Name: ניתוח כיח מבוקר איכות לפי ציטומטריית זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: למדו פרוטוקול לעיבוד כיח לציטומטריית זרימה בדיאגנוסטיקה קלינית. השיטה משתמשת במשקל הכיח לקביעת נפחי צביעה ומאפשרת ספירת תאים מדויקת למחקר מחלות ריאה כמו COPD, אסתמה וסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו רוצים להודות לדיוויד רודריגז על עזרתו בהכנת הדמות. דגימות כיח בוצעו על BD LSR II ב UT בריאות סן אנטוניו זרימה Cytometry משאבים משותפים מתקן, נתמך על ידי בריאות UT, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC ב UT Health) ו UL1 TR001120 (מענק CTSA).

כל שלבי עיבוד הכיח מבוצעים בארון בטיחות ביולוגי עם ציוד מגן אישי מתאים.
1. הכנת ריאגנט לפני תחילת דיסוציאציה של כיח
<ol><li>מפשירים 1% Paraformaldehyde (PFA), 25 מ"ל לדגימה על קרח, ולשמור על קור עד השימוש. אזהרה: PFA רעיל על ידי שאיפה ומגע עור. הכן את הקיבעון על פי הוראות היצרן ולהקפיא ב -20 °C ב 25 mL aliquots עד השימוש.</li>
	<li>משוער את המשקל של המדגם להפשיר מספיק 0.1% Dithiothreitol (DTT) לשלב 2.2 ולהביא אותו ל 37 °C (50 °F). (עליקות של DTT צריך להיות מאוחסן ב -20 °C (70 °F) לפני השימוש.)</li>
	<li>להביא מספיק 0.5% N-אצטיל- L-ציסטאין (NAC) עד 37 °C (5 °F) לשלב 2.2. (NAC צריך להיות טרי שבועי ומאוחסן ב 4 °C (7 °F) לפני השימוש.)</li>
</ol>2. דיסוציאציה של כיח
<ol><li>שקול את דגימת הכיח כדי לקבוע את הנפחים של ריאגנטים דיסוציאציה. הערה: מדגם נחשב קטן אם המשקל ההתחלתי הוא ≤3 גרם, בינוני אם >3 גרם אבל ≤8 גרם, גדול אם >8 אבל ≤16 גרם, וגדול במיוחד אם מדגם שוקל >16 גרם. האינדיקציות קטנות, בינוניות, גדולות וגדולות במיוחד ישמשו לאורך הפרוטוקול. כמות ריאגנטים הנדרשים לדיסוציאציה ותיוג שונה בהתאם לגודל דגימת הליחה.</li>
	<li>העבר מדגם קטן לצינור חרוט נקי 50 מ"ל, מדגם בינוני לבקבוק חד פעמי פלסטיק נקי 250 מ"ל, או מדגם גדול וגדול במיוחד לבקבוק חד פעמי פלסטיק 500 מ"ל נקי. הוסף 1 מ"ל / גרם משקל מדגם של 0.5% NAC ו 4 מ"ל / גרם משקל מדגם של 0.1% DTT.</li>
	<li>מערבולת במהירות המרבית (עבור 15 s), ולאחר מכן רוק בטמפרטורת החדר (במהירות המרבית) במשך 15 דקות.</li>
	<li>לדלל את המדגם עם ארבעה כרכים של פתרון מלח מאוזן של האנק (HBSS) (בהתבסס על הנפח הכולל של מדגם + ריאגנטים) כדי לנטרל את NAC ו- DTT; מערבולת במהירות המרבית וסלע בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות במהירות המרבית.</li>
	<li>סנן את מתלה התא באמצעות מסננת תאי רשת ניילון 100 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי אחד או יותר של 50 מ"ל כדי ליצור מתלה של תא יחיד.</li>
	<li>צנטריפוגות התאים ב 800 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F). לשאוף את supernatant, לשלב את כל הכדורים בצינור חרוט אחד 15 מ"ל, ולאחר מכן לשטוף את הכדורים עם HBSS באמצעות אותם תנאים.</li>
	<li>resuspend גלולה התא בנפח של חוצץ נקבע על ידי המשקל הראשוני של דגימת כיח. הערה: מדגם קטן הוא respended ב 250 μL של HBSS. מדגם בינוני הוא respended ב 760 μL של HBSS. דגימות גדולות וגדולות במיוחד נותנות מחדש ב- 1460 μL של HBSS.</li>
