Name: מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: למדו מערכת תרבית איברי מעיים חדשנית לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה בשיטת PDMS. שיטה זו משלבת שליטה ניסויית הדוקה עם שימור הפיזיולוגיה המעייתית לחקר תגובות מעיים לגירויים ספציפיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדת יששכר בעבר ובהווה על תרומתם החשובה באופטימיזציה של פרוטוקול מערכת תרבות איברי הבטן. אנו מודים ליעל לור על העריכה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הישראלית למדע (מענק מס' 3114831), הקרן הישראלית למדע - תכנית משותפת של מכון רחב (מענק מס' 8165162) וקרן גאסנר למחקר רפואי.

פרוטוקול זה תואם את הנחיות הטיפול בבעלי חיים שאושרו על ידי ועדת האתיקה לרווחת בעלי החיים.
1. הכנת ניסוי
<ol><li>ייצור של מכשיר תרבות איברי המעיים (3 ימים)<ol>
<li>באמצעות מדפסת תלת-ממד, הדפס את תבניות הפלסטיק הניתנות לשימוש חוזר עבור התקן תרבות האיברים (להתקן יש 6 בארות, עם 24 חורים קטנים וגדולים, ולכסה כיסוי המכשיר) (קבצים תלת-ממדיים מצורפים). הערה: תבניות פלסטיק אלה עשויות לשמש לייצור מכשירים רבים.</li>
		<li>הכנס את המחטים קהות הקצה (22 G ו 18 G) למיקום המתאים בתוך תבנית המכשיר ויצוק כ 20 גרם של תערובת polydimethylsiloxane (PDMS) (יחס משקל 1:10, בסיס לזרז) עבור קבוצה אחת של המכשיר והמכסה.</li>
		<li>מניחים את התבניות בתא ואקום למשך 30 דקות, כדי להסיר בועות אוויר מתערובת PDMS.</li>
		<li>לדגור את התבניות ב 55 °C (55 °F) לילה, כדי להשלים PDMS פילמור.</li>
		<li>כאשר PDMS מוגדר, לשלוף את המחטים מן התבנית בזהירות לשחרר את מכשיר התרבות ואת המכסה מן תבניות פלסטיק.</li>
		<li>הסר שאריות PDMS מקווי המתאר של הבאר באמצעות להב כירורגי. חברו את התקן ה-PDMS ואת כיסוי המכשיר לכוס כיסוי (75 מ"מ x 50 מ"מ מיקרו שקופיות) באמצעות דבק סיליקון לא רעיל והותיר את החלקים מוגדרים למשך הלילה (החל את הדבק על הצד החלק של המכשיר).</li>
		<li>הכנס 12 מחטים 22 G עבור לומן ו12 18 G מחטים עבור הבאר. תקן את כל המחטים במקום באמצעות סיליקון ולתת לו להגדיר בן לילה. הכנס שתי מחטי 18 G לתוך מכסה הכיסוי לזרימת אוויר נכונה פנימה והחוצה של מכשיר תרבות איברי המעיים.</li>
		<li>בדוק את כל המחטים לדליפות באמצעות מזרק מלא מים. בדוק כי אין דליפה מן בארות על ידי מילוי בארות במים.</li>
		<li>הנח שני קשרים כירורגיים על כל מחט 22 G כי יהיה מחובר המעי הגס. מניחים את ההתקן והמכסה בשקית נייר אוטומטית ומעקרים בהפעלה אוטומטית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מדיום תרבות (0.5 שעות)<ol>
<li>בברדס ביולוגי, לערבב את הדברים הבאים (בצינור 50 מ"ל): 37 מ"ל של מדיום Dulbecco שונה של Iscove (IMDM), 10 מ"ל של החלפת סרום KSR, 1 מ"ל של תוסף B27, 0.5 מ"ל של תוסף N2, 0.5 מ"ל של 1 M HEPES חוצץ, ו 0.5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות.</li>
		<li>סנן ואחסן את המדיום המלא ב- 4 °C (7°F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת צינורות וכלי ניתוח<ol>
<li>לחתוך את האורך המתאים של צינורות עבור לומן קלט, קלט היטב, לומן פלט, ופלט היטב (12 צינורות קצרים 12 צינורות ארוכים). חבר מתאם מתאים לכל צד של הצינור.</li>
		<li>הכן את הכלים הכירורגיים: מספריים ישרים, מלקחיים דקים פי 4 ומלקחיים חדים פי 2.</li>
		<li>מניחים את הצינורות ואת הכלים הכירורגיים בשקית נייר אוטומטית ומעקרים אותם באמצעות autoclave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן את הקלט הזוהר (גירוי רצוי - חיידקים, שרפרף, תרופות וכו ').<ol>
<li>לפני הניסוי, לקבוע את העומס החיידקי של תרבית החיידקים, על ידי דילול סדרתי12, ותרבות בתנאים אירוביים ו / או אנאירוביים.</li>
		<li>לאחר חישוב העומס החיידקי, לדלל את תרביות החיידקים במדיום תרבית רקמות סטריליות כדי להשיג את ריכוז החיידקים הנדרש. עבור דגימות צואה, לסנן באמצעות מסננת 100 מיקרומטר. הערה: עבור גירוי לאבקטריאלי (תרופות, מטבוליטים, וכו '), לדלל את החומר לריכוז הנדרש באמצעות מדיום תרבית המעיים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת התקנה של ניסוי
