Name: שינוי כימי של שאריות טריפטופן ב- Ca רקומביננטיCa 2 +-ATPase N-דומיין לחקר טריפטופן-ANS FRET (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: חקור שינוי כימי של שאריות טריפטופן בדומיין N של Ca2+-ATPase רקומביננטי לחקר קשר ANS ו-FRET. שיטת ספקטרוסקופיית פלואורסצנטה זו מאפשרת לזהות העברת אנרגיה בין טריפטופן ל-ANS בחלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה חלקית על ידי FAI-UASLP grant number C19-FAI-05-89.89 and CONACYT grant number 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). המחברים מודים לסיוע הטכני של ג'וליאן א. מאטה-מוראלס במהדורת וידאו.

1. נחישות (בסיליקו) של אינטראקציית ה- ANS ו- SERCA N-domain
<ol><li>צור מבנה תלת מימדי (3D) של החלבון (SERCA N-domain) על ידי מידול מולקולרי באמצעות תוכנת מידול החלבון המועדפת50.</li>
	<li>זהה את שאריות חומצת האמינו היוצרות את אתר כריכת הנוקלאוטיד באמצעות תוכנת המבנה המולקולרי המועדפת51, ולקבוע את נוכחותם של שאריות ארג וליס35; אלה נדרשים עבור איגוד ANS ולהגדיל את עוצמת הפלואורסצנטיות (תשואה קוונטית).</li>
	<li>בצע עגינה מולקולרית (באמצעות תוכנת העגינה המועדפת)52,53,54 כדי לקבוע את האינטראקציות של ATP, פלואורסצין איזוטיוצינט (FITC) (אשר יוצר קשר קוולנטי עם Lys515 תיוג האתר כריכת נוקלאוטיד), ו ANS עם שאריות חומצות אמינו באתר כריכת נוקלאוטידים ( איור1).</li>
	<li>חשב את המרחק המולקולרי (Å) בין שאריות Trp ו- ANS קשור באמצעות כלי המדידה בתוכנה המועדפת.</li>
	<li>בצע סימולציה דינמית מולקולרית של קומפלקס ANS-N-תחום כדי לקבוע את היציבות של האינטראקציה52,54. לאחר מכן, לבצע את הניסויים במבחנה כאשר היציבות של המתחם אושרה.</li>
</ol>2. ביטוי וטיהור של N-תחום רקומביננטי
<ol><li>לסנתז את קידוד הגן עבור N-תחום40.</li>
	<li>לעצב ולבנות את plasmid המכיל את הגן הסינתטי כי קודים עבור N-תחום40.</li>
	<li>לבטא ולטהר על ידי כרומטוגרפיה זיקה (Ni-NTA), N-תחום רקומביננטי מהונדס. בצע SDS-PAGE של החלבון המטוהר כדי לקבוע את הטוהר (איור 2)40.</li>
	<li>לקבוע את ריכוז החלבון על ידי לימוד הספיגה ב λ של 280 ננומטר עם מקדם ההכחדה N-תחום (ε = 11,960 M-1·ס"מ-1)40.</li>
</ol>3. נטר את היווצרותו של קומפלקס התחום ANS-N המבוסס על שינויי עוצמת הפלורסצנטיות של ANS ו- N-domain.
<ol><li>הכן פתרון מלאי ANS ב N,N-דימתילפורמיד.<ol>
<li>שקול כמות קטנה (1-5 מ"ג) של ANS, ולהמיס אותו ב 1 מ"ל של הנפח הסופי של N,N-דימתילפורמיד, למשל, 3.2 מ"ג (10.69 mM ריכוז סופי).</li>
		<li>הכן פתרון מלאי מימי 100μM ANS באמצעות פתרון ANS ב N,N-דימתילפורמיד, למשל, להוסיף 9.4 μL של פתרון ANS 10.69 mM ל 990.6 μL של 50 mM חוצץ פוספט עם pH 8.0 כדי להשיג נפח סופי של 1 מ"ל.</li>
		<li>מערבבים את הפתרונות על ידי מערבולת 3 - 5 פעמים עבור 15 s. הערה: בניסוי הבא, השתמש רק בפתרון המניה המ מימי ANS. הכן טרי את פתרון המניה הממית ANS לפני תחילת הניסויים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן את פתרון המניות של NBS ב- N,N-דימתילפורמיד.<ol>
<li>שקול כמות קטנה (1-5 מ"ג) של NBS, ולהמיס אותו 1 מ"ל של N,N-דימתילפורמיד, למשל, 5.3 מ"ג ב 1 מ"ל (29.78 mM ריכוז סופי).</li>
		<li>הכן פתרון מלאי מימי 1 mM NBS באמצעות פתרון NBS ב N,N-דימתילפורמיד, למשל, להוסיף 3.36 μL של פתרון NBS 29.78 mM ל 96.64 μL של 50 mM חוצץ פוספט עם pH 8.0 כדי להשיג נפח סופי 0.1 מ"ל.</li>
		<li>מערבבים את הפתרונות על ידי מערבולת 3 - 5 פעמים עבור 15 s. הערה: הכן טרי את פתרון המלאי המומי של NBS לפני תחילת הניסויים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לתמצת את N-הדומיין עם ANS, ולתעד את ספקטרום פלואורסצנטיות על ידי עירור ב λ = 295 ננומטר ב 25 °C (70 °F).<ol>
<li>להשיג את בסיס ספקטרום הפלואורסצנטיות.<ol>
<li>מקם 1 מ"ל של 50 mM חוצץ פוספט עם pH 8.0 ב 1 מ"ל פלואורסצנטי קוורץ cuvette.</li>
			<li>מקם את התא בתא התא המוצהר התרמו -state (25 °C) של ספקטרופלואורומטר והגדר את העירור λ ל 295 ננומטר.</li>
			<li>להקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות (305 - 550 ננומטר). הערה: ספקטרום הפלואורסצנטיות של חיץ הפוספט של 50 מ"מ עם pH 8.0, המשמש כדגימה ריקה, מופחת מכל ספקטרום הפלואורסצנטי שהושג.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להשיג את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותי של N-תחום.<ol>
<li>מניחים 900 μL של 50 mM חוצץ פוספט עם pH 8.0 ב cuvette קוורץ פלואורסצנטי.</li>
