Name: הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: למדו הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM. פרוטוקול זה מאפשר חקר מבני חלבונים בטמפרטורות מוגברות ומספק תובנות לגבי תלות המבנה בטמפרטורה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד"ר הרבה רמיגי מתרמו פישר סיינטיפיק על עצות מועילות. ניסויי הקריו-EM בוצעו במתקן האקדמיה סיניקה קריו-EM (ASCEM). ASCEM נתמך על ידי האקדמיה הסינית (מענק לא. AS-CFII-108-110) ופרויקט החלבון של טייוואן (מענק מס' AS-KPQ-109-TPP2). המחברים מודים גם לגב' הוי-ג'ו הואנג על הסיוע בהכנת הדגימה.

הערה: פרוטוקול זה נועד להשתמש במנגנון ויטריפיקציה מסחרי שונה כדי להכין את דגימות מיקרוסקופיית הקריו-אלקטרונים (cryo-EM) בטמפרטורות ספציפיות, גבוהות במיוחד מ-37 מעלות צלזיוס. מערך הניסוי הכולל מוצג באיור 1. הפרוטוקול משתמש ב-55 מעלות צלזיוס כדוגמה. לגבי התנאים הספציפיים בטמפרטורות אחרות, עיין בטבלה משלימה 2 בהפניה12.
1. הכנת מנגנון הוויטריפיקציה
<ol><li>צור חור של 1 ס"מ בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל בקצה הסגור שלו.</li>
	<li>הניחו את הצינור בתא מנגנון הוויטריפיקציה בשקע המים העל-קולי, כפי שמוצג באיור 2. הערה: המטרה היא למזער את עיבוי המים על ידי הנחיית אדי מים למחליף החום דרך הצינור לפני שהם מגיעים לכל התא.</li>
	<li>הגדירו את טמפרטורת מנגנון הוויטריפיקציה לטמפרטורה שצוינה (למשל, 55 מעלות צלזיוס, כפי שמוצג באיור 3), ואפשרו לתא מנגנון הוויטריפיקציה להגיע ל-55 מעלות צלזיוס וללחות יחסית של 100%. תן לו לעמוד לפחות חצי שעה כדי לייצב את התנאים לפני תחילת הניסוי.</li>
</ol>2. חימום המדגם והכלים
<ol><li>מניחים את אמבט המים על פלטה חמה ומכוונים את הפלטה לטמפרטורה הרצויה (כאן 55 מעלות צלזיוס). בדוק עם מדחום כדי לוודא שהמים מגיעים ל -55 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>דגירה של הדגימה באמבט המים וחמם מראש את קצה הפיפטה בקצה הפלטה למשך 2 דקות או יותר לפני ניסוי ההכתמה. הערה: הגדרת הטמפרטורה הגבוהה ביותר עבור תא מנגנון הוויטריפיקציה היא 60 °C. כדי להכין רשתות טמפרטורה גבוהות יותר לניסוי cyro-EM (למשל, 70 מעלות צלזיוס), הדגימה דוגרת באמבט המים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס, והממוצע בין טמפרטורת הדגימה לטמפרטורת מנגנון הוויטריפיקציה מוערך כטמפרטורה בפועל של הדגימה ברשת (70 מעלות צלזיוס במקרה זה). עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים ומגבלות על אומדן זה.</li>