<ol><li>בתוך החממה של תרבות האיברים, הפעל את יחידת התנור, והגדר אותה ל -37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הגדר את המשאבות, כמו גם את מזרקי הקלט והפלט.</li>
	<li>קלט בינוני של תרבית רקמות<ol>
<li>במכסה המנוע הביולוגי או הזרימה למינארי, מלאו את מזרקי קלט היטב במדיום תרבות מלא. הנפח הסופי תלוי במשך הניסוי ובקצב הזרימה; בדרך כלל 1 מ"ל / שעה בתוספת מדיום נוסף לטיהור.</li>
		<li>חבר את הצינורות למזרקים באמצעות מתאם מנעול Luer. מניחים את המזרקים המלאים במשאבות המזרק.</li>
		<li>טהר את מזרקי הקלט. ודא כי בינוני היטב זורם מכל הצינורות לתוך פסולת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>קלט זוהר<ol>
<li>מלאו את מזרקי הקלט הזוהרים בטיפול בגירוי (חיידקים, תרופות וכו'). הנפח תלוי במשך הניסוי ובקצב הזרימה (בדרך כלל 30 μL/h בתוספת מדיום נוסף לטיהור).</li>
		<li>חבר את הצינורות למזרקים באמצעות מתאם מנעול Luer. מניחים את המזרקים המלאים במשאבות המזרק.</li>
		<li>טיהור מזרקי קלט. ודא כי הגירוי לזרום מתוך כל הצינורות לתוך פסולת. היזהר לא לזהם את הגירויים השונים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>פלטי<ol>
<li>הניחו את המזרקים הריקים במשאבות מזרק היציאה (הגדר מצב משאבה ל'משיכה').</li>
	</ol>
</li>
	<li>כיוונון התקן<ol>
<li>הגדר את הווסת השולט בתערובת הגז (95% O2 + 5% CO 2 ) קצבזרימהלזרימה עדינה ומינימלית.</li>
		<li>תבדוק את המכשיר במכסה המנוע.</li>
		<li>לשטוף את המחטים של המכשיר עם IMDM סטרילי לשטוף את המחטים.</li>
		<li>הוסף 500 μL של מדיום תרבות סטרילית לתוך כל באר של המכשיר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה לפירוק רקמות<ol>
<li>שים את הכלים הכירורגיים הסטריליים בתוך מכסה המנוע למינאר.</li>
		<li>מלא מזרק 10 מ"ל עם IMDM סטרילי ולחבר סטרילי (autoclaved) 22 G מחט קהה סוף לשטיפה של המעי הגס.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. תרביות איברים
<ol><li>הקרבת עכברים ותחוש רקמות<ol>
<li>בשכונת למינאר, להקריב עכברים בני 12-14 יום על ידי עריפת ראש. מרססים את העכברים ב-70% אתנול ומניחים את העכברים על צלחת פלסטיק.</li>
		<li>באמצעות מספריים חדים ומלקחיים, לנתח את העכבר ולהוציא את מערכת העיכול מהבטן לפי הטבעת על ידי חיתוך כל רקמות השומן והחיבור. חותכים את המעי הגס ומניחים אותו על צלחת חדשה. הערה: מזער את המגע עם רקמת המעי הגס. אין לגעת בחלק האמצעי של רקמת המעי הגס. החזק את הרקמה בעדינות ורק בשולי הרקמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שטיפה ושטיפה של המעי הגס<ol>
<li>תחת מיקרוסקופ ניתוח, יש לשטוף בעדינות את תוכן המעי הגס עם IMDM סטרילי (לצד הפרוקסימלי) עם מזרק מוכן של 10 מ"ל (שלב 2.7.2). לאחר הסרת הצואה מרקמת המעי, מניחים את המעי הגס בצלחת חדשה 6 היטב מלא 0.5 מ"ל של IMDM סטרילי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חיבור נקודתיים להתקן<ol>
<li>קח את הרקמה בזהירות לחבר אותו על מחט 22 G ולעשות עניבה הדוקה עם שני החוטים. בשלב זה, זה הכרחי כדי לשמור על הכיוון הנכון של המעי הגס לזרימת לומן (פרוקסימלי = קלט, דיסטלי = פלט). חזור על שלבים 3.2-3.3 עבור כל 6 הרקמות.</li>
		<li>ודא שמנעולי לויר מחט הקלט ריקים מהמדיום. אם לא, תרוקן אותם. הוסף גירויים לסלסל Luer מחט הקלט (כדי למנוע כניסה של בועות אוויר לתוך לומן). חזור על שלב זה עבור כל מעי גס עם הגירוי המתאים.</li>
		<li>בדוק כי כל הרקמות מחוברות ומניחים את מכסה הכיסוי על גבי המכשיר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חיבור התקן תרבות האיברים למשאבות<ol>
<li>מניחים את המכשיר בתא שמבוקר טמפרטורה מחומם מראש (37 °C (37 °F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>חיבור זרימת גז<ol>
<li>חבר את מתאם הגז למכסה הכיסוי באמצעות מחט הקלט המתאימה.</li>
		<li>חבר את צינורות הקלט והפלט להתקן. הערה: חבר את הצד הפרוקסימלי של המעי הגס לאמבטיות הקלט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטהר את הלומן עם תשומות הגירוי.<ol>
<li>להזרים בעדינות גירוי זוהר דרך המעיים ולאמת זרימה בינונית בצינורות היציאה.</li>