			<li>הוסף 100 μL של השעיית N-domain (10 μM) כדי לקבל ריכוז סופי N-domain 1 בנפח סופי של 1 מ"ל.</li>
			<li>הומוגניזציה בעדינות באמצעות מיקרופיפט 20 פעמים כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון. הערה: החלבון צריך להיות מטוהר טרי כדי לקבל ספקטרום פלואורסצנטיות מהותית באיכות גבוהה, למשל, N-domain רקומביננטי מטוהר ניתן להשתמש רק במשך שבוע לאחר הטיהור.</li>
			<li>מקם את התא בתא התא המוצהר התרמו -state (25 °C) של ספקטרופלואורומטר והגדר את העירור λ ל 295 ננומטר.</li>
			<li>הקלט את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותית של N-domain (305-550 ננומטר).</li>
		</ol>
</li>
		<li>הוסף ANS, ולקבל את ספקטרום הפלואורסצנטיות על ידי עירור ב λ = 295 ננומטר.<ol>
<li>הוסף 2 μL aliquot של 100 μM ANS פתרון מלאי מימית N-domain מושעה (1 μM) כדי לקבל ריכוז סופי ANS 0.2 μM.</li>
			<li>הומוגניזציה בעדינות באמצעות מיקרופיפט 20 פעמים כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון.</li>
			<li>מקם את התא בתא התא התרמו-יציב (25 °C) של ספקטרופלואורומטר והגדר את העירור λ ל 295 ננומטר.</li>
			<li>להקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות (305-550 ננומטר).</li>
			<li>חזור על תוספות ANS וספקטרום פלואורסצנטיות הקלטה מעל 1:1 קשר טוחן ANS:N-domain.</li>
			<li>הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה מתאימה.</li>
			<li>התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד.</li>
			<li>קבעו אם הספקטרום יוצר תבנית דמוית FRET. ספקטרום הפלואורסצנטיות של ANS-N-domain יוצר תבנית דמוית FRET(איור 3A).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Titration פלואורסצנטיות מהותית של N-domain על ידי שינוי כימי Trp עם NBS.
<ol><li>חזור על שלבים 3.3.1 ו- 3.3.2.</li>
	<li>הוסף 1 μL aliquot של 1 mM NBS פתרון מלאי מימי ל- N-domain מושעה (1 μM) כדי להשיג ריכוז סופי של 1 μM NBS.</li>
	<li>הומוגני בעדינות באמצעות מיקרופיפט 20 פעמים כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון.</li>
	<li>מקם את התא בתא התא התרמו-יציב (25 °C) של ספקטרופלואורומטר והגדר את העירור λ ל 295 ננומטר.</li>
	<li>תעד את ספקטרום הפלואורסצנטיות (305-550 ננומטר)(איור 3B).</li>
	<li>חזור על הקלטת ספקטרום התוספת והפלואורסצנטיות של NBS עד שנצפו40מרווה פלואורסצנטיות מהותית מינימלית של N-domain . ב- N-domain, פעולה זו מתרחשת בדרך כלל ביחס טחון של 5-6 NBS / N-domain40. הערה: NBS מרווה במהירות (<5 s) את הפלואורסצנטיות המהותית של ה- N-domain; נצפתה ירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות. המשך מיד לשלב הבא, כמו NBS עשוי גם להגיב עם שאריות חומצת אמינו אחרות47.</li>
	<li>הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה מתאימה.</li>
	<li>התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד (איור 3B).</li>
</ol>5. טיטרט N-דומיין שונה NBS עם ANS על ידי הקלטת ספקטרום פלואורסצנטי ב 25 °C (70 °F).
<ol><li>בצע את שלב 3.3.3 באמצעות N-domain שהשתנה על-ידי NBS שנוצר בשלב 4.</li>
	<li>הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה מתאימה.</li>
	<li>התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד (איור 3C).</li>
	<li>ספקטרום הפלואורסצנטיות שנוצר (איור 3C) תומך או מפריך את המופע של FRET, כלומר, כאשר FRET מתרחש, פלואורסצנטיות ANS אינה גדלה ולהיפך.</li>
</ol>6. ראיות של ANS מחייב לתחום N שונה כימית על ידי עירור ב λ = 370 ננומטר.
<ol><li>בצע את שלב 3.3.3 באמצעות N-domain שהשתנה על-ידי NBS שנוצר בשלב 4 אך שינה את העירור ל- 370 ננומטר.</li>
	<li>הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה מתאימה.</li>
	<li>התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד (איור 3D).</li>
	<li>אשר איגוד ANS לתחום N על-ידי התבוננות בעלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות של ANS. איגוד ANS לתחום N מראה עלייה פלואורסצנטית כאשר נרגשים ב- λ = 370 ננומטר (איור 3D). כפקד, ספקטרום הפלואורסצנטיות של ANS (לבד) במאגר פוספט של 50 מ"מ עם pH 8.0 הושג מרגש ב λ של 295 ו 370 ננומטר(איור 4,לא מוצג בסרטון). הערה: היחסים הסטויצ'יומטריים של NBS:Trp הנדרש לשינוי כימי תלוי במידת הקבורה של שאריות Trp בחלבון על פי מחקר46,47,55,56. לכן, מומלץ לקבוע את יחס הטוחנת NBS:חלבון/(Trp), מראש.</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