</ol>3. הכנה לניסוי הכתמים
<ol><li>Glow לפרוק רשת הנתמכת בפחמן חורי ב-25 mA למשך 30 שניות, או חלופה לערכים בהתאם למכשיר שבו נעשה שימוש.</li>
	<li>לדגום את הפינצטה עם הרשת במנגנון vitrification במשך 2 דקות או יותר.</li>
	<li>מלאו את מיכל האתאן באתאן על פי הנהלים הסטנדרטיים. אל תתנו לאתאן לעלות על גדותיו. הערה: שלב זה אורך כ-10 דקות ויש לעקוב אחריו מיד עם ניסוי הכתם כדי למנוע קפיאה.</li>
	<li>הכניסו את נייר הסינון של הוויטריפיקציה לתא מנגנון הוויטריפיקציה לא לפני 5 דקות לפני ניסוי ההכתמה. הערה: הצבת נייר הסינון בתא מוקדם מדי תגרום לו להיות רטוב מדי.</li>
</ol>4. ניסוי הכתמה
הערה: כשאתם מחזיקים את הרשת, ודאו שהרשת יציבה ושיש אזור מגע מינימלי עם הפינצטה (איור 4). זה נעשה כדי לשמור על יעילות הקירור הטובה ביותר של אתאן וכדי למנוע קרח שאינו זגוגי.
<ol><li>השתמש בקצה פיפטה כדי להחיל 7-9 μL של הדגימה על הרשת. לאחר מכן המתן 1-2 שניות, כתם במשך 1-1.5 שניות, וצלל במהירות את הדגימה לאתאן נוזלי.</li>
	<li>מעבירים את הרשת מאתאן נוזלי לקופסת הקריו, המאוחסנת בחנקן נוזלי. הערה: שלב זה חייב להתבצע בזהירות רבה מכיוון שהפינצטה עדיין חמה, כך שמיכל מיכל הקירור מלא באדים בשלב זה.</li>
</ol>5. בדיקת איכות לרשתות
<ol><li>גזור את הרשתות והעלה אותן למכשיר cryo-EM.</li>
	<li>השתמש במסך התצוגה של מכשיר cryo-EM ובפונקציית המינון הנמוך של התוכנה כדי לסנן את מצב הקרח ברשת ואת התפלגות הדגימה ברשת. הערה: לעתים קרובות, הרשתות יבשות מאוד, או ששכבת הקרח עבה מדי. שיעור ההצלחה של הרשתות שהוכנו בטמפרטורות גבוהות נמוך משמעותית מזה שבטמפרטורת החדר או 4 מעלות צלזיוס. תוצאות מייצגות של רשתות טובות ורשתות לא משביעות רצון מוצגות בסעיף הבא.</li>
	<li>אם איכות הרשת המתקבלת אינה טובה, חזור על תהליך הכנת הרשת בתנאים מגוונים (כגון זמן המתנה, זמן הכתמה וכו '). אם איכות הרשת המתקבלת טובה, חזור על אותם שלבים כדי ליצור רשתות בטמפרטורה שונה.</li>
</ol>6. איסוף נתונים
<ol><li>העבר את הרשתות באיכות טובה למכשיר cryo-EM ברזולוציה גבוהה.</li>
	<li>ביצוע איסוף נתונים וניתוח נתונים על פי נהלים שנקבעו. הערה: כפי שמוצג בפרסום הקודם שלנו, הרזולוציה של המבנה אינה מושפעת מהטמפרטורה הגבוהה12.</li>
</ol>

