Name: ניתוח של שינוי גורם גדילה ß מוצרי מחשוף משפחתי מופרש לתוך Blastocoele של קסנופוס laevis עוברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: חקור ניתוח מוצרי חיתוך של חלבוני TGF-beta בבלסטוצל עוברי Xenopus laevis. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר ויעיל של חלבונים לניתוח immunoblot וחקר דינמיקת חלבונים בהתפתחות עוברית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למרי סנצ'ז על טיפול מעולה בבעלי חיים. המחקר של המחברים נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH / NICHD) מעניק R01HD067473-08 ו R21 HD102668-01 ועל ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK / NIH) מענק R01DK128068-01.

<ol><li>Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prodomains+regulate+the+synthesis%2C+extracellular+localisation+and+activity+of+TGF-beta+superfamily+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands.</a> Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).</li>
<li>Gray, A. M., Mason, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+activin+A+and+transforming+growth+factor--beta+1+pro-regions+in+homodimer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly.</a> Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).</li>
<li>Constam, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TGFbeta+and+related+signals+by+precursor+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).</li>
<li>Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+activation+of+pro-activin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structure and activation of pro-activin A.</a> Nature Communications. 7, 12052(2016).</li>
<li>Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prodomain-growth+factor+swapping+in+the+structure+of+pro-TGF-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+and+signaling+range+of+mature+BMP-4+is+regulated+by+sequential+cleavage+at+two+sites+within+the+prodomain+of+the+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor.</a> Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).</li>
<li>Goldman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+an+upstream+cleavage+site+in+the+BMP4+prodomain+leads+to+tissue-specific+loss+of+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity.</a> Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).</li>
<li>Le Good, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+stability+determines+signaling+range%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Nodal stability determines signaling range.</a> Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).</li>
<li>Tilak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+rather+than+ordered+cleavage+of+two+sites+within+the+BMP4+prodomain+leads+to+loss+of+ligand+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice.</a> Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).</li>
<li>Neugebauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prodomain+of+BMP4+is+necessary+and+sufficient+to+generate+stable+BMP4%2F7+heterodimers+with+enhanced+bioactivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).</li>
<li>Robertson, I. B., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Bioavailability+of+TGF-beta+and+TGF-beta-Related+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDF6-CD99+Signaling+Regulates+Src+and+Ewing+Sarcoma+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth.</a> Cell Reports. 33, 108332(2020).</li>
<li>Nelsen, S. M., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+cleavage+of+BMP4+by+furin%2C+PC6%2C+and+PC7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).</li>
<li>Birsoy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPACE4+is+a+localized+pro-protein+convertase+required+for+mesoderm+induction+and+the+cleavage+of+specific+TGFbeta+proteins+in+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development.</a> Development. 132 (3), 591-602 (2005).</li>
<li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).</li>
<li>Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proprotein+convertase+genes+in+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Proprotein convertase genes in Xenopus development.</a> Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).</li>
<li>Constam, D. B., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+bone+morphogenetic+protein+activity+by+pro+domains+and+proprotein+convertases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases.</a> Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).</li>
<li>Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+bone+morphogenetic+protein-4+activity+by+sequence+elements+within+the+prodomain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).</li>
<li>Sopory, S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSopory%2C+S+%22Analysis+of+Growth+Factor+Signaling+in+Embryos%22">Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos</a>. Whitman, M. A., Whitman, S. , CRC Press LLC. 38-55 (2006).</li>
<li>Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+Activation+of+Bmps%3A+Analysis+of+Cleavage+in+Xenopus+Oocytes+and+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).</li>
<li>Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavages+within+the+prodomain+direct+intracellular+trafficking+and+degradation+of+mature+bone+morphogenetic+protein-4%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

היתרונות העיקריים לפרוטוקול המתואר כאן הם שניתן להשלים אותו במהירות יחסית, אינו דורש ריאגנטים יקרים ומספק מקור למוצרי מחשוף Tgfß מרוכזים בתנאים פיזיולוגיים. יתרון נוסף הוא שהוא מאפשר לנתח חלבונים מתויגים אפיטופ ובכך לעקוף את המחסור בנוגדנים זמינים מסחרית המזהים את רוב הפרודומיין המשפחתי Tgfß. למרות שניתן גם לנתח את המחשוף של חלבוני Tgfß מבשר מתויגים אפיטופה בתאי יונקים מתורבתים, ישנם מספר יתרונות לשימוש X. laevis. מוקדם X. laevis עוברים לבטא את כל ארבעת בני משפחת PC כי הם מועמדים עבור Tgfß convertases א...