ספקטרום פלואורסצנטיות של קומפלקס ה- ANS-N-domain מציג תבנית דמוית FRET כאשר נרגשים במהירות של 295 ננומטר, בעוד שהמרחק המולקולרי (20 Å) בין שאריות הטרפ ל- ANS נראה תומך בהתרחשות של FRET (איור 1). שינוי כימי Trp על ידי NBS תוצאות פחות פלואורסצנטי N-תחום (איור 3B, ספקטרום f); לפיכך, העברת אנרגיה אינה אפשרית. ספקטרום הפלואורסצנטיות של ANS דומה לזה של N-דומיין לא משתנה כאשר נרגשים ב- λ של 295 ננומטר(איור 3A ו- C).
<p...

העברת אנרגיית התהודה של Föster (FRET) הפכה לטכניקה סטנדרטית לקביעת המרחק בין מבנים מולקולריים לאחר כריכה או אינטראקציה במבנה החלבון ובמחקריפונקציות 1,2,3,4. ב- ATPases מסוג P, FRET שימש כדי לחקור את המבנה והתפקוד של רטיקולום סרקו-אנדופלסמי Ca2 +- ATPase (SERCA)2,5,6,7,8, למשל, תנודות מבניות במהלך המחזור הקטליטי נותחו בחלבון כולו על ידי FRET7.
תורמי FRET הם מגוונים, והם נעים בין מולקולות פלואורסצנטיות קטנות (קיצוניות) לחלבונים פלואורסצנטיים9,10. שאריות טריפטופן (Trp) (בשל הפלואורסצנטיות שלהם) שימושיות לזיהוי שינויים מבניים ברצפי חומצות אמינו חלבוניות11,12. עוצמת הפלואורסצנטיות של Trp תלויה באופן משמעותי בקוטביות שלסביבתו 13,14. כריכת ליגנד מייצרת בדרך כלל סידורים מבניים בחלבונים/אנזימים15,16. אם Trp קיים או ממוקם קרוב לאתר כריכת החלבון, תנודות מבניות משפיעות לעתים קרובות על מידת החשיפה ל- Trp למדיה מימית13,14; לכן, השינוי בקוטביות גורם להרוות את עוצמת הפלואורסצנטיות של Trp13,14. לפיכך, המאפיין הפלואורסצנטי של Trp שימושי לביצוע מחקרי כריכת ליגנד עבור אנזימים. תופעות פיזיות אחרות עלולות גם להוביל לפלואורסצנטיות של Trp המשתוות17,18,19,20, למשל, FRET ושינויים בקוטביות בינונית. העברת אנרגיה מהמצב הנרגש של Trp לפלורופור יש גם יישומים פוטנציאליים, למשל, קביעת זיקה של ליגנדים קטנים בחלבונים21. ואכן, Trp שימש בעיקר כתורם פלואורסצנטי במחקרי FRET בחלבונים22,23,24, למשל, במחקרי טרביום (Tb3+) FRET, שאריות Trp משמש לעתים קרובות כאנטנה להעברת אנרגיה ל- Tb3 +25,26,27. Trp מציג יתרונות שונים על פני תורמי FRET אחרים בשל אופיו המכונן המובנה במבנה החלבון, אשר מבטל את הצורך בתהליכי הכנה שעשויים להשפיע על התפקוד / המבנה של החלבון הנחקר24. לכן, זיהוי של ריקבון קרינה (העברת אנרגיה ושינויים בקוטביות הבינונית הנגרמים על ידי סידורים מבניים של חלבון) חשוב להסיק מסקנות מדויקות לגבי כריכת ליגנד במחקרים מבניים חלבונים13,14,19,28.
במחקרים מבניים חלבון, פלואורופור חיצוני, כלומר, 8-אנילינו-1-נפטלין סולפונט (ANS), שימש בעיקר בניסויים הקשורים קיפול חלבון / התגלגלות28,29. ANS נקשר חלבונים / אנזימים במדינת האם, בדרך כלל באתרים מחייבים שלמצעים 31,32,33; עלייה בתפוקה קוונטית פלואורסצנטית ANS (ΦF) (כלומר, עלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות) מושרה על ידי מרגש את החלבון ב λ = 370 ננומטר כאשר אינטראקציות מתאימות של ANS עם ארג ושאריות שלו בכיסים הידרופוביים להתרחש34,35,36,37. במחקרים שונים, דווח על התרחשותו של FRET (כאשר מרגש ב λ בתוך 280-295 ננומטר) בין שאריות Trp (תורמים) ו- ANS (מקבל), אשר מבוסס על הדברים הבאים: 1) חפיפה של ספקטרום פליטת פלואורסצנטיות של Trp ו ספקטרום עירור של ANS, 2) זיהוי של מרחק מתאים בין שאריות Trp אחד או יותר (ים) ו- ANS להעברת אנרגיה, 3) תשואה קוונטית ANS גבוהה כאשר כבול בכיסי חלבון, ו 4) דפוס FRET אופייני בספקטרום הפלואורסצנטיות של החלבון בנוכחות ANS3,17,27,37,38.
