט, מלאו צלחת השתלה בתמיסה של רינגר, ואז העבירו את הכדור המופחת לעוברי שלב הכיפה לצלחת ההשתלה והמקמו את העובר המארח והתורם בעמודים מתחלפים להשתלת התאים מעובר תורם אחד לשישה עוברים מארחים שונים. כדי לבצע את ההשתלה, לכוון את העוברים עם השוליים לכיוון מחט ההשתלה. להשתלת נבטים, יש לקחת את תאי המקור מהשוליים ולהפקיד אותם באותו מיקום בעובר המארח.

לאחר השלמת ההשתלה, אפשר לעובר להתאושש בתמיסה של רינגר למשך 30 דקות עד שעה. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי, בדוק את התאים המושתלים. לאחר מכן, להעביר את העוברים לתוך צלחת מצופה אגרוז 24 היטב עם עובר בינוני קיבוץ כל העוברים המארחים שקיבלו תאים מאותו תורם לאותה באר.

ואז לדגור על העוברים ב 28 מעלות צלזיוס עד למחרת. במידת הצורך, העבר את העוברים התורמים לרצועות PCR מסומנות עבור genotyping. 30 שעות לאחר ההפריה, לסנן את העוברים המארחים להשתלות נבט מוצלחות תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי.

תאי הנבט צריכים להיות נוכחים בחריץ מעל הרחבת החלמון. לגדל את הזחל המושתל בהצלחה למכסה המנוע למבוגרים על פי תנאי גידול סטנדרטיים. בהשתלות מוצלחות, העובר נראה נורמלי ודומה בצורתו ובהירות החלמון לעוברים לא מושתלים ללא קרעים גדולים בפיצוץ.

לעומת זאת, אם העובר ניזוק באופן ניכר במהלך ההשתלה, הוא לא יתפתח כרגיל. למרות מכשיר ההשתלה שימש בעיקר על עוברים דג זברה בשלבי blastula, ההשתלה וחיסול התא יכול להתבצע גם בעוברי שלב blastula dechorionated של medaka דג אורז יפני. במקרה הספציפי של השתלת נבטים, השתלה טובה גורמת לעובר עם עמודה אופקית ארוכה של תאים ישירות מעל שולי החלמון.

עם זאת, הצלחה של ההליך ניתן להעריך רק לאחר 24 עד 30 שעות של הפריה כאשר תאי הנבט נבדלים פלואורסצנטיות שלהם מתאים סומטיים. תאי הנבט הקדמונים יופיעו כספירות פלואורסצנטיות קטנות בחריץ ישירות מעל הרחבת החלמון. נוכחותם של תאי נבט אלה במיקום הנכון מצביעה על השתלת נבט מוצלחת.

דוגמאות להשתלות לא מוצלחות מוצגות כאן. בדוגמה הראשונה, למרות שתאי הנבט הגיעו למסודרם הגונאדל, שכן העובר המארח מעוות קשות, הוא לא יתפתח כרגיל. בדוגמה השנייה, תאים פלואורסצנטיים מזוהים רק מחוץ לחריץ.

תאים אלה הם תאים סומטיים או תאי נבט שלא עברו כראוי. ושני סוגי התאים לא יתרמו לקו החיידק של העובר. זה קריטי כדי למנוע נזק לתאים המושתלים ואת העובר המארח.

תאים צריכים להיערך לאט, להיות נקיים של כל חלמון שנותר, ולהיות מוכנס בזהירות. שיטה זו מספקת דרך קלה להשתיל תאים בעוברי דגי זברה, והיא תהיה שימושית ליצירת מקורות חוץ רחמיים ומוטנטים נבטים. היתרון העיקרי של מכשיר זה, הוא עלות נמוכה, והוא הרבה ושימושים.