מאכיל מיקרו-תפוקה גבוהה לבדיקה לכימות הצריכה בדרוסופילה

מאכיל המיקרו-לוח מספק שיטה חסכונית פשוטה, בעלת תפוקה גבוהה למדידת התנהגות האכלת Drosophila, והוא מציע יתרונות מרובים על פני שיטות אחרות, משוכללות יותר. כימות הצריכה על-ידי מדידת ספיגה עם קורא לוחות מבטל מדידות ידניות ומסתיר הזנת נתונים ידנית. הנתונים מקובלים גם על חילוץ ועיבוד תכנותיים.

בעזרת תפוקה גבוהה זו אנו יכולים לכמת את הצריכה של חומרים מזינים מסיסים במים, תרופות, תרופות או רעלים, וניתן לשנות את המערכת עבור יישומים למגוון מיני חרקים. התחל על ידי שפיכת agarose מותך לתוך שוקת ריאגנט ולחלק 80 microliters של אגאות מותכות לתוך כל באר של 96 היטב מיקרופלאט באמצעות pipette רב ערוצי. מקררים את שאריות האגרוז עד שבוע בשקית אטומה ומכניסים אותה מחדש להכנת צלחות נוספות.

אם רצועות המחסום רופפות מדי, סליל אותם סביב האצבע כדי לתת להם עקמומיות להחזיק אותם בערוצים. הכנס את רצועות המכשול לערוצי רצועת המכשול כדי להכין את המצמדים. הצמיד את המצמד לצלחת רעב, הקפד לא להשתמש במצמד כדי לתפעל את הצלחת כמו המצמד עשוי להחליק.

ודא שהפינות הזוויתיות של המצמד תואמות לפינה הזוויתית של המיקרו-לוח כדי לשמור על כיוון נכון. תחת הרדמה CO2, למיין זבובים בני שלושה עד חמישה ימים. טען זבובים בודדים על ידי עמודה לתוך צלחת הרעב.

סגור כל עמודה כשהיא מתמלאת על-ידי התאמת רצועת המחסום שלה למיקום הסגור. הקלט בזהירות את פריסת הדגימה בתוך המיקרו-לוח. לאחר צלחת הרעב מתמלא, לאפשר לזבובים להתאושש באופן ספונטני לאחר הסרת CO2, ולהרעיב אותם במשך שש שעות החל מזמן ההחלמה הראשוני שלהם.

הכן 10 מיליליטר של מזון נוזלי בצינור חרוט 15 מיליליטר על ידי המסת 0.4 גרם של סוכרוז ו 0.1 גרם של תמצית שמרים ב 10 מיליליטר של מים מזוקקים. מערבולת הצינור עד המוצקים להתמוסס לחלוטין. הוסף 40 מיקרוליטרים של תמיסת ציר צבע והעבר את המזון הנוזלי למזרק של 10 מיליליטר עם מסנן 0.45 מיקרומטר.

מסנן כ 1.5 מיליליטר של הפתרון בכל פעם לתוך צינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר. מניחים את המזרק המכיל את הפתרון בצד ומסננים את הפתרון הנוסף לפי הצורך במהלך הכנת צלחת ההזנה. הכן צלחת מאכילה על ידי איטום החלק התחתון של מיקרו-לוח 1536-well עם סרט איטום.

השתמש במשוט איטום כדי לדבוק בסרט ביסודיות. לאחר מכן, גזור סרט עודף מהקצה השמאלי והיומי עם סכין גילוח. מחלקים 10 מיקרוליטרים של עמודת המזון הנוזלי המסונן לבאר השמאלית העליונה עבור כל אשכול של ארבע בארות של המיקרו-לוח 1536-well.

לאחר כל הבארות מתמלאות, להחיל סרט איטום על החלק העליון של הצלחת, בעקבות אותם צעדים המשמשים לאטום את החלק התחתון של microplate. חזור על הפעולה לקבלת מספר הצלחות הרצוי. צנטריפוגות את הצלחות ב 200 פעמים G במשך 10 שניות כדי ליישב את הנוזל.

אל תאפשר את הצלחת להיות צונן מאז זה יכול לגרום עיבוי להצטבר בבארות, טשטוש קריאות ספיגה. לנקב את בארות על פני השטח העליון של הצלחת עם כלי בדיקה מחט מצויד מחט בקוטר 0.25 מ"מ, באמצעות אותו סדר לנקב כפי שהיה בשימוש בעת חלוקת הפתרונות. לנגב את המחט בין פתרונות כדי למנוע זיהום צולב.

הופכים את הצלחת ומנקבים את הבארות בתחתית. קרא את ספיגת הצלחת ב 630 ננומטר ללא מכסה. מניחים מכסה פנימי על סרט האיטום העליון כדי להבטיח שטבעות ה עיבוי יכתרו את בארות המחוררות, ואז הניחו את המכסה החיצוני על הצלחת.

מניחים את צלחת המאכיל עם הפנים כלפי מעלה על המצמד כך שהמדריכים מיישרים את החורים המתאימים של צלחת ההזנה וצלחת הרעב. ודא המצמד ואת הצלחות מכוונים כראוי. לאחר שכל לוחות המאכילים נטענים על המצמדים, פתחו את בארות הלוחות על ידי התאמת רצועות המחסום במצמד.

מניחים את מצמד ואת מכלולי צלחת במיכל המשני. מניחים את החצי התחתון של קופסת פיפטה המכילה מגבות נייר ספוגות בכל מיכל משני כדי לספק לחות. סגור את המכסה של הגורם המכיל המשני והעבר אותו לסביבה מבוקרת.

אפשר לזבובים לצרוך במשך 22 שעות. לאחר 22 שעות של חשיפה, לבדוק כל צלחת עבור זבובים מתים ולעדכן את פריסת הצלחת בהתאם. לאחר כל הצלחות נבדקים, למרדים את הזבובים בהמוניהם על ידי שאיבת CO2 בתוך המיכל המשני.

לאחר כ-60 שניות, ודאו שכל הזבובים משותקים. הקש בעדינות על הזבובים לתוך צלחת הרעב והחלף את רצועות מחסום הפלסטיק. הסר את לוחות המאכיל לקריאה.

קרא שוב את ספיגת הצלחת ב-630 ננומטר. חזור על התהליך עד שכל הלוחות נקראו. האידוי היה מכומת עבור כל באר ונמצא כדי לקבוע אם כל מתאם קיים בין בארות של לוחות בודדים.

מקדמי מתאם פירסון לאידוי לעומת שורות ואידוי לעומת עמודות חושבו כדי להעריך מגמות בין אידוי למיקומים טובים. צריכה של זבובי קנטון-SB בני שלושה עד חמישה ימים כותמה כדי לקבוע את תוקף הפרוטוקול. זבובים קיבלו בחירה בין פתרון 4%סוכרוז עם 1%תמצית שמרים ותמיסת סוכרוז 4% בתוספת 15%אתנול 1%תמצית שמרים.

הן זכרים והן נקבות הראו העדפה מכרעת לפתרון עם אתנול ותמצית שמרים. חיוני לשמור על עקביות בעת בניית לוחות המאכילים, ולהבטיח כי כל זבוב יוצג עם תרחיש צריכה זהה לגבי נפח המזון, אידוי וגישה. טכניקה זו תאפשר לחוקרים בתחום Drosophila לבצע תפוקה גבוהה ביצועים עבור התנהגויות צריכה והעדפה עם תפוקה גבוהה יותר ובעלות נמוכה יותר בהשוואה לשיטות מסורתיות.