לאחרונה, איגוד ליגנד לתחום איגוד הנוקלאוטידים (N-domain) ב- SERCA ו- ATPases אחרים מסוג P נחקרו באמצעות N-domains רקומביננטי מהונדס40,41,42,43,44,45,46. הנדסה מולקולרית של SERCA N-domain שימשה להעברת שאריות Trp הבלעדיות (Trp552Leu) למבנה דינמי יותר (Tyr587Trp) הקרוב לאתר כריכת הנוקלאוטידים, שבו ניתן להשתמש בווריאציות פלואורסצנטיות (מרווה) לניטור שינויים מבניים על כריכת ליגנד34. תוצאות הניסוי הוכיחו כי ANS נקשר (כ- ATP) לאתר כריכת הנוקלאוטידים ב- SERCA N-domainהמטוהר 34. מעניין, פלואורסצנטיות ANS גדל על כריכה לתחום N על עירור ב λ של 295 ננומטר, בעוד הפלואורסצנטיות המהותית של N-דומיין פוחתת34, ובכך לייצר דפוס FRET המציע היווצרות של זוג Trp-ANS FRET.
השימוש ב- NBS הוצע כדי לקבוע את התוכן של שאריות Trp בחלבונים47 על ידי בדיקת ספיגה של חלבונים מותאמים. NBS משנה את קבוצת האינדולה הסופגת ביותר של Trp לאוקסינדול פחות סופג47,48. התוצאה היא אובדן (מרווה) של מאפיין פלואורסצנטי Trp40. לפיכך, שינוי כימי בתיווך NBS של שאריות Trp עשוי לשמש בדיקה כדי להגדיר את התפקיד של Trp (כתורם) כאשר FRET הוא שיער.
פרוטוקול זה מתאר את השינוי הכימי של שאריות Trp הבלעדיות על ידי NBS בתחום N רקומביננטי מהונדס של SERCA כמודל חלבון. תוצאות הניסוי מראות כי עוצמת הפלואורסצנטיות של ANS עדיין עולה ב- N-domain34שעבר שינוי כימי NBS , חסר פלואורסצנטיות מהותית. לכן, הניסיון שימושי להדגמת היעדר FRET בין שאריות Trp ו- ANS כאשר הוא קשור ל- N-domain34,40,49. לפיכך, בדיקה זו (שינוי כימי NBS של Trp) שימושית בהוכחת נוכחותם של זוג Trp-ANS FRET בחלבונים.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610107</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1028</td><td>Fluorophore</td></tr><tr><td>Bis-acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610125</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>N-Bromosuccinimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B81255</td><td>כימי שינוי</td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide</td><td>J.T. Baker</td><td>9213-12</td><td>הכנת תמיסת מלאי</td></tr><tr><td>פלואורסצאין איזותיוציאנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>תווית פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>קובטה פלואורסצנטית</td><td>Hellma</td><td>Z801291</td><td>בדיקת פלואורסצנציה</td></tr><tr><td>ספקטרופלואורומטר</td><td>Shimadzu</td><td>RF 5301PC</td><td>בדיקת</td></tr> <tr>פלואורסצנציה<td>HisTrap&Trade; FF</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0004-59</td><td>טיהור חלבון</td></tr><tr><td>IPTG, ללא דיאוקסאן</td><td>אמריקאי ביונאליטי</td><td>AB00841-00010</td><td>ביטוי חלבון</td></tr><tr><td>אימידזול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I5513-25G</td><td>טיהור חלבון</td></tr><tr><td>LB מדיה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10000713</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>פיפטמן L P10L</td><td>גילסון</td><td></td><td>FA10002M פלואורסצנציה בדיקת</td></tr><tr><td>פיפטמן L P100L</td><td>גילסון</td><td>FA10004M</td><td>בדיקת פלואורסצנטיות</td></tr><tr><td>פיפטמן L P200L</td><td>גילסון</td><td>FA10005M</td><td>בדיקת פלואורסצנטיות</td></tr><tr><td>פיפטמן L P1000L</td><td>גילסון</td><td>FA10006M</td><td>בדיקת פלואורסצנטיות</td></tr><tr><td>פיפטמן L P5000L</td><td>גילסון</td><td>FA10007</td><td>בדיקת פלואורסצנטיות</td></tr><tr><td>דיוק פלוס std</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>J.T. Baker</td><td>3828-19</td><td>הכנת חיץ</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>J.T. Baker</td><td>3818-01</td><td>הכנת חיץ</td></tr><tr><td>מסנן מזרק 0.2 um</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td>סינון תמיסה</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>דף SDS</td></tr><tr><td>טריס</td><td>ביו-ראד</td><td>1610719</td><td>SDS-PAGE</td></tr></tbody></table>