		<li>לשטוף מדיום חיצוני.</li>
		<li>לשטוף את המדיום החיצוני 3 פעמים (להגדיר את המשאבות בקצב של 600 μL / min עבור קלט פלט היטב). כל שטיפה אורכת דקה אחת (החל מרוקן הבאר).</li>
	</ol>
</li>
	<li>תתחילו בניסוי.<ol>
<li>התחל את המשאבות בקצבים הבאים: קצב זרימה: לומן: קלט- 30 μL / h, פלט- 35 μL / h מדיום חיצוני: קלט- 1000 μL/h, פלט- 950 μL/h הערה: זמן הניסוי יכול להשתנות בין 30 דקות ל-24 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>סוף הניסוי (עד 24 שעות לתרבויות איברי המעי הגס)<ol>
<li>נתק את כל הצינורות מהמכשיר.</li>
		<li>נתק את הרקמות מן המחטים ולהמשיך לקריאות הרצויות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+in+vitro+and+ex+vivo+Models+to+Study+Host-Microbiome+Interactions+and+Acute+Stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors.</a> Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).</li>
<li>Hooper, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+commensal+host-microbial+relationships+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine.</a> Science. 291 (5505), 881-884 (2001).</li>
<li>Haller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-pathogenic+bacteria+elicit+a+differential+cytokine+response+by+intestinal+epithelial+cell%2Fleucocyte+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures.</a> Gut. 47 (1), 79-87 (2000).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease%3A+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).</li>
<li>Gazzaniga, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+Colon+Chip+Technology+to+Identify+Commensal+Bacteria+That+Promote+Host+Tolerance+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014(2021).</li>
<li>Yissachar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intestinal+Organ+Culture+System+Uncovers+a+Role+for+the+Nervous+System+in+Microbe-Immune+Crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk.</a> Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).</li>
<li>Duscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propionic+Acid+Shapes+the+Multiple+Sclerosis+Disease+Course+by+an+Immunomodulatory+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism.</a> Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).</li>
<li>Grosheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screen+Identifies+Host+and+Microbiota+Regulators+of+Intestinal+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function.</a> Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).</li>
<li>Blaize, J. F., Corbo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Dilutions+and+Plating%3A+Microbial+Enumeration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139 (3), 485-498 (2009).</li>
<li>Schnupf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+host+interaction+of+mouse+segmented+filamentous+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro.</a> Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Atarashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+Cell+Induction+by+Adhesion+of+Microbes+to+Intestinal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells.</a> Cell. 163 (2), 367-380 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאמר זה מתאר פרוטוקול ממוטב לתרבויות איברי המעיים ex vivo כי Yissachar ואח ' פיתחו לאחרונה(פורסם 9 נתונים שלא פורסמו). מערכת תרבית איברי המעיים תומכת בתרבית מולטיפלקסים של שברי מעיים שלמים תוך שמירה על זרימה זוהרת. הוא מספק שליטה מלאה על הסביבה הפנים-אור-זוהרת (כולל מינון גירוי, זמן חשיפה וקצב זרימה) ושומר על מבנה רקמת המעי הנאיבית והמורכבות התאית שלו9.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים את הפעולות הבאות. (1) ניתוח רקמות צריך להתבצע בזמן מ...