חברי פקטור הגדילה המשתנה ß (Tgfß) הם מסונתזים כחלבונים מבשרים לא פעילים, מעומעמים. המבשרים אז הם בקע על ידי בני משפחת פרופרוטאין convertase (PC), או בתוך מסלול הפרשה או מחוץ לתאים. זה יוצר דימר ליגנד פעיל, מלוכד דיסולפיד ושני שברי פרודומיין1. למרות שזה ידוע כבר למעלה מ -30 שנה כי הפרודומיין של מבשרי משפחת Tgfß נדרש לייצר ליגנד פעיל2, ההבנה כיצד פרודומיין לתרום לתפקוד ליגנד אינה שלמה.
למרות שההבנה של תהליך ההפעלה הפרוטאוליטית של בני משפחת Tgfß נותרה לא שלמה, יש עניין גובר להבין אילו מוטיבים של קונצנזוס PC מקושטים ב- vivo, אם המחשוף מתרחש בתא תת-תאי או חוץ תאי ספציפי, והאם הפרודומיין נשאר קשור באופן קוולנטי או לא צייתני עם ligand3. מספר מחקרים הראו כי הפרודומיין לא רק מנחה את קיפול ליגנד לפני המחשוף4,5, אלא גם יכול להשפיע על יציבות גורם הצמיחה וטווח הפעולה6,7,8,9, מניעים את היווצרותם של הומודימרים או הטרודימרים10, לעגן את הליגנד במטריצה החוץ-תאית כדי לשמור על חביון ליגנד11, ובמקרים מסוימים, לתפקד כליגנד בזכות עצמו להפעיל הטרולוגית איתות12. מוטציות נקודת הטרוזיגוס בתוך הפרודומיין של חברים רבים במשפחת Tgfß קשורות לעין, עצם, כליות, שלד או פגמים אחרים בבני אדם3. ממצאים אלה מדגישים את התפקיד הקריטי של הפרודומיין ביצירת ותחזוקה של ליגנד פעיל ומדגישים את החשיבות של זיהוי ופענוח התפקיד של מוצרי מחשוף שפותחו במהלך ההבשלה הפרוטאוליטית של מבשרי משפחת Tgfß.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור שאיפה מוצרי מחשוף שנוצרו במהלך ההתבגרות של מבשרי משפחת Tgfß מן blastocoele של X. laevis עוברים ולאחר מכן ניתוח אותם על חיסונים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע אם אחד או יותר PC קונצנזוס מוטיבים בחלבון הקדמה הם חבולים vivo10,13, לזהות את המחשבים האנדוגניים כי לבקע כל מוטיב13,14, להשוות היווצרות vivo של הומודימרים משפחתיים Tgfß לעומת heterodimers10 או לנתח אם מוטציות נקודה הקשורות למחלות אנושיות ב- Tgfß מבשרי להשפיע על יכולתם ליצור ליגנדים דימרי פונקציונלי.

<table><tbody><tr><td>&szlig;-מרקפטואתנול</td><td>פישר</td><td>AC125470100</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול בלו</td><td>פישר</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>פישר</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>סידן חנקתי</td><td>פישר</td><td>C109-500</td><td></td></tr><tr><td>חד פעמי גלולה עלי/מטחנת רקמות</td><td>פישר</td><td>12-141-364</td><td></td></tr><tr><td>דומונט #5 מלקחיים</td><td>Fine Science tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>אטלנטה ביולוגי</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית, 1 X 90 מ"מ</td><td>Narshige</td><td>G-1</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Fisher</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>כוריוני אנושי מזרק הזרקת גונדוטרופין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>CG10-10VL</td><td></td></tr><tr><td>, 1 מ"ל</td><td>פישר</td><td>8881501368</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>מחט מגנזיום גופרתי</td><td>פישר</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>, 26 גרם</td><td>פישר</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>ג'יבקו</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Picoliter Microinjector</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>חולץ פיפטות</td><td>Narashige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>PVDF ממברנה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>פישר</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>פישר</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין-S</td><td>פנטאייר</td><td>TRS5</td><td></td></tr><tr><td>טריס</td><td>פישר</td><td>BP152-5</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של שינוי גורם גדילה ß מוצרי מחשוף משפחתי מופרש לתוך blastocoele של קסנופוס laevis עוברים