שינוי כימי של שאריות טריפטופן ב- ca רקומביננטיca 2 +-atpase n-דומיין לחקר טריפטופן-ans fret

Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET

הסרקו/אנדופלסמי רטיקולום Ca2+-ATPase (SERCA) הוא ATPase מסוג P שהתגבש בקונפורמציות שונות. מידע פונקציונלי מפורט ניתן בכל זאת לקבל מתחומים רקומביננטיים מבודדים. הדומיין המהונדס (Trp552Leu ו- Tyr587Trp) רקומביננטי נוקלאוטיד מחייב תחום (N-domain) מציג פלואורסצנטיות מרווה על כריכת ליגנד. פלואורופור חיצוני, כלומר, 8-אנילינו-1-נפטלין סולפונט (ANS), נקשר לאתר כריכת הנוקלאוטידים באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות והידרופוביות עם שאריות ארג, שלו, עלא, לאו ו-Phe. כריכת ANS מעידה על העלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות כאשר נרגשים באורך גל (λ) של 370 ננומטר. עם זאת, כאשר נרגשים ב λ של 295 ננומטר, העלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות נראה מצמיד את מרווה של פלואורסצנטיות מהותית N-תחום. ספקטרום פלואורסצנטי מציג תבנית דמוית העברת אנרגיית תהודה של Föster (FRET), ובכך מרמז על נוכחות של זוג Trp-ANS FRET, שנראה נתמך על ידי המרחק הקצר (~ 20 Å) בין Tyr587Trp ו- ANS. מחקר זה מתאר ניתוח של זוג Trp-ANS FRET על ידי שינוי כימי Trp (ומרווה פלואורסצנטיות) המתווך על ידי N-bromosuccinimide (NBS). בתחום N שונה כימית, פלואורסצנטיות ANS גדל כאשר נרגש ב λ של 295 ננומטר, בדומה כאשר נרגש ב λ של 370 ננומטר. לפיכך, שינוי כימי בתיווך NBS של שאריות Trp יכול לשמש כדי לחקור את היעדר FRET בין Trp ו ANS. בהיעדר פלואורסצנטיות Trp, אין לראות עלייה בפלואורסצנטיות ANS. השינוי הכימי של שאריות Trp בחלבונים על ידי NBS עשוי להיות שימושי לבדיקת FRET בין שאריות Trp שקרובות ל- ANS הכבול. סביר להניח כי ניתן יהיה להשתמש ב- Assay זה גם בעת שימוש בפלואורופורים אחרים.

עגינה מולקולרית מציגה את הכריכה של ANS לאתר כריכת הנוקלאוטידים של ה- N-domain באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות והידרופוביות (איור 1). המרחק המולקולרי (20 Å) בין שאריות Trp ל- ANS (מאוגד לאתר כריכת הנוקלאוטיד) תומך במופע של FRET (איור 1). תחום ה-N המתוכננת (המהונדסת) התקבל בטוהר גבוה על ידי כרומטוגרפיה שלזיקה (איור 2)והתאים לניסויי פלואורסצנטיות. ספקטרום פלואורסצנטיות של קומפלקס התחום ANS-N הציג דפוס דמוי FRET על עירור ב λ = 295 ננומ...

ANS נקשר לתחום N רקומביננטי של Ca2+ATPase. ספקטרום פלואורסצנטי מציג תבנית דמוית FRET עם עירור באורך גל של 295 ננומטר. שינוי כימי בתיווך NBS של Trp מרווה את הפלואורסצנטיות של N-domain, מה שמוביל להיעדר העברת אנרגיה (FRET) בין שאריות Trp ו- ANS.

שינוי כימי של שאריות טריפטופן ב- Ca רקומביננטיCa 2 +-ATPase N-דומיין לחקר טריפטופן-ANS FRET

The sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) is a P-type ATPase that has been crystallized in various conformations. Detailed functional ...