	<li>קח aliquot של השעיית התא לספירת תאים חיים / מתים באמצעות טריפאן כחול. הערה: עבור מדגם קטן, השתמש 5 μL. לקבלת מדגם בינוני, גדול או גדול במיוחד, השתמש ב- 10 μL. לדלל 1:10 עם HBSS.<ol>
<li>לערבב 10 μL של דילול כיח עם 30 μL של 0.4% טריפן כחול כדי להשיג דילול מדגם סופי של 1:40. טען לתוך תאי הספירה של hemocytometer לספירת תאים. הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את הדילול הסופי אם מספרי התאים נמוכים מדי או גבוהים מדי כדי להשיג ספירה מדויקת. מומלץ מאוד להתייעץ עם Guiot et al.20 להבחנה נכונה של תאי כיח לבין SECs ופסולת. זה חיוני לספירת תאים מדויקת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מתוך המדגם הגדול במיוחד, להסיר 50 x 106 תאים מהסכום הכולל ולהוסיף צינור חדש עם מספיק HBSS הוסיף כדי ליצור נפח כולל של 1700 μL. הערה: שקול זאת כדוגמה גדולה עבור שאר הפרוטוקול. ניתן להשליך או להשתמש בשאריות דגימות למטרות אחרות.</li>
</ol>3. כתמי נוגדנים וצביעת קיימא
<ol><li>בחירה של נוגדנים וצבע מכתים הערה: טבלה 1 מציגה את הנוגדנים ואת צבע הכדאיות המשמשים בפרוטוקול זה ואת אוכלוסיות התאים שהם מזהים.<ol>
<li>סמן את הצינורות המכילים את תאי הכיח (ראה טבלה 2 עבור תוויות).</li>
		<li>השתמש בצינורות ציטומטריה של זרימה 5 מ"ל (תואם לציטומטר הזרימה המשמש) עבור צינור הדגימה עם התאים הלא מזוהמים והצינור עם בקרת האיזוטיפ. השתמש 15 mL צינורות חרוט עבור הדם ודגימות צינור אפיתל. הערה: דגימות אלה יועברו צינורות ציטומטריה זרימה בעקבות כתמי נוגדנים קיבעון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>סמן את צינורות הפיצוי (טבלה 3). הערה: השתמש בצינורות ציטומטריה של זרימה 5 מ"ל התואמים לציטומטר הזרימה הנמצא בשימוש.</li>
	<li>הוסף את כמות HBSS, נוגדן ו / או צבע לכל אחד צינורות תא כיח וצינורות פיצוי כפי שצוין בטבלה 2 ושולחן 3, בהתאמה. הערה: הוסף חוצץ (HBBS), נוגדנים וצבע לכל הצינורות לפני הוספת תאים או חרוזי פיצוי כדי להבטיח שזמן ההכתמה של כל הצינורות עקבי.</li>
	<li>הוסף את כמויות נפח תא הליחה המפורטות בטבלה 2 לצינורות ה- assay.</li>
	<li>הוסף חרוזי פיצוי לצינורות הפיצוי כמפורט בטבלה 3.</li>
	<li>לדגור את כל הצינורות (צינורות מבחנה ופיצוי) על קרח, מוגן מפני אור, במשך 35 דקות. לאחר מכן, מלא את הצינורות עם HBSS קר כקרח וצנטריפוגה ב 4 °C (50 °F) במשך 10 דקות ב 800 x g.</li>
	<li>עבור צינורות הפיצוי, לשאוף את supernatant קרוב לכדורים ככל האפשר ולהעיף את הכדורים להשתחרר.</li>
	<li>הוסף 0.5 מ"ל של HBSS קר לצינורות הפיצוי, לאחסן אותם על הקרח ב 4 °C (75 °F) ולהגן עליהם מפני אור עד הצורך לניתוח ציטומטריית זרימה.</li>
	<li>שאפו את הסופרנט מהצינורות האיזוטיפים, הדם והאפיתל הלא מזוהים לאחר הצנטריפוגה (שלב 3.6 ממקטע הכתמת הנוגדנים) ושחררו את הכדורים על ידי הבהוב הצינורות.</li>
</ol>4. קיבעון עם 1% Paraformaldehyde (PFA)
<ol><li>הוסף PFA קר 1% (אשר צריך להיות מופשר על ידי החברה) צינורות לא נגועים, איזוטיפ, דם, אפיתל; 2 מ"ל לצינורות האיזוטיפים הלא מזוהמים, ו-10 מ"ל לצינורות הדם והאפיתל.</li>