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

שתי הזרועות של הליבנדים של גורם גדילה משתנה (Tgfß), המיוצגות על ידי ליגנדים של חלבון מורפוגנטי של Tgfß/Nodal או Bone morphogenetic (Bmp), בהתאמה, ממלאות תפקידים חיוניים בהתפתחות העוברית ובהומאוסטזיס למבוגרים. בני משפחת Tgfß נעשים כמבשרים לא פעילים המעמעמים ומקפלים בתוך הרטיקולום האנדופלסמי. המבשר נצמד לאחר מכן לרסיסי ליגנד ופרודומיין. למרות שרק ליגנד דימריק יכול לעסוק קולטני Tgfß ולהפעיל איתות במורד הזרם, יש הכרה גוברת כי moiety פרודומיין תורם לפעילות ליגנד. מאמר זה מתאר פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לזהות מוצרי מחשוף שנוצרו במהלך ההפעלה של חלבונים מבשר Tgfß. מבשרי Tgfß של קידוד RNA הם הראשונים microinjected לתוך X. laevis עוברים. למחרת, מוצרי מחשוף נאספים מן blastocoele של עוברי שלב gastrula וניתחו על כתמים מערביים. פרוטוקול זה יכול להסתיים במהירות יחסית, אינו דורש ריאגנטים יקרים ומספק מקור של מוצרי מחשוף Tgfß מרוכזים בתנאים פיזיולוגיים.

מטרת הניסוי המתוארת להלן הייתה לקבוע אם Bmp4 ו- Bmp7 יוצרים הטרודימרים (עמעום המורכב מליגנד Bmp4 אחד וליגנד Bmp7 אחד), הומודימרים (המורכבים משני ליגנדים Bmp4 או שני Bmp7), או תערובת של כל אחד מהם כאשר הם באים לידי ביטוי ב- X. laevis. נתונים המוצגים באיור 2 מופקים ממחקר שפורסם בעבר10. איור 2A הוא סכמטי המציג מוצרי מחשוף שנוצרו על ידי התבגרות פרוטאוליטית של מבשרים הומודימריים Bmp4 או Bmp7 או מבשרים הטרודימריים Bmp4/7. Bmp4 הוא מקופ...

כאשר שינוי גורם גדילה ß חלבונים מבשר המשפחה באים לידי ביטוי חוץ רחמי בעוברים קסנופוס laevis, הם עמעם, לקבל מבקעים ומופרשים לתוך blastocoele, אשר מתחיל בפיצוץ מאוחר לשלב gastrula מוקדם. אנו מתארים שיטה לשאיפה של מוצרי מחשוף מחלל הפיצוץ לניתוח אימונובלוט.

ניתוח של שינוי גורם גדילה ß מוצרי מחשוף משפחתי מופרש לתוך Blastocoele של קסנופוס laevis עוברים

