ברייטפילד בו זמנית, פלואורסצנטיות והדמיה טומוגרפית קוהרנטית אופטית של התלקחות טרבקולה לב Ex Vivo

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שילוב של שלוש מערכות הדמיה במכשיר יחיד, המאפשר מדידה סימולטנית של הפונקציה המכנית, הדינמיקה היונית והשינוי הגיאומטרי של רקמת הלב המתכווצת. באופן ספציפי, אנו מודדים את ייצור הכוח של הרקמה, סידן ארעי, עקירות מקומיות ושינוי צורה. שילוב של שיטות הדמיה אלה יכול לעזור לענות על שאלות מרכזיות במחלות לב, עם השלכות משמעותיות על פיתוח אסטרטגיות טיפול יעילות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו ללמוד את ההטרוגניות של פעילות השרירים. ההתקן המשמש בפרוטוקול זה מכיל שלוש מערכות הדמיה המסוגלות להדמיה של אותה דגימה, מיקרוסקופ ברייטפילד, מיקרוסקופ פלואורסצנטי וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית. סדרה של מראות דיכרואיות משמשות להפרדת פליטת הפלואורסצנטיות לבין תמונת השידור של Brightfield.

התכונות הבסיסיות של התקן זה הן שני ווים להרכבה המופעלים באופן עצמאי, תא מדידה עם שלושה צירים ברורים אופטית וקו הדק חיצוני המסנכרן את מצלמות Brightfield ו- OCT עם ממריץ. בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד לבודד, להכין ולדמות טרבקולה לבבית ולהציג כמה תוצאות מייצגות. לאחר כריתת לב מעכברוש מרדים, העבר אותו לתא הניתוח.

בעזרת שני מלקחיים מעוקלים, משכו את צינור העורקים מעל צינורית ההזדוה. החזק את העורקים במקום עם כוח אחד. בינתיים, פתח את קו הצינורות כדי לאפשר פתרון ניתוח לזרום דרך צינורית זלוף.

ברגע vasculature הכלילי הוא פינה של דם ואת הלב הוא perfused לחלוטין עם פתרון ביתור, לאבטח את aorta במקום באמצעות תפר. מקם את הלב על ידי סיבוב הצינורית כך העורק הכלילי השמאלי נראה על פני השטח מעולה. הצמידו את פסגת הלב לתחתית תא הניתוח.

תנתק את שניהם אטריה. חותכים לאורך הצד הימני של המחיצה לשיא הלב. הצמידו את החדר השמאלי הפתוח לבסיס תא הניתוח.

לאחר מכן, חיתוך לאורך הצד השמאלי של המחיצה, לפתוח את החדר הימני להצמיד אותו לבסיס של תא הניתוח, מדי. זהה טרבקולה חופשית בחדר הימני. בעזרת מספריים קפיץ ומלקחיים, חותכים את רקמת הקיר המקיפה את הטרבקולה.

לאחר מכן, לחתוך את רקמת הקיר לשניים, אורתוגונל לכיוון הטרבקולה. לקצץ את רקמת הקיר עד הממד שלה מתאים לתצורת הרכבה בשימוש. תשאיר את הטרבקולה הנקרה בתא הניתוח.

לשטוף מים חמים, מים מזוקקים, ולאחר מכן פתרון superfusate דרך תא המדידה. הפעל את מקור האור של המיקרוסקופ הבהיר והקש F1 כדי לאפשר לכידה. כוונן ידנית את הוו במורד הזרם עד שהוא ירוכז בתמונת Brightfield.

לחץ על ציר אפס במורד הזרם ולאחר מכן הפוך במורד הזרם ללא זמין כדי להפוך את המנוע לזמין. הזז את מחוון נקודת ההזזה במורד הזרם עד שסוף הוו יתיישר לקצה אזור העניין המוגדר כברירת מחדל. אפס מחדש את ציר הזרם במורד ולאחר מכן הזז את מחוון נקודת הזרם במורד ל- 1,000.

חזור על התהליך עם ה- hook במעלה הזרם, אך אל תזיז את מחוון נקודת ההפעלה במעלה הזרם לאחר אפס מחדש של הציר במעלה הזרם. לחץ על העבר להרכבה. הפעל את מערכת תאורת הפלואורסצנטיות על-ידי החלפת מתג המנורה לפני שתפעיל במהירות את מערכות המשנה של הבקר על-ידי החלפת המתג הראשי.