	<li>לדגור על הצינורות על קרח, מוגן מפני אור במשך 1 שעה. מערבולת במהירות המרבית לאחר 30 דקות.</li>
	<li>מלאו את הצינורות ב-HBSS קר כקרח. לאחר מכן, צינורות צנטריפוגה ב 4 °C (55 °F) במשך 10 דקות ב 1600 x g.</li>
	<li>שאפו כמה שיותר סופר-טבעי מבלי להפריע לכדור התא והעבירו את הצינור עם האצבעות כדי לשחרר את התאים.</li>
	<li>הוסף 200 μL של HBSS קר לצינורות איזוטיפ לא נגועים.</li>
	<li>חשב את הנפח של HBSS עבור resuspension של הדם ואת צינור האפיתל על פי ספירת התאים הכוללת. הערה: נפח התחדשות = 0.15 x [ספירת תאים כוללת (שלב 8 של פירוק כיח) / 106]. השתמש ב- 50 x 106 כספירת התאים עבור מדגם גדול במיוחד.</li>
	<li>לאחסן את כל מדגם צינורות פיצוי, מוגן מפני אור על הקרח ב 4 °C (50 °F) עד ניתוח ציטומטריית זרימה מבוצע. הערה: פרוטוקול זה לא נבדק לאחסון במשך יותר מ- 24 שעות.</li>
</ol>5. רכישת נתונים על ציטומטר הזרימה
<ol><li>החל הליכי אתחול מתאימים עבור cytometer הזרימה בשימוש. הערה: סעיף זה בפרוטוקול מניח כי האדם המפעיל את cytometer הזרימה מאומן בשימוש במכשיר העומד לרשותם, במיוחד לגבי נהלים יומיים כולל בדיקת היציבות של מערכות אופטיקה ו fluidics, טכניקות לתקנן פיזור אור ועוצמת פלואורסצנטיות, כמו גם חישוב והחלת מטריצת הפיצוי הנכונה.</li>
	<li>השתמש בתערובת של חרוזים של המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (NIST) כדי להבטיח כי מתחי פיזור וזרימת צד קדימה מוגדרים למקם את חרוזי NIST כדי להתפרש על כל החלקה מבלי למקם את החרוזים קרוב מדי לצירים. הערה: שלב זה חיוני כדי להבטיח כי פסולת קטנה מ 5 מיקרומטר ניתן לבטל על ידי ניתוח לאחר הרכישה. בהתאם לציטומטר הזרימה המשמש, שים לב כי החרוזים הקטנים ביותר אינם נכללים עם הסף (בעת שימוש LSR II או הליריקה) או עם המפלה הגבוהה (באמצעות Cytometer זרימה Navios EX). עבור Navios EX, רווח של 2 שימש עבור פיזור קדימה וצד, מתח של 236 עבור פיזור קדימה, ו 250 עבור פיזור צד. עבור LSR II, מתח פיזור קדימה של 165 ומתח פיזור צדדי של 190 שימש.</li>
	<li>הגדר את קצב הזרימה לבינוני (LSR II) או גבוה (Navios EX). הערה: קצב הזרימה הבינוני או הגבוה עבור רוב המכשירים יכול לשמש לרכישת צינורות כיח. חשוב לציין כי שימוש איטי מדי של קצב זרימה או לדלל מדי של המדגם עלול לגרום לתאים להתיישב, וכתוצאה מכך מערבולת מוגברת אשר אינו הרצוי. לכן, היצמדות לנפח ההשתתפות המחושבת בשלב 4.6 אמורה לגרום לצפיפות תאית שניתן לרכוש במהירות אך לא לסתום את המכונה.</li>
	<li>התאם את המתחים עבור כל פרמטר המשמש לפרמטרים של פיזור ופלואורסצנטי כדי למקם את אוכלוסיות התאים בסולם. השתמש בנתונים עם אסטרטגיית הגטינג כהדרכה כיצד להתאים את המתחים בהתאם. הערה: ודא שכל הפרמטרים הדרושים נבחרים בחלון בחירת הפרמטרים לפני הרכישה או שהנתונים לא יירכשו.</li>
	<li>לרכוש נתונים עבור דגימת כיח נגוע תחילה, ואחריו מדגם מוכתם איזוטיפ, ולאחר מכן צינור הדם ואת צינור האפיתל. הערה: אם ההשעיה של התא מרוכזת מדי כדי לאפשר לציטומטר הזרימה להפעיל את הדגימות מבלי לסתום, הדגימות עשויות להיות מדוללות עוד יותר עם HBSS.</li>
</ol>