בדיקות אלה עשויות לעזור להבהיר את התפקיד של שאריות טריפטופן בחלבונים בעת ביצוע מחקרים מחייב ANS. הפלואורסצנטיות של ANS עולה עם קשירה לאתרים מבניים ספציפיים בחלבונים. לפעמים אתר איגוד ANS מאתר קרוב לשאריות טריפטופן עם מרחק המצביע על קיומו של FRET בין טריפטופן ו- ANS.NBS מתווך שינוי כימי של שאריות טריפטופן בחלבונים, מרווה את הפלואורסצנטיות שלה. לכן, בדיקות אלה מאפשרות לקבוע אם שאריות טריפטופן לתרום לעלייה בעוצמת פלואורסצנטיות ANS על ידי FRET. בעבודה זו, אנו משתמשים בתחום איגוד נוקלאוטידים רקומביננטי מהונדס מ- SERCA המכיל מוטציות, במטרה לאתר טריפטופן קרוב לאתר כריכת הנוקלאוטיד שבו ANS גם נקשר.מעש זה מהיר וקל לביצוע, ומכאן היתרון העיקרי שלו. נחישות בסיליקו של אינטראקציית ANS ו- SERCA N-Domain. צור מבנה תלת מימדי של החלבון על ידי מידול מולקולרי באמצעות תוכנת מידול החלבון המועדפת.זהה את שאריות חומצת האמינו היוצרות את אתר כריכת הנוקלאוטיד באמצעות התוכנה המבנית המולקולרית המועדפת ולקבוע את נוכחותם של שאריות ארגינין וליצין. אלה נדרשים עבור כריכת ANS ולהגדיל את עוצמת הפלואורסצנטיות. בגלל נוכחותם של שאריות ארגינין וליצין באתר כריכת הנוקלאוטיד של SERCA, אנו משערים את הכריכה של ANS ל- N-Domain.בדגם 3D, שאריות חומצת האמינו היוצרות את אתר כריכת ה- ATP מזוהות ומודגשות בכתום. באופן דומה, המוטציה טירוסין-לטריפטופן ממוקם ומודגש בכחול. בצע עגינה מולקולרית עם ATP, FITC ו- ANS.תוצאות עגינה מראות כי ANS מתאים היטב באתר כריכת הנוקלאוטיד, בדומה ל- ATP ו- FITC. FITC מתייגת את אתר איגוד הנוקלאוטיד. לחשב את המרחק המולקולרי בין שאריות טריפטופן ו ANS.20 אנגסטרום נראה מרחק ראוי עבור FRET. בצע סימולציה דינמית מולקולרית של קומפלקס ANS N-Domain כדי לקבוע את יציבות האינטראקציה. זמן סימולציה של 10 ננו-שניות מראה את יציבות המתחם.המשך לבצע את הניסויים במבחנה. ביטוי וטיהור של N-Domain רקומביננטי. לבטא ולטהר, על ידי כרומטוגרפיה זיקה, N-Domain רקומביננטי מהונדס.בצע SDS-PAGE של החלבון המטוהר כדי לקבוע את הטוהר. קבע את ריכוז החלבון על ידי ספיגה באורך גל של 280 ננומטר עם מקדם ההכחדה N-Domain. נטר את היווצרותו של מתחם ANS N-Domain בהתבסס על שינויי עוצמת הפלואורסצנטיות ANS ו- N-Domain.הכן פתרון מלאי ANS ב N, N-דימתילפורמיד. שוקל כמות קטנה של ANS, בין אחד לחמישה מיליגרם. להמיס ANS ב ML אחד של נפח סופי של N, N-דימתילפורמיד.הכן פתרון מלאי ANS 100 micromolar באמצעות פתרון ANS ב N, N-דימתילפורמיד. מערבבים את הפתרון על ידי מערבולת שלוש עד חמש פעמים. הכן את פתרון המניות של אן-בי-אס ב-נ', אן-דימתילפורמיד.לשקול כמות קטנה של NBS, אחד עד חמישה מיליגרם. להמיס את NBS ב ML אחד של N, N-דימתילפורמיד. הכן פתרון מניות NBS מילימולרי אחד באמצעות פתרון NBS ב N, N-דימתילפורמיד.מערבבים את הפתרון על ידי מערבולת שלוש עד חמש פעמים. טירט את N-דומיין עם ANS ולתעד את ספקטרום פלואורסצנטיות עבור עירור באורך גל של 295 ננומטר ב 25 מעלות. להשיג את בסיס ספקטרום הפלואורסצנטיות.הנח מ"ל אחד של 50 מילימולר חוצץ פוספט עם pH שמונה ב cuvette קוורץ פלואורסצנטית ML אחת. מקם את התא בתא התא התרמוסטטי של הספקטרופוטומטר והגדר את אורך גל העירור ל-295 ננומטר. תקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות.ספקטרום הפלואורסצנטיות של הריק מראה את שיא המים, אשר יש להפחית מאוחר יותר. השג את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותי של N-Domain. מניחים 900 מיקרוליטרים של 50 מילימולר חוצץ פוספט עם pH 8 בקובט קוורץ פלואורסצנטי.