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את התהליך שבו מגוון רחב יותר של חלבונים מבשר מופרדים, כולל בני משפחה TGF-beta, מומרים לחלבונים פעילים בעקבות מחשוף פרוטאוליטי. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מספק שיטות מהירות וזולות מאוד כדי להשיג מוצר מחשוף TGF-בטא מרוכז מאוד ב vivo במצב חזותי. ראשית, לאחר ההזרקה ביום שלמחרת, להסיר פתרון Ficoll וכל עוברים מתים או גוססים, ולאחר מכן לשטוף את העוברים פעם או פעמיים עם MBS ותרבות העוברים ב- MBS על הספסל בטמפרטורת החדר או ב 16 מעלות צלזיוס באינקובטור כדי להאט את ההתפתחות.מחממים ומושכים את נימי הזכוכית לנקודה עדינה באמצעות פולר מיקרופיפט עם ההגדרות הרצויות. באמצעות מלקחיים, קליפ את קצה מחט משך. כדי למנוע סתימה, פתיחת מחט השאיפה blastocele צריך להיות גדול יותר מחט microinjection.הכנס את מחט השאיפה למחזיק המחט המחובר למיקרו-מנג'ר וחבר את מחזיק המחט למיקרו-מניפולטור. מניחים עוברים בשלבי גסטרולה מוקדמים עד בינוניים במגש הזרקה או צלחת ממולאים ב- MBS. הכנס את המחט מתחת לפני השטח של העובר ליד עמוד החיות.לחץ על כפתור המילוי על המיקרו-נג'ר תוך התבוננות במחט ובעובר באמצעות מיקרוסקופ ניתוח. במשך כמה שניות, רמת הנוזל הצלול עולה במחט והעובר מתמוטט והופך קרוט. פעימה את כפתור ההזרקה פעם אחת או יותר כדי להוציא כל חומר לבן מעונן שנכנס למחט המכילה פסולת או פרוטאזים.כדי לזהות את מוצרי המחשוף על חיסונים, לשאוף את נוזל blastocele של 10 עד 20 עוברים או יותר בהתאם לנוגדן. פיפטה מיקרוליטר אחד של מים ללא גרעין על חתיכת פרפין שהונחה על מגש ההזרקה. תטביעו את המחט בטיפת המים ולחצו על כפתור ההזרקה כדי להפיג את נוזל הבלסטוזל למים.לחלופין, כדי להוציא את הנוזל ישירות על parafilm ולמנוע ממנו לשטח החוצה, דופק את כפתור ההזרקה כדי לגרש את הנוזל תחת לחץ נמוך יותר. מעבירים את נוזל הבלסטוצל שנקטף לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי על קרח ומוסיפים מים ללא גרעין כדי להתאים את הנפח הסופי ל-30 מיקרוליטרים. כדי לזהות חלבונים מבשר TGF-beta, להעביר את נוזל blastocele מדולדל עוברים לצינור נפרד על קרח.הסר MBS עודף ולהוסיף 200 microliters של חוצץ lysate עובר צונן מראש. כדי להומוגניזציה מלאה של העוברים, פיפטה למעלה ולמטה 10 עד 20 פעמים עד שלא יישארו גושים. צנטריפוגות העוברים הומוגניים במיקרוצנטריפוגה בקירור ב 10, 000 פעמים G במשך 10 דקות, ולאחר מכן להסיר 160 microliters של supernatant באמצעות פיפטה P200 ולהעביר צינור חדש על קרח, נזהר כדי למנוע את חלבוני החלמון הלבן ופסולת תאית אחרת במחצית התחתונה של הצינור.חזור על המיקרו-צנטריפוגה פעם אחת והעבר 128 מיקרוליטרים של הסופר-נט-נט הצלול לצינור חדש על הקרח. בשלב זה, עובר נקי lysates ואת נוזל blastocele שנאסף ניתן לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס כל עוד תרצה. Deglycosylate החלבונים המבקעים הקיימים בנוזל blastocele שונה דרך רשת טרנס-Golgi עם PNGase F על ידי ביצוע הוראות היצרן.המוצרים deglycosylated היה נודד כמו להקה מרוכזת יותר על ג'לים SDS, אשר יכול לסייע בזיהוי מדויק. כדי להעריך את מונומרים שבר פרודומיין וחלבונים נפתחים blastocele ו lysate, לנתח את החלבונים בתנאים מופחתים על ידי הוספת חמישה microliters של הפחתת 4X חוצץ מדגם ל 15 מיקרוליטרים בנוזל blastocele ו 15 microliters של ליסאט עובר מובהר. כדי להעריך את היווצרותם של ליגנדים הומודימריים או הטרודימריים מאופקים ב- blastocele, לנתח את החלבונים בתנאים שאינם מצמצמים על ידי הוספת חמישה מיקרוליטרים של חיץ מדגם 4X שאינו מפחית ל -15 המיקרוליטרים הנותרים של נוזל הבלסטוצ'ל, ואז לחמם אותו במשך חמש דקות ולהניח אותו על קרח.לאחר שימוש בפרוטוקול זה, החלבונים הופרדו על ידי SDS-PAGE והחיסון נבדק עם נוגדנים שזיהו את תג האפיטופ של מיק. בתנאים המצטמצמים, בlysates מעוברים מבטאים רק Bmp4 או Bmp7, להקה אחת המתאימה מונומרים Bmp4 מבקע ולהקה נודדת איטית יותר המתאימה מונומרים Bmp7 שנבקעו זוהו. שתי הלהקות התגלו בעוברים המביעים את Bmp4 ו-Bmp7.כאשר החלבונים הופרדו בתנאים שאינם מצמצמים, הלהקה ההטרודימרית הבוגרת היחידה של Bmp4 ו-7 של ניידות ביניים התגלתה יחד עם כמות זעירה של הומודימר Bmp4 בעוברים המבטאים במשותף את Bmp4 ו- Bmp7. היווצרות הטרודימר Bmp4 ו- Bmp7 נצפתה גם כאשר רמות החלבון Bmp7 היו גבוהות. עם זאת, במקרה זה, עודף Bmp7 יצר homodimers ועוברים שיתוף ביטא Bmp4 ו Bmp7.תוצאות אלה הראו כי Bmp4 ו 7 מעדיפים ליצור הטרודימרים כאשר התבטאו במשותף בעוברים קסנופוס laevis. בניסוי זה, איסוף blastocele טהור הוא הצעד החשוב ביותר אשר דורש ניסיון טיפול מחט מדויק. אז פשוט תמשיך לנסות ולתקן שגיאות.הליך זה בודק אם הטרודימרים BMP טופס אילו חומצות אמינו חשובות לכך. השלב הבא, עכבר knockin יכול להיווצר לשאול אם חומצות אמינו אלה חשובים מבחינה תפקודית במהלך התפתחות היונקים.