<ol><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li>
<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li>
<li>Cabra, V., Samsó, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+of+cryo-electron+microscopy%3A+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).</li>
<li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+speed%3A+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+operating+principles+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li>
<li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li>
<li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structure+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li>
<li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

בשלב 1 של הפרוטוקול, ודא שצינור הצנטריפוגה הותקן היטב ואינו נופל כאשר הניסוי בעיצומו. בשל הצטברות של מספר רב של טיפות מים בתא, אשר יכול לשנות את יכולת ספיחה של נייר הסינון, מומלץ כי הזמן הכולל של הניסוי לא יעלה על 30 דקות לאחר שתא מנגנון הוויטריפיקציה הגיע לטמפרטורת שיווי המשקל. אם זמן הפעולה עולה על 30 דקות, המפעיל צריך להחליף את נייר הסינון ולהמתין עד שהתא יאזן שוב את הטמפרטורה והלחות. בשלב 8 של הפרוטוקול, נפח הדגימה המוצע של 7-9 μL גדול מהרגיל מכיוון שאחרת, הדגימה מתאדה במהירות בטמפרטורה גבוהה, מה שמוביל לריבועים ריקי...

טכנולוגיית cryo-EM לפתרון מבנים של קומפלקסים חלבונים המשיכה להשתפר, במיוחד בכיוון של קבלת מבנים ברזולוציה גבוהה 1,2. בינתיים, הנוף של היישום שלה הורחב גם על ידי שינוי תנאי הדגימה כגון pH או ליגנדות לפני תהליך vitrification3, הכולל הכנת רשתות דגימה ואחריו הקפאת צלילה 4,5. תנאי חשוב נוסף הוא הטמפרטורה. למרות שניסויי cryo-EM, כמו קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, מבוצעים בטמפרטורות נמוכות, המבנה שנפתר על ידי cryo-EM משקף את המבנה במצב התמיסה לפני הוויטריפיקציה. עד לאחרונה, רוב מחקרי הקריו-EM של ניתוח חלקיקים בודדים (SPA) משתמשים בדגימות שנשמרות על קרח (כלומר, ב-4 מעלות צלזיוס) לפני ויטריפיקציה6, אם כי מספר מחקרים משתמשים בדגימות בטמפרטורת החדרסביב 7,8,9,10 או עד 42 מעלות צלזיוס 11. בדו"ח שפורסם לאחרונה, ביצענו מחקרים תלויי טמפרטורה של האנזים קטול-חומצה רדוקטויזומראז (KARI) מהארכיאון התרמופילי סולפולובוס סולפטריקוס (Sso) בשש טמפרטורות שונות מ-4 מעלות צלזיוס עד 70 מעלות צלזיוס12. המחקרים שלנו מצביעים על כך שחשוב להכין רשתות דגימה בטמפרטורות רלוונטיות מבחינה פונקציונלית וכי cryo-EM היא השיטה המבנית היחידה האפשרית למעשה לפתרון המבנה של אותו קומפלקס חלבונים בטמפרטורות מרובות.
הקושי העיקרי לוויטריפיקציה בטמפרטורות גבוהות הוא למזער את עיבוי האדים ולהשיג קרח דק. כאן אנו מדווחים על הפרוטוקול המפורט המשמש להכנת רשתות מדגם בטמפרטורות גבוהות במחקר הקודם שלנו על Sso-KARI 12. אנו מניחים שהקוראים או הצופים כבר מנוסים בהליכי הכנת המדגם הכוללים ועיבוד הנתונים לניסויים cryo-EM ומדגישים את ההיבטים הרלוונטיים לטמפרטורה גבוהה.

<table><tbody><tr><td>פלקון שפופרת</td><td>פלקון</td><td>352070</td><td>גודל: 50 מ"ל</td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>טד פלה</td><td>47000-100</td><td>&אוסלאש; 55/20 מ"מ, כיתה 595</td></tr><tr><td>HI1210</td><td>אמבט מים</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>K100X</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי</td><td></td><td>פריקת זוהר</td></tr><tr><td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid</td><td>Ted Pella</td><td>658-200-CU-100</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios G3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1063996</td><td>הדמיה במינון נמוך</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה ויטרובוט</td><td>טד פלה</td><td>47000-500</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור cryo-em

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

רשתות הדגימות לניסויים במיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (cryo-EM) מוכנות בדרך כלל בטמפרטורה אופטימלית לאחסון דגימות ביולוגיות, לרוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולעיתים בטמפרטורת החדר. לאחרונה גילינו שמבנה החלבון שנפתר בטמפרטורה נמוכה עשוי שלא להיות רלוונטי מבחינה תפקודית, במיוחד עבור חלבונים מארכאה תרמופילית. פותח הליך להכנת דגימות חלבון בטמפרטורות גבוהות יותר (עד 70 מעלות צלזיוס) לניתוח cryo-EM. הראינו שהמבנים מדגימות שהוכנו בטמפרטורות גבוהות יותר רלוונטיים מבחינה פונקציונלית ותלויים בטמפרטורה. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת רשתות מדגם בטמפרטורה גבוהה, תוך שימוש ב- 55 מעלות צלזיוס כדוגמה. הניסוי עשה שימוש במנגנון ויטריפיקציה ששונה באמצעות צינור צנטריפוגה נוסף, ודגימות דוגרו בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. הנהלים המפורטים היו מכווננים כדי למזער את עיבוי האדים ולקבל שכבה דקה של קרח על הרשת. דוגמאות לניסויים מוצלחים ולא מוצלחים מסופקים.

סקירת ההגדלה הנמוכה מוצגת באיור 5A,B. לוח A הוא דוגמה לרשת מוצלחת. יש שיפוע קרח משמאל למעלה (עבה יותר) לימין למטה (דק יותר או ריק). רשת כזו מקלה על מציאת עובי מתאים של שכבת הקרח באזור האמצעי המתאים לאיסוף נתונים, כגון הקופסאות הכחולות והירוקות. הרשת B יבשה מדי. לריבועים ברשת יש ניגודיות בהירה, כלומר שכבת הקרח דקה מדי או שאין שכבת קרח כלל. רק שני הריבועים המצוינים על ידי החצים האדומים מתאימים לאיסוף נתונים.
יתר על כן, דוגמאות לתמונות במינון נמוך מר...