החלף את המצב התפעולי לריקת טורבו על-ידי לחיצה על לחצן המצב בלוח הקדמי, ואחריו שניים ולאחר מכן אחד. לחץ על לחצן מקוון כדי להפוך שליטה חיצונית לזמינה. השהה את זרימת העל דרך תא המדידה.

מלאו את תא ההרכבה בפתרון ביתור. באמצעות מזרק של מיליליטר אחד, העבירו את הטרבקולה מתא הניתוח לתא הרכבה. אפשר לטרבקולה לרדת לתא הרכבה באמצעות כוח המשיכה.

הורידו את רמת הנוזל בתא הרכבה כך שהם ישרים עם החלק האמצעי של הקרסים. התאם את המרחק בין הווים כדי לשקף את אורך המרווח של הטרבקולה על-ידי הזזת מחוון נקודת ההסטה במורד הזרם. באמצעות מיקרוסקופ כדי לסייע בהדמיה, לאחוז קלות את אחת מחתיכות רקמת הקצה במלקחיים ולהרכיב אותה על הוו במעלה הזרם.

הר את החתיכה השנייה של רקמת הקצה על הקרס במורד הזרם. לאחר רכוב מאובטח, להעביר את trabecula בחזרה לתא המדידה על ידי לחיצה על לעבור לתא ולחדש את זרימת superfusate. הגדר את תדירות הגירוי לאחד, משך גירוי ל 10, מתח גירוי ל 10.

התחל גירוי על ידי לחיצה על גירוי על. הפעל את מערכת התאורה של הבהירות. הקש F1 ובחר אזור עניין המקיף אזור מפוסן בממשק המשתמש.

לחץ על חשב אורך סרקומר כדי לחשב את אורך הסרקום הממוצע באזור המסומן. להגדיל את אורך השריר עד אורך sarcomere הממוצע הוא כ 2.32 מיקרון. הזז את השריר על-ידי התאמת מחוון נקודת הקבע המרכזית בכרטיסיה מרכז ופקד הפרדה כך שקצה הוו במורד הזרם יהיה גלוי רק בתמונת הבהירות.

לאסוף את מידע פלואורסצנטיות עבור 10 עוויתות. הגדל את ערך נקודת המרכז ב- 200 ואסוף מידע פלואורסצנטי נוסף בשווי 10 עוויתות. חזור על תהליך זה עד שתמונת Brightfield תכילה את הוו במעלה הזרם.

לאסוף את שווה של החלון הסופי של מידע פלואורסצנטיות. החזר את הטרבקולה למיקום מרכזי על-ידי הגדרת ערך נקודת הקבע המרכזית לאפס. הפחיתו את תדר הגירוי ל-0.2 הרץ ועברו מסופרפוזאט K-H לפתרון הטעינה Fura-2.

מדוד את אות הפלואורסצנטיות כל 10 דקות. דמיין את האות בכרטיסיית אות PMT. לאחר אות 360 ננומטר גדל על ידי גורם של 10, להחזיר את תדר הגירוי הרץ אחד ולעבור בחזרה לפתרון סופר-פוסאט K-H.

בדוק את מדידת היחס כל 10 דקות עד שהאות מתייצב, ובשלב זה, איסוף הנתונים יכול להתחיל. החזר את השריר למצב שבו הקצה של וו במורד הזרם הוא רק נוכח בתוך התמונה Brightfield. לכוד מידע פלואורסצנטי על ידי לחיצה על הפעל מקור פלואורסצנטי.

התחל להזרים נתוני חומרה. בממשק המשתמש של הדמיית Brightfield, הגדר את מצב הלכידה לגורם מפעיל חיצוני, הגדל את קצב הפריימים ל- 100 הרץ והגדר את מספר התמונות ללכידה ל- 100. לחץ על Control-shift-S, ואחריו F1, כדי להקליט את נתוני ההדמיה של Brightfield עבור חלון זה.

הגדל את ערך נקודת הקבע המרכזית ב- 200 וחזור על תהליך לכידת Brightfield. המשך בפרוטוקול הסריקה עד לאיסוף נתוני ההדמיה עבור החלון הסופי. החזר את הטרבקולה למיקום מרכזי על-ידי הגדרת ערך נקודת הקבע המרכזית לאפס.