analysis-transforming-growth-factor-family-cleavage-products-secreted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

האאקטודרם Xenopus עובריים הפך מודל אטרקטיבי עבור מחקרים של הקוטביות בתא. Assay מתואר, שבה חלוקת subcellular של חלבוני ניאון נבחנת בתאים האאקטודרם. פרוטוקול זה יעזור כתובת לשאלות הקשורות שליטה מרחבית של איתות.

טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt

גורלו של תא עוברי אדם יכול להיות מושפע על ידי מולקולות ירושה ו / או על ידי אותות מתאים שכנים. ניצול מפות גורלו של עובר Xenopus שלב המחשוף, לסטומרים בודדים ניתן לזהות לתרבות בבידוד כדי להעריך את התרומה של מולקולות ירושה לעומת אינטראקציות תא סלולרי.

Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

כתב היד כאן מספקת מערכת פשוטה של שיטות לניתוח ההפרשה ודיפוזיה של ligands מתויג fluorescently ב Xenopus. זה מספק הקשר לבדיקת היכולת של חלבונים אחרים לשנות הפצת יגנד ומאפשר ניסויים שעשויות לתת תובנה מנגנוני ויסות הדרגתיים מורפוגן.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

על ידי השתלת חרוזים ספוגים בגורמי גדילה או מעכבים ספציפיים של מסלולי איתות לעוברים מתפתחים, ניתן לבדוק ישירות את השפעותיהם in vivo. בפרוטוקול זה מושתלים חרוזים בניצן הגפה כדי לקבוע את ההשפעות של מולקולות אלו על ביטוי גנים והעברת אותות.

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

תאי ענק טרופובלסט (TGCs) ממלאים תפקיד מפתח בשליה כדי להבטיח הריון בריא. אנו מציגים פרוטוקול להערכת מצב השעתוק של גנים ב-TGCs על ידי הכלאה פלואורסצנטית מתפתחת באתרה על קטעי קריוסטט של עוברים לאחר השרשה או תרביות לטווח קצר של קונוסים חיצוניים עובריים ביום 7.

ניתוח תעתיק ידי ינוקא RNA FISH של<em&gt; In vivo</em&gt; תאים ענקים Trophoblast או<em&gt; במבחנה</em&gt; לטווח קצר תרבויות של Ectoplacental Cone Explants

פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

explants blastoderm דגי זברה נוצרים על ידי בידוד תאים עובריים ממרכזי איתות אנדוגני בתוך העובר המוקדם, ומייצרים אשכולות תאים נאיביים יחסית מניפולציה בקלות ו ex vivoתרבית . מאמר זה מספק הוראות להכנת explants כאלה ומדגים את התועלת שלהם על ידי חקירת תפקידים עבור נודל איתות במהלך gastrulation.

דור של מסלקי בלסטודרם נאיביים מעוברי דגי זברה

פרוטוקול המתאר את היווצרותם של בלסטואידים אנושיים היוצרים ביעילות, בזמן וברצף תאים דמויי בלסטוציסט.

פרוטוקול עבור בלסטואידים אנושיים מידול בלסטוציסט פיתוח והשתלה של בלסטוציסטים

כאן אנו מתארים אפיון פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסות של שושלות תאים עם גורלות רקמות ידועים בעובר בעל חוליות Xenopus laevis .

ספקטרומטריית מסה מונחית שושלת תאים פרוטאומיקה בעובר המתפתח (צפרדע)

חקור ניתוח מוצרי חיתוך של חלבוני TGF-beta בבלסטוצל עוברי Xenopus laevis. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר ויעיל של חלבונים לניתוח immunoblot וחקר דינמיקת חלבונים בהתפתחות עוברית.

ניתוח של שינוי גורם גדילה ß מוצרי מחשוף משפחתי מופרש לתוך Blastocoele של קסנופוס laevis עוברים

גלה סרטונים נוספים