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט להכנת רשתות דגימה בטמפרטורות של עד 70 מעלות צלזיוס, לפני שקיפאון הצניחה לניסויי cryo-EM.

הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

הפונקציות של חלבונים הן תלויות טמפרטורה והן אופטימליות בטמפרטורה. פרוטוקול זה מספק דרך לפתור מבנים חלבוניים בטמפרטורות גבוהות יותר. גישה זו יכולה לספק מבנים רלוונטיים מבחינה פונקציונלית ולשפר את ההבנה של התלות בטמפרטורה של מבנים חלבוניים.מי שידגים את ההליך יהיה יואן-צ'יה צ'אנג, מנהל המתקן של האקדמיה סיניקה קריו EM. התחל על ידי יצירת חור של סנטימטר אחד בצינור צנטריפוגה של 50 מ"מ בקצה הסגור שלו. מקם את הצינור בתא מנגנון הוויטריפיקציה בשקע המים העל-קולי.הגדר את טמפרטורת מנגנון הוויטריפיקציה לטמפרטורה שצוינה, ואפשר לתא מנגנון הוויטריפיקציה להגיע ל-55 מעלות צלזיוס וללחות יחסית של 100%. תן לו לעמוד לפחות חצי שעה כדי לייצב את התנאים לפני תחילת הניסוי. מניחים את אמבט המים על פלטה חמה ומכוונים את הצלחת החמה לטמפרטורה הרצויה.בדוק עם מדחום כדי לוודא שהמים מגיעים ל -55 מעלות צלזיוס. דגירה של הדגימה באמבט המים, ומחממים מראש את קצה הפיפטה בקצה הפלטה החמה במשך שתי דקות או יותר לפני ניסוי ההכתמה. זוהר לפרוק רשת נתמכת פחמן חורי ב 25 מיליאמפר במשך 30 שניות.הכניסו את נייר הסינון של הוויטריפיקציה לתא מנגנון הוויטריפיקציה לא לפני חמש דקות לפני ניסוי ההכתמה. לדגום את הפינצטה עם הרשת במנגנון vitrification במשך שתי דקות או יותר. בנה את מיכל האתאן עם אתאן על פי נהלים סטנדרטיים, כדי להבטיח שהאתאן לא יעלה על גדותיו.השתמש פיפטה כדי להחיל שבעה עד תשעה microliters של הדגימה על הרשת. לאחר מכן המתן שנייה עד שתיים, הכתם למשך שנייה עד שנייה וחצי, וצלל במהירות את הדגימה לתוך אתאן נוזלי. מעבירים את הרשת מאתאן נוזלי לקופסת הקריו המאוחסנת בחנקן נוזלי.גזור את הרשתות ופורק אותן כדי לרכוש מיקרוסקופ אלקטרונים או מכשיר Cryo EM. השתמש במסך התצוגה של מכשיר ה- Cryo EM ובפונקציית המינון הנמוך של התוכנה, כדי לסנן את מצב הקרח ברשת ואת התפלגות הדגימה ברשת. אם איכות הרשת המתקבלת אינה טובה, חזור על תהליך הכנת הרשת בתנאים מגוונים כגון זמן המתנה, זמן הכתמה וכו '.אם איכות הרשת המתקבלת טובה, חזור על אותם שלבים כדי ליצור רשתות בטמפרטורה שונה. העבר את הרשתות באיכות טובה למכשיר Cryo EM ברזולוציה גבוהה. ביצוע איסוף נתונים וניתוח נתונים על פי נהלים שנקבעו.במקרה של הרשת המוצלחת, נוצר שיפוע קרח עם קרח עבה יותר בפינה השמאלית העליונה של הרשת וקרח דק יותר בפינה הימנית התחתונה. קופסאות כחולות וירוקות המתאימות לאיסוף נתונים נצפו ברשת המוצלחת. ניגוד בהיר נצפה ברשת השנייה.מציין שכבה דקה, של קרח או היעדר קרח. רק שני ריבועים נמצאו מתאימים לאיסוף נתונים ברשת השנייה. אחת הרשתות כללה קרח בעיקר בצורת גבישין, שלא היה מתאים לאיסוף נתונים.מצד שני, הרשת השנייה הראתה ששכבת הקרח נמצאת ברובה במצב אמורפי המתאים לאיסוף נתונים. הכנת המיכל ואחרים צריכה להיות שלמה על פי נקודת זמן. בקרת זמן וסיום הניסוי במהירות ובדייקנות הם החשובים ביותר.בהתאם לתוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה, ייתכן שהחוקר יצטרך להיות זהיר יותר בהגדרת התנאים הפשוטים.