המעי הוא איבר מורכב ביותר המכיל מגוון רחב של סוגי תאים (תאי אפיתל, תאי מערכת החיסון, נוירונים ועוד) המאורגן במבנה מסוים המאפשר לתאים לקיים אינטראקציה ולתקשר זה עם זה ועם התוכן הלומינלי (מיקרוביוטה, מזון וכו '). 1.נכון לעכשיו, ארגז הכלים המחקרי הזמין לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה כולל תרביות תאים במבחנה ומודלים של בעלי חיים ב- vivo 2. מודלים של בעלי חיים ב-Vivo מספקים בניית רקמות פיזיולוגיות3, אך עם שליטה ניסיונית לקויה ויכולת מוגבלת לתפעל את תנאי הניסוי. במערכות תרבית במבחנה, לעומת זאת, להשתמש בתאים ראשוניים או קווי תאים שניתן להשלים עם חיידקים4, המציע שליטה הדוקה על הפרמטרים הניסוי אבל חסר את המורכבות התאית ואת ארכיטקטורת הרקמות. בדיקות במבחנה מודרניות מאפשרות שימוש מתקדם בדגימות רקמה אנושית בריאה ופתולוגית, כמו אורגנוידים אפיתל שמקורם בעכבר או ממקורות אנושיים5,6, ודגימות המחקות את המיקרו-סביבה הרירית7. דוגמה נוספת היא "המעיים על שבב" assay, הכולל את קו התא אפיתל המעי הגס האנושי (Caco2), מטריצה חוץ תאית וערוצים microfluidic לחקות את המצב הפיזיולוגי של invariantהמעיים 8. עם זאת, מתקדם וחדשני כמו דגימות במבחנה עשוי להיות, הם אינם שומרים על ארכיטקטורת רקמות נורמלית או הרכב תאי נאיבי.
כדי להתמודד עם זה, Yissachar ואח ' פיתחו לאחרונה מערכת תרבות איברים ex vivo 9 (איור 1) השומרת על שברי מעיים שלמים ex vivo,נהנה מהיתרונות של הן ב- vivo והן במודלים במבחנה. מערכת זו של תרבית איברי המעיים ex vivo מבוססת על התקן תרבות מותאם אישית התומך בתרבית מולטיפלקסים של שש רקמות המעי הגס, ומאפשר לבחון תשומות ניסיוניות בתנאים דומים תוך שליטה על התשומות והתפוקות של המערכת. עבודות אחרונות הוכיחו כי מערכת זו היא בעלת ערך לניתוח תגובות מעיים לחיידקי מעיים בודדים 9 ,דגימותמיקרוביוטה אנושיות שלמות10 ומטבוליטים מיקרוביאליים11. מערכת זו מאפשרת, לראשונה, לחקור את האינטראקציות המוקדמות בין המארח למיקרוביוטה עם רמה גבוהה של שליטה על הרכיבים המארחים, המיקרוביאליים והסביבתיים. יתר על כן, הוא מאפשר ניטור ומניפולציה של המערכת לאורך כל הניסוי, בזמן אמת.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62779/62779fig01.jpg"> איור 1: שרטוטים של מכשיר תרבות המעיים. שבר רקמת מעיים שלם מחובר ליציאות היציאה והקלט של התא (למעלה), עם משאבות המסדירות את הזרימה הבינונית בתוך הלומן ובתא הבינוני החיצוני. המכשיר כולו (התחתון) מכיל 6 תאים כאלה. נתון זה שונה מישאר ואח' 2017. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62779/62779fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td><חזק>מכשיר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 מד מחט קהה</td><td>Mcmaster</td><td>75165a754</td><td></td></tr><tr><td>22 מד מחט קהה</td><td>Mcmaster</td><td>75165a758</td><td></td></tr><tr><td>דבק לכל מטרה סלנט 100% סיליקון</td><td>DAP</td><td>688</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ואקום מעוקב VDC-21+ 2 מדפים</td><td></td><td>AAAD4021</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופית 1 מ"מ עבה</td><td>קורנינג</td><td>2947-75X50</td><td></td></tr><tr><td>מיני אינקובטור im-10</td><td></td><td>AAH24315K</td><td></td></tr><tr><td>MPC 301E משאבת</td><td></td> ואקום <td>VI-412711</td><td></td></tr><tr><td>פלסטיק מהיר סיבוב צינור צימוד תקעים</td><td>Mcmaster</td><td>51525K121</td><td></td></tr><tr><td>פלסטיק מהיר סיבוב צינור צימוד שקעים</td><td>Mcmaster</td><td>52525k211</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 סיליקון אלסטומר</td><td>Dow</td><td></td><td>פולידימתילסילוקסן, צינורות PDMS</td></tr><tr><td></td><td>מקמאסטר</td><td>6516t11</td><td></td></tr><tr><td>Zortrax M200</td><td>Zortrax</td><td></td><td>Z-SUITE, Autodesk Fusion 360</td></tr><tr><td>Zortrax M200 חומרים: z-ultrat</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr> <tr><td><חזק>בינוני</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27 (50x), תרמו</td><td>פישר סיינטיפיק</td> <td>ללא סרום</td><td></td>17504044</tr><tr><td>HEPES Buffer (1M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>המדיום של Dulbecco המעובד של Iscove עם פנול אדום (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Knock-Out Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1370701</td><td></td></tr><tr><td>Non חומצת אמינו חיונית (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td><כלים כירורגיים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים גדולים</td><td>Aseltech</td><td>11-00-10</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים חדים</td><td>FST</td><td>11297-10</td><td></td></tr><tr><td>חוט כירורגי קלוע משי</td><td>SMI</td><td>8010G</td><td></td></tr><tr><td>מספריים ישרים</td><td>FST</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים דקים</td><td>FST</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td><מערכת איברים חזקה>חזקה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 ומיקרו; m</td><td>גן</td><td></td><td></td>חיי מסנן</tr><tr><td>0.22 ומיקרו; m מסנן</td><td>חיים גן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק מנעול לואר</td><td>B-D</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו Greenough</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>מחמם אוויר מדויק מחזור "CUBE"</td><td>CUBE-2-LIS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>משאבת מזרק</td><td>מערכות משאבות עידן חדש בע"מ</td><td>nep-ne-1600-em</td><td></td></tr></tbody></table>

מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

המבנה של רקמת המעי מאפשר אינטראקציות קרובות והדדיות בין הפונדקאי למיקרוביוטה במעיים. שיחות צולבות אלה חיוניות לשמירה על הומאוסטזיס מקומי ומערכתי; שינויים בהרכב המיקרוביוטה במעיים (דיסביוזיס) מקשרים למגוון רחב של מחלות אנושיות. שיטות לנתח אינטראקציות בין מארח למיקרוביוטה מקיפות החלפה אינהרנטית בין שימור מבנה הרקמה הפיזיולוגית (בעת שימוש במודלים של בעלי חיים של vivo) לבין רמת השליטה על גורמי הניסוי (כמו במערכות פשוטות בתרבית תאי חוץ גופיה). כדי לטפל בהחלפה זו, Yissachar ואח ' פיתחו לאחרונה מערכת תרבית איברי מעיים. המערכת משמרת בניית רקמת המעי הגס הנאיבית ומנגנונים תאיים והיא גם מאפשרת שליטה ניסיונית הדוקה, ומאפשרת ניסויים שלא ניתן לבצע בקלות ב- vivo. זה אופטימלי לנתח תגובות לטווח קצר של רכיבי מעיים שונים (כגון אפיתל, אלמנטים אימונולוגיים ונוירולוגיים) כדי הפרעות זוהר (כולל חיידקים אנאירוביים או אירוביים, דגימות מיקרוביוטה שלמות מעכברים או בני אדם, תרופות ומטבוליטים). כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של פרוטוקול ממוטב לתרבות איברים של שברי מעיים מרובים באמצעות מכשיר תרבות מעיים מותאם אישית. תגובות מארחות להפרעות זוהרות יכולות להיות חזותיות על ידי כתמים אימונופלואורסצנטיים של מקטעי רקמות או שברי רקמות של הר שלם, הכלאה פלואורסצנטית במקום (FISH), או הדמיה לשגות זמן. מערכת זו תומכת במגוון רחב של קריאות, כולל רצף הדור הבא, ציטומטריית זרימה וביקורים תאיים וביוכימיים שונים. בסך הכל, מערכת תרבית איברים תלת ממדית זו תומכת בתרבות של רקמות מעיים גדולות ושלמות ויש לה יישומים רחבים לניתוח ברזולוציה גבוהה והדמיה של אינטראקציות בין מארח למיקרוביוטה בסביבת המעיים המקומית.

מערכת תרבית איברי המעיים שומרת על כדאיות רקמות ex vivo. הערכת הכדאיות של הרקמה נעשתה לאורך כל תקופת התרבות. שברי רקמת המעי הגס דוגרו במערכת תרבית איברי המעיים ותוקנו בעקבות תרבית 2/12/24 h. שלמות שכבת תאי האפיתל במעיים (IEC) אומתה על ידי כתמי אימונופלואורסצנטיות באמצעות נוגדנים E-cadherin ו- ציטוקרטין-18. כמו כן, זוהו תאי גביע מלאים בריר באפיתל המעי הגס ובהפרשת ריר בתוך הלומן, כמו גם התפשטות חברת החשמל בקריפטות המעי הגס, כפי שצוין על ידי כתמי Ki-67(איור 2). תוצאות אלה ואחרים<sup cl...

מאמר זה מציג שיטה ייחודית לניתוח אינטראקציות בין מארח למיקרוביום באמצעות מערכת תרבית איברי מעיים חדשנית לניסויים ex vivo.