כל המחברים הם עובדים בעבר או בהווה של טכנולוגיות bioAffinity.

התוכן התאי של כיח כולל מגוון גדול של תאים רחבים, לעתים קרובות מלווה הרבה פסולת37. בנוסף, ניתוח כיח דורש בקרת איכות המאשרת את המדגם שנאסף מהריאה במקום מחלל הפה38. לכן, זה לא פשוט לנתח כיח על ידי ציטומטריה זרימה כפי שהוא עבור דם, למשל, אשר משחרר הרבה יותר נקי הומוגני השעיית תא. פרוטוקול זה התייחס לכל הבעיות הללו: מתן הגדרות מכשיר באמצעות חרוזי גודל ספציפיים כדי להבטיח שניתן יהיה לזהות את אוכלוסיות התאים הקטנות והגדולות ביותר, אסטרטגיית gating לחיסול פסולת, גושי תאים, SECs מזה...

ההתקדמות הטכנית בחומרה ובתוכנה של ציטומטרי זרימה אפשרה לזהות אוכלוסיות תאים נפרדות רבות בו זמנית1,2,3,4. הניצול של cytometer הזרימה במחקר תאים hematopoietic, למשל, הוביל להבנה הרבה יותר טובה של המערכת החיסונית2 ואת ההיררכיה התאית של המערכת hematopoietic5, כמו גם הבחנה אבחונית של שפע של סרטן דם שונים6,7,8. למרות שרוב תאי הכיח הם ממוצא hematopoietic9,10,11, ציטומטריית זרימה לא יושם באופן נרחב על ניתוח כיח למטרות אבחון. עם זאת, מספר מחקרים מראים כי ההערכה של אוכלוסיות תאי מערכת החיסון בליחה (תת קבוצת התאים המשמעותית ביותר) עשויה לעזר רב באבחון ו/או ניטור מחלות כגון אסתמה ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD)12,13,14,15. יתר על כן, קיומם של סמנים ספציפיים לאפיתל שניתן להשתמש בהם בציטומטריית זרימה מאפשר לחקור את תת-קבוצה משמעותית ביותר של תאים בליחה, תאי אפיתל ריאות.
בנוסף ליכולת לנתח אוכלוסיות תאים נפרדות רבות ממקורות רקמות שונות, cytometer זרימה יכול להעריך מספר גדול של תאים בתקופה קצרה יחסית. לשם השוואה, סוגים ציטולוגיים מבוססי שקופיות של ניתוחים דורשים לעתים קרובות כוח אדם ו / או ציוד מיוחדים מאוד. ניתוחים אלה יכולים להיות עתירי עבודה, מה שמוביל רק לחלק ממדגם הכיח המנותח16.
שלוש בעיות קריטיות מגבילות את השימוש הנרחב בליחה בציטומטריית הזרימה. הגיליון הראשון מתייחס לאוסף הליחה. כיח נאסף באמצעות שיעול שאף המסלק ריר מהריאות לחלל הפה, ולאחר מכן יורק לתוך אוסף. מאז הריר נע דרך חלל הפה, יש סיכוי גבוה של זיהום SEC. זיהום זה מסבך את ניתוח הדגימה, אך הבעיה מתוקנת בקלות על פלטפורמה ציטומטרית זרימה, כפי שמוצג במחקר זה.
לא כל אחד יכול לייצר כיח באופן ספונטני; לכן, מספר מכשירים פותחו כדי לסייע עם אוסף כיח באופן לא פולשני17. הנבולייזר הוא מכשיר אחד כזה והוכח כמפיק דגימות כיח אמינות18,19,20. למרות nebulizer היא דרך יעילה מאוד של איסוף כיח באופן לא פולשני, השימוש בו עדיין דורש הגדרה במתקן רפואי עם כוח אדם מיוחד21. לעומת זאת, ניתן להשתמש במכשירי כף יד כגון חליל הריאה22,23,24 והאקפלה16,25 בבית מכיוון שהם ידידותיים מאוד למשתמש. התקני סיוע אלה בטוחים וחסכוניים כאחד.
עבורנו, האקפלה נתנה תוצאות טובות יותר באופן עקבי מאשר חליל הריאות16, ולכן, מכשיר acapella נבחר עבור אוספי כיח. דגימת איסוף של 3 ימים הוחלט כי המטרה העיקרית לשימוש בליחה היא לפתח בדיקת גילוי סרטן ריאות16. הוכח כי מדגם של 3 ימים מגביר את הסבירות לגילוי סרטן ריאות בהשוואה לדגימה של יום או יומיים26,27,28. עם זאת, שיטות אחרות של איסוף כיח עשויות להיות עדיפות למטרות שונות. אם נעשה שימוש בשיטת איסוף כיח שונה מזו המתוארת כאן, מומלץ לתבל בקפידה כל נוגדן או צבע המשמשים לניתוח ציטומטרי של זרימה; מעט מאוד נתונים זמינים על האופן שבו שיטות שונות לאיסוף כיח משפיעות על החלבונים הממוקדים לציטומטריית זרימה.
הנושא השני שמדכא את ההתלהבות משימוש בליחה לאבחון, הקשור בעיקר לציטומטריית הזרימה, הוא מספר התא. הבעיה היא איסוף של תאים ברי קיימא מספיק לניתוח אמין. שני מחקרים הראו כי דגימות כיח שנאספו בשיטות לא פולשניות, בעזרת מכשיר סיוע, מכילות מספיק תאים בני קיימא שניתן להשתמש בהם באבחון קליני או במחקרים16,24. עם זאת, אף אחד מהמחקרים הללו לא התייחס לנושא מספרי התאים בנוגע לציטומטריית הזרימה.
עבור המחקרים המהווים את הבסיס לפרוטוקול זה, נאספו דגימות כיח ממשתתפים בסיכון גבוה לפתח סרטן ריאות בעקבות הנחיות מוסדיות מאושרות לכל אתר מחקר. משתתפים בסיכון גבוה הוגדרו בין 55-75 שנים, לאחר שעישנו 30 שנות חבילה ולא הפסיקו לעשן ב -15 השנים האחרונות. המטופלים הראו כיצד להשתמש במכשיר אקפלה על פי הוראות היצרן29 ונאספו כיח במשך שלושה ימים רצופים בבית. הדגימה נשמרה במקרר עד האוסף האחרון. ביום האיסוף האחרון, הדגימה נשלחה למעבדה בלילה עם חבילה קרה קפואה. הדגימות עובדו לתוך השעיית תא אחד ביום שהם התקבלו. בשיטה זו של איסוף כיח, יותר ממספיק תאים קיימא מתקבלים לניתוח ציטומטרי זרימה אמין.
לבסוף, וקשור לבעיה הקודמת של מספר התא, היא השאלה כיצד לשחרר את תאי הכיח מסביבתו המוסינית. כיצד ניתן לשמור על התאים בני קיימא וליצור השעיית תא בודד שאינו סותם את ציטומטר הזרימה? מבוסס על עבודה ראשונית של פיצ'יני ואח' 30 ומילר ואח' 31, פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה ואמינה לעיבוד כיח לתוך מתלה תא בודד המתאים לניתוח ציטומטרי של זרימה. שיטה זו השתמשה בהנחיות מבוססות היטב בציטומטריה של זרימה32,33,34 כדי לפתח אסטרטגיית תיוג נוגדנים יעילה לזיהוי תאים המטויים ואפיתל בליחה ולספק הגדרות מכשיר, אמצעי בקרת איכות והנחיות ניתוח התקנון ניתוח כיח בפלטפורמה ציטומטרית של זרימה.