הפעל את מקור התאורה OCT על-ידי סיבוב המקש הראשי, לחיצה על לחצן ההפעלה ולאחריו לחצן SLDs. כסו את ראש הגלוונומטר ולחצו על 'קבל רקע' כדי למדוד את תבנית ההפרעה ברקע ולהפחית אותה מהמדידה. הגדר את מצב לכידת התמונה לתצוגה חיה.

מרכז את הטרבקולה בצירי X ו- Y על-ידי התאמת ערכי היסט X ו- Y. כאשר הטרבקולה ממורכזת, סרוק לאורך ציר ה- y על-ידי התאמת מיקום ה- Y כדי למצוא את המיקומים המתאימים לווים במעלה הזרם ובמורד הזרם. שים לב למיקומים אלה כלפי מטה.

הגדר טווח Y להבדל המוחלט בין ערכים אלה חלקי 10. הגדר את מצב לכידת התמונה לגירוי מופעל, טווח X עד 100 ולחץ על לחצן הגדר פרמטרים פעילים. לחץ על זרם נתונים ולאחר מכן רכוש.

על מנת ללכוד את המידע האזורי של סידן וברייטפילד לכל אורכו של הטרבקולה המוצג כאן, נדרשו שבע תנוחות שריר. נתון זה של הכוח הממוצע מכל אחת מהעמדות שהוצבו מצביע על כך שכוח עווית לא הופרע על ידי תנועה זו, וחשף כי לא הייתה תלות בעמדה של פעולת ייצור הכוח. סריקות אלה שנאספו באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית בקצב של 100 הרץ נותחו באמצעות תוסף ImageJ, Weka.

כל חתך נראה מעוות בשל ההבדל בין הרזולוציות לרוחב ועומק. פעולה זו תוקנה על-ידי שינוי קנה המידה של כל ציר באופן עצמאי ברזולוציה המתאימה לו. לאחר שינוי קנה המידה של C-scan גלם של trabecula, השריר הוא גלילי בקירוב.

ההשתקפות של קיר תא המדידה יכולה לפעמים לחפוף עם נתוני השריר, אבל תוכנת פילוח ניתן לאמן להסביר את זה. לאחר חתך, ניתן לחשב את האזור החתך לאורך השריר לאורך כל העווית. שים לב כי זה trabecula מסוים יש ענף קטן.

תנועת הענף ניכרת בערך באמצע הדרך לאורך הטרבקולה. לבסוף, ניתן להמיר את התמונות המפולח לרשתות כדי לסייע בבניית מודלים גיאומטריים. נתוני הדמיה שנלכדו בכל אחד משבעת המיקומים בקצב של 100 פריימים לשנייה נתפרו יחד כדי ליצור תמונה מלאה אחת של הטרבקולה.

היחס בין הפלואורסצנטיות המושמטת הקשורה לאור העירור של 340 ו-380 ננומטר תואם לסידן התאי לאחר שהטרבקולה נטענת בפורה-2. הממוצע של 10 חולפים סידן תאיים מכל חלון מיושרים עם האזור שהם היו בתמונה. בעוד שיא הארעי עבור trabecula זה נראה עקבי למדי, סידן דיאסטולי מופחת לאורך אורכו.

באופן דומה, התוצאות של מעקב עקירה וחישובי אורך sarcomere גם מצביעים על נוכחות של שונות אזורית. טכניקת המעקב ללא סמן המשמשת מסוגלת לחשב את ההעתקה של כל פיקסל. ההתאמה של הערכות אורך הסרקום נבדקו בהתבסס על הרוחב והמשרעת של ההתאמה הגאוסית לאות FFT.

תנאים אלה לא התקיימו באזור השריר בין אפס ל -500 מיקרון, כך שלא ניתן היה לחשב שם מידע על אורך סרקומר. בהתחשב בתזוזות הנלוות, סביר להניח כי sarcomeres באזור זה התארכו במהלך שלב התכווצות של עווית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לבודד trabeculae לב ולהכין אותם הדמיה multimodal באופן אמין.

תהליך זה קובע מסלול לאיסוף ערכת נתונים הנדרשת לבניית מודלים של אלמנטים סופיים בעלי ידע פיזיולוגי של התכווצות רקמת לב.