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

מערכת תרבית איברי המעיים משלבת את היתרונות של במבחנה ובבייסות ויוו ובכך משמשת כצעד ניסיוני ביניים בין ניסיון במבחנה פשוטה לניסויים מורכבים ב- vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השילוב של שליטה ניסיונית הדוקה עם שימור פיזיולוגיה של המעי. שיטה זו מספקת תובנה לניתוח תגובות מעיים לגירוי ספציפי עם רמה גבוהה של שליטה על הרכיבים המארחים, המיקרוביאליים והסביבה.מי שיוכיחו את ההליך יהיו אלון שמש, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, וד"ר סיון עמידור, מנהלת המעבדה שלנו. כדי להתחיל, להכניס את המחטים קהה-end למיקום המתאים בתוך תבנית המכשיר ולהטיל כ 20 גרם של תערובת polydimethylsilsiloxane או PDMS, עבור קבוצה אחת של המכשיר ואת המכסה. מניחים את התבניות בתא ואקום במשך 30 דקות כדי להסיר בועות אוויר מתערובת PDMS, ולאחר מכן לדגור על התבניות ב 55 מעלות צלזיוס לילה כדי להשלים פילמור PDMS.כאשר PDMS מוגדר, לשלוף את המחטים מן התבנית בזהירות לשחרר את מכשיר התרבות ואת המכסה מן תבניות פלסטיק. הסר שאריות PDMS מקווי המתאר של הבאר באמצעות להב כירורגי. חבר את התקן PDMS ואת המכשיר לכסות על כיסוי של 75 על 50 ממ microslides באמצעות דבק סיליקון רעיל ולהשאיר את החלקים להגדיר לילה.יש למרוח את ההדבקה על הצד החלק של ההתקן. הכנס 12, 22 מחטי מד עבור לומן ו 12, 18 מחטים מד עבור הבאר. תקן את כל המחטים במקום באמצעות סיליקון ולתת לו להגדיר בן לילה.לטהר את מזרקי הקלט ולוודא כי בינוני היטב זורם מכל הצינורות לתוך פסולת, ולאחר מכן לטהר את מזרקי הקלט ולוודא כי גירויים לזרום מכל הצינורות לתוך פסולת, דואג לא לזהם את גירויים שונים. לאחר הקרבת העכבר, השתמש במספריים חדים ומלקחיים כדי לנתח אותו ולהוציא את מערכת העיכול מהבטן לפי הטבעת, על ידי חיתוך כל רקמות השומן והחיבור. חותכים את המעי הגס ומניחים אותו על צלחת חדשה.יש למזער את המגע תוך החזקת הרקמה בעדינות ורק בקצוות. בצע את ריקון המעי הגס תחת מיקרוסקופ ניתוח. יש לשטוף בעדינות את תוכן המעי הגס עם IMDM סטרילי עם מזרק מוכן של 10 מיליליטר כמתואר בטקסט.לאחר הסרת הצואה מרקמת המעי, מניחים את המעי הגס בצלחת חדשה של ששת בארות מלאות ב-0.5 מיליליטר של IMDM סטרילי. לאחר מכן, לקחת את רקמת המעי הגס בזהירות לחבר אותו מחט 22 מד, מה שהופך את עניבה הדוקה עם שני החוטים. שמור על הכיוון הנכון של המעי הגס לזרימת הלומן, כך הפרוקסימלי ודיסטלי שווה לקלט ולפלט, בהתאמה.חזור על שטיפה במעי הגס וצמיגי מחט לכל הרקמות. חבר את צינורות הקלט והפלט למכשיר, ולאחר מכן התחל את הניסוי על ידי הפעלת המשאבות בקצב הרצוי. תאי גביע מלאים ריר באפיתל המעי הגס והפרשת ריר בתוך הלומן זוהו, כמו גם התפשטות חברת החשמל בקריפטות המעי הגס, כפי שצוין על ידי מכתים KI67.תוצאות אלה הראו כי מערכת תרבית המעיים שומרת על תפקוד המעיים ומבנה ex-vivo. לאחר שעתיים של חיידקים חוטיים מקוטעים, או SFB, מבוא, חוטי SFB טיפוסיים זוהו בקשר הדוק עם villi המעי הדק באמצעות פלואורסצנטיות בהכלאה במקום. בנוסף, מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור הציגה SFB בתוך כמה מיקרונים של גבול מברשת אפיתל המעי הדק.פרופילי ביטוי גנים של דגימות רקמה שלמה יוצרו טריפליקאט שעתיים לאחר עירוי עם SFB. תרביות בקרה הוחדרו עם השעיות צואתיות של עכברים ללא חיידקים או Bacteroides שבירים מונוקולוניים. שינויים אלה ששוכנעו על ידי SFB היו בעיקר של משרעת קטנה בהשוואה לשליטה ללא חיידקים.הכיוון של המעי הגס חשוב מאוד. יש להצטרר בעת סגירת המעי הגס על המחט. עניבה נכונה תמנע את זיהום הבאר עם תכולת הלומן.מגוון רחב של טכניקות קריאה יכול לעקוב אחר פרוטוקול זה, כגון רצף הדור הבא, הדמיה, מיון תאים ועוד רבים אחרים. קריאות אלה מספקות תובנה חדשנית על אינטראקציות מיקרוביום מארחות בבריאות ובמחלות.

an-intestinal-gut-organ-culture-system-for-analyzing-host-microbiota

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: קלטאיוד ארויו, מ., ואחרים. הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקים סינתטי בממשק המארח-מיקרוב המעי במבחנה. J. Vis. Exp. (2018).סרטון זה מדגים מודל של מארח-מיקרוב במעי במבחנה לחקר חיוניות חיידקים. קו-קולטורה של תאי Caco-2 ו-HT29-MTX מדוגרת עם חיידקים שעברו טיפול מוקדם בתנאי עיכול מדומים. שלמות מחסום האפיתל מוערכת באמצעות התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית, וחלקים מהתווך, הריר הממס, הליזאט התא ושאריות התא נאספים לניתוח במורד הזרם.