<table><tbody><tr><td>1% פרפורמלדהיד Flow-Fix</td><td>Polysciences</td><td>25037</td><td></td></tr><tr><td>100 ומיקרו; M מסנני תאי ניילון, Falcon #352360</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0593-1</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור בז חרוטי</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 אנטי אנושי CD19</td><td>BioLegend</td><td>302219</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 אנטי אנושי CD3</td><td>BioLegend</td><td>300415</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 ציטוקרטין אנטי אנושי</td><td>BioLegend</td><td>628608</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 PanCK, CD3 ו-CD19 איזוטיפ</td><td>BioLegend</td><td>400129</td><td></td></tr><tr><td>BV510 אנטי אנושי CD45</td><td>BioLegend</td><td>304036</td><td></td></tr><tr><td>CD66b FITC איזוטיפ</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>CompBead Plus חרוזי פיצוי</td><td>BD Biosciences</td><td>560497</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק סטרילי חד פעמי פוליסטירן קורנינג 250 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-761-4</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק סטרילי חד פעמי קורנינג פוליסטירן 500 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-761-10</td><td></td></tr><tr><td>CS& חרוזי T</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC אנטי אנושי CD66b</td><td>GeneTex</td><td>GTX75907</td><td></td></tr><tr><td>כתם כדאיות לתיקון</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck</td><td>בקמן קולטר</td><td>A69183</td><td></td></tr><tr><td>FlowSet</td><td>בקמן קולטר</td><td>A69184</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-175-095</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי NIST, 05 &mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64080</td><td></td></tr><tr><td>NIST חרוזים, 20 &mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64160</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי NIST, 30 &mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64170</td><td></td></tr><tr><td>PE אנטי-אנושי CD45</td><td>BioLegend</td><td></td> 304039-PE-CF594 <td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי EpCAM</td><td>BD Biosciences</td><td></td> 565399-PE-CF594 <td></td></tr><tr><td>CD206/EpCAM איזוטיפ</td><td>BD Biosciences</td><td></td> 562292-PE-CR594 <td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD206</td><td>BD Biosciences</td><td>564063</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט דיהידראט</td><td>EMD</td><td>SX0445-1</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפאן בלו, 0.4%</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח כיח מבוקר איכות לפי ציטומטריית זרימה