הוסף 100 מיקרוליטרים של השעיית N-Domain כדי להניב ריכוז סופי של N-Domain מיקרומולרי אחד. הומוגניזציה עדינה באמצעות מיקרופיט כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון. מקם את התא בתא התרמוסטטי של הספקטרופוטומטר.הגדר את אורך גל העירור ל 295 ננומטר. הקלט את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותית של N-Domain. הוסף ANS ולקבל את ספקטרום פלואורסצנטיות על ידי עירור אורך גל של 295 ננומטר.הוסף שני aliquot microliter של 100 פתרון מניות ANS micromolar ל- N-Domain מושעה כדי לקבל ריכוז סופי ANS 0.2 מיקרומולר. הומוגני בעדינות, באמצעות מיקרופיט כדי להבטיח את ההומוגניות של פתרון זה. תקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות.חזור על תוספות ANS והקלטת ספקטרלי פלואורסצנטי כמתואר לעיל עבור מערכת יחסים טוחנת N-Domain 1:1 ANS N-Domain. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה. התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד קבע אם תבנית דמוית FRET נוצרת על-ידי הספקטרום.ספקטרום הפלואורסצנטיות ANS N-Domain יוצר תבנית דמוית FRET. N-דומיין נטיה פלורסצית מהותית על ידי שינוי כימי טריפטופן עם NBS. השג שוב את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותי של N-Domain.הוסף aliquot microliter אחד של פתרון מניות NBS מילימולרי אחד N-Domain מושעה כדי להשיג ריכוז סופי של NBS מיקרומולר אחד. הומוגניזציה עדינה באמצעות מיקרופיט כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון. תקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות.חזור על תוספת NBS והקלטת ספקטרלי פלואורסצנטי עד תצפית פלואורסצנטית פנימית N-Domain מינימלית. הומוגניזציה עדינה באמצעות מיקרופיט כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה.התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד. טירט NBS שונה N-דומיין עם ANS על ידי הקלטת ספקטרום פלואורסצנטי ב 25 מעלות. הוסף ANS ולקבל את ספקטרום פלואורסצנטיות על ידי עירור אורך גל של 295 ננומטר.הומוגניזציה עדינה באמצעות מיקרופיט כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון. תקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה.התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד. ספקטרום פלואורסצנטיות שנוצר תומך או להפריך את המופע של FRET. כלומר כאשר FRET מתרחשת, פלואורסצנטיות ANS אינה גדלה ולהיפך.ראיות של ANS מחייב N-Domain שונה כימית על ידי עירור באורך גל של 370 ננומטר. הוסף ANS ל- N-Domain שונה NBS ורשום את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותית N-Domain על ידי עירור באורך גל של 370 ננומטר. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה.התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד. אשר איגוד ANS ל- N-Domain על-ידי עוצמת הפלואורסצנטיות הגוברת של ANS. איגוד ANS ל- N-Domain מראה עלייה פלואורסצנטית כאשר נרגשים באורך גל של 370 ננומטר.מבט כולל על התוצאות. קומפלקס פאנל A.ANS N-Domain מציג תבנית דמוית FRET כאשר הוא מרגש באורך גל של 295 ננומטר. פאנל B.NBS להרוות את פלואורסצנטיות מהותית N-דומיין על ידי שינוי כימי שאריות טריפטופן הבלעדי ב N-Domain שונה כימית.פאנל C.THE ANS פלואורסצנטיות עולה כאשר מרגש אורך גל של 295 ננומטר. פאנל D.THE הפלואורסצנטיות של ANS גדל גם כאשר מרגש אורך גל של 370 ננומטר. לכן, עירור ישיר של ANS אורך גל של 295 ננומטר הוא המקור העיקרי של פלואורסצנטיות ANS כאשר הוא מאוגד לאתר כריכת ATP. מסקנות.בדיקות אלה עשויות לשמש כדי לקבוע את קיומו של FRET בין שאריות טריפטופן ו ANS בחלבונים. ההבהרה של FRET, אישור או לא, בין טריפטופן ו ANS יאפשר להסיק מסקנות טובות יותר במחקרים מבניים חלבון. ההסתה עשויה להיות שימושית גם בעת שימוש פלואורופור אחרים.