מודל המעי במבחנה להערכת הידבקות ואינטרנליזציה של חיידקים

בסרטון זה, אנו מתארים את המתודולוגיה להקמת מערכת תרבית איברי מעיים ex vivo כדי לחקור את יחסי הגומלין בין מקטעי רקמת מעיים של עכבר לבין חיידקי מעיים ספציפיים. המכשיר מורכב משני זוגות של יציאות קלט-פלט, הראשון מחבר את לומן רקמת המעי ומספק את המתלה החיידקי הספציפי לתוכו, והשני מספק ברציפות מדיה לבארות המכשיר כדי לשמור על כדאיות רקמת ex vivo.

מערכת תרבית איברי מעיים Ex Vivo לחקר אינטראקציות מיקרוביוטה מארחת

אנו מתארים פרוטוקול במבחנה Microbiome במעיים שיתוף תרבות villi מעיים במשך תקופה ארוכה באמצעות אדם בטן-על-שבב מערכת microphysiological.

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

תרבית האיברים ex vivo מאפשרת חקירה של תהליכים ביולוגיים בהקשר של ארכיטקטורת הרקמה השלמה. כאן, אנו מציגים שיטה של תרבית ex vivo של המעי הגס של העכבר, שניתן להשתמש בה כדי לחקור חסינות מולדת והגנה אנטי-מיקרוביאלית של המארח במעי.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; קולון איברי תרבות השימוש בו מארח אנטימיקרוביים ללימודי ביטחון

אינטראקציות מארח-חיידק מעיים היו העריכו באמצעות גישה מוזרה שילוב קהילה אוראלי סינתטי במבחנה במערכת העיכול עיכול, דגם של האפיתל המעי הדק. אנו מציגים שיטה שבה ניתן להתאים כדי להעריך את התא הפלישה של גורמי מחלה, biofilms מינים רב, או אפילו כדי לבדוק את השרידות של פרוביוטיקה ניסוחים.

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור culturing microbiota את הבטן של המעי הגס במבחנה, באמצעות סדרה של ריאקטורים שמדמות את התנאים הפיזיולוגיים של דרכי עיכול.

מתקדמים במבחנה Culturing טכנולוגיה ללמוד את Microbiota בטן האדם

פרוטוקול זה מתאר את מערכת התסיסה התרבותית של תרבות האצווה האנושית של מיקרוביוטה בצואה, באמצעות אינולין (באופן מוכר, ואחד מהמיקרוביוטה הנפוצים ביותר) כדי להדגים את השימוש במערכת זו בהערכת השפעות ספציפיות התערבויות על הרכב microbiota צואה ופעילויות מטבולית.

באצווה מחוץ לגופית-מודל תרבות להעריך את ההשפעות של משטרי התערבותית על האדם מיקרוביוטה בצואה

המתואר כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת.

ניתוח אינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה של האדם באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט

פרוטוקול יעיל זה מפרט זרימת עבודה לזיהוי ותמונה של חיידקים בדגימות רקמות מורכבות, החל מתיקון הרקמה ועד להכתמת חיידקים עם פלואורסצנטיות בהכלאה במקום .

הדמיה של אינטראקציות מארחות מיקרוביוטה במעיים באמצעות פלואורסצנטיות בהכלאה במקום , כתמי לטין והדמיה

הפרוטוקול המפורט שלנו מתאר את היצירה והשימוש במודל מעי על שבב מתקדם, המדמה רירית מעיים אנושית עם מבנים תלת-ממדיים וסוגי תאים שונים, ומאפשר ניתוח מעמיק של תגובות חיסוניות ותפקודים תאיים בתגובה להתיישבות מיקרוביאלית.

מודל מעי-על-שבב חיסוני לניתוח תגובות חיסוניות של רירית המעי

המחקר מציג שיטה לחקר זיהום חיידקי במבחנה באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם בתאי גזע ברקמה. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל ולהבחין בין אורגנידים בשני ממדים, להדביק אותם ב-Escherichia coli פולשנית דבקה, ולהעריך קריאות מפתח, כולל פריצת מחסום אפיתליאלי, הדמיית זיהומים ותגובת RNA אפיתליאלית.

תרבית אורגנית דו-ממדית על תמצית פולשת או ממברנת בסיס לחקר אינטראקציות בין מארח לחיידקים

למדו מערכת תרבית איברי מעיים חדשנית לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה בשיטת PDMS. שיטה זו משלבת שליטה ניסויית הדוקה עם שימור הפיזיולוגיה המעייתית לחקר תגובות מעיים לגירויים ספציפיים.

מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה

גלה סרטונים נוספים