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

כיח, בשימוש נרחב כדי ללמוד את התוכן התאי ותכונות מיקרו-ויברונמנטליות אחרות כדי להבין את בריאות הריאה, מנותח באופן מסורתי באמצעות מתודולוגיות מבוססות ציטולוגיה. השירות שלה מוגבל כי קריאת השקופיות גוזלת זמן רב ודורש כוח אדם מיוחד מאוד. יתר על כן, פסולת נרחבת ונוכחות של יותר מדי תאי אפיתל קשקשיים (SECs), או תאי הלחי, לעתים קרובות הופך מדגם לא מספיק לאבחון. לעומת זאת, ציטומטריית הזרימה מאפשרת פנוטיפינג בעל תפוקה גבוהה של אוכלוסיות הסלולר ובו זמנית למעט פסולת ו- SECs.
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה יעילה לניתוק כיח לתוך מתלה תא יחיד, כתם נוגדנים ותיקון אוכלוסיות הסלולר, ולרכוש דגימות על פלטפורמה ציטומטרית זרימה. אסטרטגיית גטינג המתארת את הדרת הפסולת, תאים מתים (כולל SECs) ומכפילי תאים מוצגת כאן. יתר על כן, עבודה זו מסבירה גם כיצד לנתח תאי כיח יחיד קיימא המבוססים על אשכול של בידול (CD)45 אוכלוסיות חיוביות ושליליות כדי לאפיין תת-קבוצות שושלת hematopoietic ושושלת אפיתל. אמצעי בקרת איכות מסופק גם על ידי זיהוי מקרופאגים ספציפיים לריאות כראיה לכך שדגימה נגזרת מהריאה ואינה רוק. לבסוף, הוכח כי שיטה זו יכולה להיות מיושמת על פלטפורמות ציטומטריות שונות על ידי מתן פרופילי כיח מאותו חולה שנותח על שלושה ציטומטרים זרימה; Navios EX, LSR II, וליריק. יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן לשנות כדי לכלול סמנים סלולריים נוספים של עניין. שיטה לניתוח דגימת כיח שלמה על פלטפורמה ציטומטרית זרימה מוצגת כאן מה שהופך את הליחה למקובלת לפיתוח אבחון בעל תפוקה גבוהה של מחלת ריאות.

פרוטוקול זה פותח תוך התחשבות במעבדה קלינית. ההתמקדות במהלך פיתוח הפרוטוקול הייתה על פשטות, יעילות ושחזור. נמצא כי השלב הגוזל זמן רב ביותר בעיבוד של כיח היה לספור את התאים. לכן, הפרוטוקול מוגדר באופן כזה כי עיבוד כיח ותיוג תאים ניתן לבצע בנפרד מספירת תאים ללא אובדן זמן. ספירת תאים מדויקת, שעדיין נחוצה כדי לדלל את הדגימה כראוי לריצה ללא הפרעה, ניתן להשיג במהלך תקופת הדגירה של תיוג הנוגדנים.
פרוטוקול זה משתמש במדידה של משקל כיח במקום ספירת תאים כאינדיקציה לכמה נוגדנים/צבע להשתמש לתיוג תאים אופטימ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לניתוק כיח למתלה תא בודד ואת האפיון הבא של תת-קבוצות סלולריות בפלטפורמות ציטומטריות סטנדרטיות של זרימה.