preparation-of-high-temperature-sample-grids-for-cryo-em

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מציגים פרוטוקול על איך לנצל טומוגרפיה קריו-אלקטרון תפוקה גבוהה כדי לקבוע ברזולוציה גבוהה במבנים באתרו של מכונות מולקולריות. הפרוטוקול מאפשר כמויות גדולות של נתונים לעיבוד, ימנע צווארי בקבוק משותפים ומפחית את זמן ההשבתה משאב, המאפשר למשתמש להתמקד בשאלות ביולוגיות חשובות.

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

מכשיר ושיטות ההכנה של אמצעי אחסון מדגם בגודל nanoliter במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מוצג. אין מדרגות נייר סופג נדרשים, וכך להימנע ההשלכות מזיקה שיכולה להיות חלבונים, הפחתת הדגימה אובדן ולאפשר הניתוח של תא בודד lysate עבור פרוטאומיקס חזותי באופן משמעותי.

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש בהתקן מהיר לייצור רשת הן לייצור רשת מהירה והן לערבוב מהיר והקפאה כדי לבצע ניסויים שנפתרו בזמן.

הכנת רשת מהירה למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית שנפתרה בזמן

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את השימוש ב- Spotiton, מערכת רובוטית חדשנית, כדי לספק שתי דוגמאות של עניין על רשת ננו-חוטים עצמית המערבבת לפחות 90 אלפיות השנייה לפני vitrification בקריוגן נוזלי.

הכנת רשת מיקרוסקופית קריו-אלקטרון למחקרים שנפתרו בזמן באמצעות מערכת רובוטית חדשנית, Spotiton

יחס אות לרעש של נתונים הוא אחד השיקולים החשובים ביותר בביצוע מדידות עקיפה של קרני רנטגן ממיקרו-קריסטלים. קו הקרן VMXm מספק סביבה עם רעש נמוך ומיקרואורגניזם לניסויים כאלה. כאן, אנו מתארים שיטות הכנה לדוגמה עבור microcrystals הרכבה וקירור עבור VMXm וקווי קרן קריסטלוגרפיה מיקרומוקולריים אחרים.

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

קביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים באמצעות cryoEM הפכה לשגרה עבור סוגים מסוימים של חלבונים ומתחמים. כאן, צינור זה מסוכם (הכנה לדוגמה, סינון, רכישת נתונים ועיבוד) והקוראים מופנים למשאבים ומשתנים מפורטים נוספים שעשויים להשתנות במקרה של דגימות מאתגרות יותר.

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

כתב יד זה מתאר את שיטת הכתם וצלילה להקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד.

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

כאן, אנו מציגים צינור לכרסם קרן יונים ממוקדת מתאם תלת-ממדי על הנחיית הכנת דגימות תאיות לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית. המיקום התלת-ממדי של חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי נקבע תחילה על ידי מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, ולאחר מכן מיועד לכרסום. הפרוטוקול מתאים לתאי יונקים, שמרים וחיידקים.

הכנת הדגימה על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת תלת-ממדית לטומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה

שיטה זו מספקת פרוטוקול נגיש וגמיש להכנת רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) עבור קריוטומוגרפיה תאית באתרה ומיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאמי (CLEM).

הכנת דגימה לקריוטומוגרפיה באתרו של תאי יונקים

פרוטוקול שלב אחר שלב לייצור רשתות זיקה סטרפטאווידין מסופק לשימוש במחקרים מבניים של דגימות מקרומולקולריות מאתגרות על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים.

ייצור רשת Streptavidin-Affinity להכנת דגימת מיקרוסקופ אלקטרונים Cryo-Electron

פרוטוקול זה מציג שיטה מעשית המשתמשת ב-Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) כדוגמה לטיפול בהתפלגות חלקיקים לא אחידה באמצעות אופטימיזציה של הכנת הדגימה, ומספק התייחסות לחוקרים להבהיר ביעילות מבנים מקרומולקולריים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryo-EM).

אופטימיזציה של הכנת דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני

למדו הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM. פרוטוקול זה מאפשר חקר מבני חלבונים בטמפרטורות מוגברות ומספק תובנות לגבי תלות המבנה בטמפרטורה.

הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

גלה סרטונים נוספים