chemical-modification-tryptophan-residue-recombinant-ca2-atpase-n

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מחקרי Biophysical והביוכימי של אינטראקציות בין חלבוני קרום תחומים מוטבעים-להתמודד עם אתגרים טכניים רבים, הראשונה שבן היא קבלת חומר הלימוד מתאים. מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקה וטיהור מתחמי פפטיד הטרנסממברני דיסולפיד-התייצב המתאימים לניתוח מבנים על ידי תהודה מגנטית גרעינית פתרון (NMR) ויישומים אנליטיים אחרים.

מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

פרוטוקול ביטוי קל לשימוש ונטול תאים לשילוב ספציפי לשאריות של אנלוגים של חומצות אמינו לא קנוניות בחלבונים, כולל ניתוח במורד הזרם, מוצג למחקרים רפואיים, פרמצבטיים, מבניים ופונקציונליים.

שאריות ספציפיות התאגדות של חומצות אמינו Noncanonical לחלבוני דגם שימוש<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; חינם-Cell מערכת-תמלול תרגום

הפרעות בקצב לב בירושה לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות המשנות את מסירת השטח של תעלות יונים אחד או יותר. הנה, אנחנו מתאימים זרימת cytometry מבחני לספק כימות של ביטוי החלבון הכולל ותא יחסית משטח של תעלות יונים רקומביננטי לידי ביטוי בתאים TSA-201.

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה&quot;כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

ניתוחים הביוכימי ומבניים של חלבונים glycosylated דורשים כמויות גדולות יחסית של דגימות הומוגנית. כאן, אנו מציגים שיטה כימית יעילה עבור גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים מטוהרים של חיידקים על ידי מיקוד תיולים Cys תגובתי.

מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

ביולוגיה סינתטית מאפשר ההנדסה של חלבונים עם מאפיינים חסרת תקדים באמצעות החדרת חומצות אמינו קאנונית co-translational. . הנה, הצגנו איך spectrally אדום-העביר גרסה של fluorophore GFP-סוג עם מאפייני ספקטרוסקופיות הרומן פלורסצנטיות, הנקרא חלבון פלואורסצנטי "זהב" (GdFP), מופק ב e. coli באמצעות הלחץ הסלקטיבי ההתאגדות (SPI).

הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

מאמר זה מתאר שיטות ספציפיות כדי לקבל כמויות הביוכימי של solubilized-חומרי ניקוי TRPV1 לניתוח spectroscopic. הפרוטוקולים המשולב לספק כלים הביוכימי biophysical זה ניתן להתאים להקל פונקציונלי מבניים ללימודי תעלות היונים בתרבית של סביבה מבוקרת ממברנה.

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

מאמר זה מציג סדרה של שיטות רצופות לביטוי וטיהור של סלמונלה טיפוס סינתאז comp פרוטוקול זה מערכת מהירה כדי לטהר את קומפלקס החלבון ביום. שיטות מכוסות הן מוטאגנסיס מכוונת אתר, ביטוי חלבון ב Escherichia coli, כרומטוגרפיה זיקה, כרומטוגרפיה סינון ג'ל, והתגבשות.

PCR מוטגנסיס, שיבוט, ביטוי, פרוטוקולי טיהור חלבונים מהירים והתגבשות של סוג הבר וצורות מוטציה של טריפטופן סינתאז

כדי להתגבר על המגבלות של מוטגנזה קלאסית מכוונת אתר, אנלוגים פרולין עם שינויים ספציפיים שולבו במספר חלבונים פלואורסצנטיים. אנו מראים כיצד החלפת מימן על ידי פלואור או של היחיד על ידי קשרים כפולים בשאריות פרולין ("ניתוח מולקולרי") משפיעה על תכונות חלבון בסיסיות, כולל קיפולם ואינטראקציה עם אור.

חילופי פרולין ספציפיים לשאריות על ידי אנלוגים פרולין בחלבונים פלואורסצנטיים: כיצד "ניתוח מולקולרי" של עמוד השדרה משפיע על קיפול ויציבות

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר היא שיטה לחקר תנועות תחום החלבונים בזמן אמת. שינוי טכניקה זו ליישומה בתאים מקומיים מאפשר כעת זיהוי ומעקב אחר תנועות חיישן מתח יחיד מתעלות Ca2+ מגודרות מתח בסיבי שריר שלד מבודדים.

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר בתאים מקומיים לחקר עוררות שרירי השלד

הפונקציות של חלבוני משפחת העל של דינמין תלויות בשינויים קונפורמטיביים יחד עם הידרוליזה של GTP. מערכת מתוארת באמצעות טכניקת FRET חד-מולקולה (smFRET) כדי לנטר את הדינמיקה הקונפורמטיבית של GTPase atlastin דמוי דינמין במצבי עומס נוקלאוטידים שונים.

הדמיית FRET של מולקולה אחת להתבוננות בדינמיקת הקונפורמציה של GTPase Atlastin דמוי דינמין

פרוטוקול זה מתאר שיטת טיהור SERCA משופרת, הכוללת את הטרהלוז הדו-סוכר בשלב הצנטריפוגה הסופי. פחמימה זו מייצבת חלבונים בתנאים קשים. ה-SERCA המטוהר היה פעיל קטליטית והפגין טוהר גבוה, מה שהופך אותו למתאים למחקרים מבניים ופונקציונליים.

טיהור הרטיקולום הסרקו-אנדופלזמי Ca2+-ATPase משריר הארנב

חקור שינוי כימי של שאריות טריפטופן בדומיין N של Ca2+-ATPase רקומביננטי לחקר קשר ANS ו-FRET. שיטת ספקטרוסקופיית פלואורסצנטה זו מאפשרת לזהות העברת אנרגיה בין טריפטופן ל-ANS בחלבונים.

שינוי כימי של שאריות טריפטופן ב- Ca רקומביננטי^{Ca 2 +}-ATPase N-דומיין לחקר טריפטופן-ANS FRET

גלה סרטונים נוספים