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

פרוטוקול זה פותר אתגרים נפוצים שחווה עם עיבוד כיח שהקשתו בעבר על השימוש בציטומטריית זרימה למטרות אבחון קליני בעלות תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה נועד לחסוך זמן באמצעות משקל כיח כדי לקבוע נפחי כתמי נוגדנים וצבע. במהלך הדגירה הכתימה, ניתן לבצע ספירת תאים עבור השלבים במורד הזרם.חשוב להשיג ספירת תאים מדויקת כדי לקבוע את נפח ההשעיה מחדש הנכון כדי למנוע בעיות בעת ריצה על cytometer הזרימה. פרוטוקול זה יכול לספק תובנה על תחומי מחקר החוקרים את בריאות הריאות. לדוגמה, ניתן ללמוד מחלות כגון COPD, אסתמה, סרטן ריאות או ההשפעות של COVID.מדגים את ההליך יהיה ד"ר מייקל לאי, מדען מחקר ופיתוח מהמעבדה שלי. ראשית, לשקול את מדגם כיח כדי לקבוע את הנפחים של ריאגנטים דיסוציאציה. להעביר את המדגם לכלי בגודל המתאים בהתבסס על משקל כיח, ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד לגרם של 0.5% NAC ו 4 מיליליטר לגרם של 0.1%DTT.מערבולת הדגימות במהירות המרבית במשך 15 שניות וסלע במהירות המרבית במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לדלל מדגם זה עם תמיסת מלח מאוזנת 4X הנקס או HBSS כדי לנטרל את NAC ו- DTT. ואחרי מערבולת מהירה, לטלטל את המדגם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.מסנן מתלה תא באמצעות מסננת תא רשת ניילון 100 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי אחד או יותר 50 מיליליטר כדי ליצור השעיה של תא אחד. תפיל את התאים. לאחר שאיפה supernatant, לשלב כדורי אחד 15 מיליליטר צינור חרוט לשטוף עם HBSS באותם תנאים.resuspend גלולה התא בנפח של חוצץ נקבע על ידי המשקל הראשוני של דגימת כיח. קח aliquot מן השעיית התא ולערבב 10 microliters של דילול כיח עם 30 microliters של 0.4% כחול טריפן, ולאחר מכן לטעון לתוך תאי הספירה של המוציטומטר לספירת תאים חיים / מתים. כיח תווית בצינורות פיצוי.הוסף נוגדן HBSS וצבע לכל צינור תא כיח וצינורות פיצוי כפי שצוין בטקסט. הוסף את תאי הכיח לצינורות ה- assay והוסף חרוזי פיצוי לצינורות הפיצוי כפי שהוזכר בטקסט. לדגור את כל הצינורות על קרח מוגן מפני אור במשך 35 דקות.לאחר מילוי הצינורות עם HBSS קר כקרח, צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 800 פעמים G.for צינורות פיצוי, לשאוף את supernatant קרוב לכדורים ככל האפשר ולהעיף את הכדורים להשתחרר. לאחר מכן, להוסיף 0.5 מיליליטר של HBSS קר צינורות פיצוי ולאחסן את הצינורות על הקרח באזור מוגן אור עד הצורך לניתוח ציטומטריית זרימה. ואז שאפו את הסופר-נט מהליחה, איזוטיפ, דם וצינורות אפיתל לא מוכתמים.לשחרר את הכדורים על ידי הבהוב הצינורות. הוסף שני מיליליטר של 1%PFA לצינורות האיזוטיפים הלא מזוהמים ו -10 מיליליטר לצינורות הדם והאפיתל. לדגור על הצינורות על קרח בצורה מוגנת אור במשך 30 דקות, ולאחר מכן במהירות מערבולת במהירות המרבית ושוב לדגור במשך 30 דקות נוספות.ואז למלא את הצינורות עם HBSS קר כקרח. לאחר מכן, צנטריפוגות הצינורות בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 1, 600 פעמים G.Aspirate ככל האפשר מבלי להפריע לכדור התא ולהעיף את הצינור עם האצבעות כדי לשחרר את התאים, ולאחר מכן להוסיף 200 microliters של HBSS קר צינורות לא נגוע ואיזוטיפ. לחשב ולהוסיף את הנפח הנדרש של HBSS עבור resuspension של הדם ואת צינור האפיתל על פי ספירת התאים הכוללת.לאחסן את כל הדגימות בצינורות פיצוי מוגן מפני אור על הקרח בארבע מעלות צלזיוס עד ניתוח ציטומטריה זרימה מבוצע. החל הליכי אתחול מתאימים עבור cytometer הזרימה בשימוש. השתמש בתערובת של המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה או חרוזי NIST כדי להבטיח כי מתחי פיזור קדימה ופיזור צד מוגדרים למקם את חרוזי NIST כדי להתפרש על העלילה מבלי למקם את החרוזים קרוב מדי לצירים.הגדר את קצב הזרימה כבינוני עבור LSRII או גבוה עבור Navios EX. התאם את המתחים עבור כל פרמטר המשמש עבור הפרמטרים פיזור פלואורסצנטי למקם את אוכלוסיות התא בקנה מידה. השתמש בנתונים עם אסטרטגיית הגטינג כהדרכה להתאמת המתחים בהתאם. לרכוש נתונים עבור דגימת כיח לא נגוע תחילה, ואחריו מדגם מוכתם איזוטיפ, ולאחר מכן צינור הדם ואת צינור האפיתל.משקל כיח שימש לקביעת נפחי נוגדנים או צבע להכתמה. המתאם בין משקל הליחה לתפוקת התא לא היה חזק. דגימות כיח חולקו לארבע קטגוריות משקל, אשר מקובצים בהתפלגות של תפוקת התא.כל נוגדן בשימוש היה titrated בריכוז בשלב הרמה עם מדד הכתמים הגבוה ביותר נבחר כמו ריכוז העבודה. בכל קטגוריות המשקל, הזיהום הממוצע של ה- SEC היה פחות מ -20% עם אחוז התאים קיימא המוצג. מוצגת אסטרטגיית הגטינג המשמשת לניתוח.חרוזי NIST שימשו כדי להגדיר שער אשר הוחל על מדגם כיח כדי לחסל פסולת. פסולת קטנה חוסלה עוד יותר על ידי שער הרוחב. צבע הכדאיות שימש לחיסול תאים מתים, בעוד שער יחיד הוסר כפולות.תיוג נוגדני האנטי-CD45 אפשר הפרדה של תאי כיח בודדים חיים לתא דם ותא שאינו תא דם. הפרופילים שהתקבלו מ- Navios EX, LSRII ו- Lyric הושוו. אסטרטגיית הגינג לחיסול הפסולת, התאים המתים, הכפילים והשוואת פרופילי הדם והלא דם מוצגת.טכניקה זו אפשרה לנו ליישם שיטות אלה כדי לזהות סיכון לסרטן ריאות לשימוש כבדיקה קלינית לא פולשנית.

quality-controlled-sputum-analysis-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מדגים את השימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולספור תאים חיסוניים שונים בנוזל שטיפה ברונכואלבאולרי. בתחילה, מזהים תאים חיסוניים בודדים באמצעות צבע כדאיות, ולאחר מכן צביעה דיפרנציאלית של חלבוני סמן פני השטח, המאפשרת ספירה מדויקת של כל סוג תא.

זיהוי וספירה של תאי מערכת החיסון בנוזל שטיפה סימפוני לפי ציטומטריית זרימה

השימוש בדגימת ציטומברשת לאיסוף לימפוציטים ומונוציטים מהאנדו-צוואר הרחם הוא טכניקה זעיר פולשנית המספקת דגימות לניתוח חסינות דרכי המין הנשיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את איסוף דגימות הציטו-מברשת ובידוד תאי החיסון עבור מבחני זרימה ציטומטרית.

אוסף, בידוד, וניתוח תזרים cytometric של דוגמאות האנדוצרוויקאלית אדם

שיטה זו מדגימה טכניקה להערכת תפקוד גרנולוציטים על ידי מדידה בו-זמנית של פגוציטוזיס של חיידקים והתפרצות חמצונית. ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה אפשרה זיהוי של שלוש תת-קבוצות נפרדות של גרנולוציטים מופעלים שכולן נבדלות ביכולתן התפקודית היחסית.

טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte במבחנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת חלקיקים טעונים האלרגן על ידי cytometry הזרימה. חלקיקי חומר חלקיקי הסביבה עלולים לשמש נשאים של אלרגנים adsorbed. ונביא כאן כי cytometry זרימה, שיטה בשימוש נרחב כדי לאפיין מוצקים מרחפים&gt; 0.5 מיקרומטר קוטר, ניתן להשתמש כדי למדוד חלקיקים אלרגנים טעונות אלו.

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

מצב בריאותי של הריאה משתקף על ידי סוג ומספר של תאים חיסוניים הנמצאים bronchioles של הריאה. אנו מתארים טכניקת שטיפה ברונכואלוואלית המאפשרת בידוד ומחקר של תאים לא דליקים וגורמים מסיסים ממערכת הנשימה התחתונה של עכברים.

ברונכאלווולאר של ריאות Murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית

מאמר זה מתאר ספקטרלי cytometry, גישה חדשה ב cytometry הזרימה המשתמשת צורות של ספקטרום פליטה להבחין fluorochromes. אלגוריתם מחליף פיצויים יכול לטפל קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי. גישה חדשה זו מאפשרת הניתוח הראוי של תאים מבודדים איברים מוצקים.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

כאן נתאר את הטכניקה של ברוק אינדוקציה. פרוטוקול זה גם מסביר את ברוק עיבוד כדי לבצע ספירה מבדלת תא וכדי לאסוף sputum supernatant תאים עבור ניתוח נוסף.

מתודולוגיה Sputum אינדוקציה ועיבוד מעבדה

בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

הפרוטוקולים המתוארים בזאת מספקים מדריך כדי לדמיין ולכמת את הפעילות של פרוטאזות נויטרופילים בליחה אנושית. היישומים של ניתוח כזה משתרעים מההערכה של טיפולים אנטי דלקתיים, לאימות סמנים ביולוגיים, הקרנת תרופות ומחקרים קליניים גדולים.

ניטור נויטרופילים אלסטאז וקטפסין G פעילות בדגימות כיח אנושי

במהלך השנים האחרונות, מבחני מבוססי תאים חיים כבר השתמשו בהצלחה כדי לזהות נוגדנים כנגד פני השטח ואנטיגנים קונפורמציה. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות זרימת cytometry תפוקה גבוהה המאפשר הניתוח של קבוצות גדולות של חולים. זיהוי של נוגדני רומן ישפר את האבחון וטיפול בהפרעות חיסונית בתיווך.

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

למדו פרוטוקול לעיבוד כיח לציטומטריית זרימה בדיאגנוסטיקה קלינית. השיטה משתמשת במשקל הכיח לקביעת נפחי צביעה ומאפשרת ספירת תאים מדויקת למחקר מחלות ריאה כמו COPD, אסתמה וסרטן.

ניתוח כיח מבוקר איכות לפי ציטומטריית זרימה

גלה סרטונים נוספים