Name: ברייטפילד בו זמנית, פלואורסצנטיות והדמיה טומוגרפית קוהרנטית אופטית של התלקחות טרבקולה לב Ex Vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: חקור שילוב של ברייטפילד, פלואורסצנטיות וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית לניתוח תפקוד מכני ודינמיקה יונית של תלקחות לב אקס ויוו בחולדות. שיטה זו מאפשרת הערכה סימולטנית של כוח, סידן ושינויי צורה בשריר הלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מלגות דוקטורט מאוניברסיטת אוקלנד (הוענק ל- JD ו- MC), סר צ'ארלס הרקוס מלגות מחקר בריאות (20/011 ו-21/116) מהמועצה לחקר הבריאות של ניו זילנד (הוענק ל- J-CH ל- KT, בהתאמה), מלגת דוקטורט שהוענקה על ידי קרן הלב הלאומית (הוענקה ל- AA), מענקי התחלה מהירה של מרסדן (UOA1504 ו- UOA1703) מהחברה המלכותית של ניו זילנד (הוענקה ל- J-CH ו- KT, בהתאמה), ומלגת מחקר של ג'יימס קוק מהחברה המלכותית של ניו זילנד (הוענקה ל- AT). הפיתוח המקורי של מכשיר זה מומן על ידי מענק מרסדן (11-UOA-199) מהחברה המלכותית של ניו זילנד (הוענק ל- AT ו- PN).

<ol><li>Han, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+stress+production+in+isolated+cardiac+trabeculae+from+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Energetics of stress production in isolated cardiac trabeculae from the rat.</a> American Journal of Physiology. Heart and circulatory physiology. 299 (5), 1382-1394 (2010).</li>
<li>Ter Keurs, H. E. D. J., Rijnsburger, W. H., Van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+development+and+sarcomere+length+in+rat+cardiac+trabeculae.+Evidence+of+length-dependent+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation.</a> Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).</li>
<li>Shen, X., Cannell, M. B., Ward, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+SR+load+and+pH+regulatory+mechanisms+on+stretch-dependent+Ca2%2B+entry+during+the+slow+force+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Effect of SR load and pH regulatory mechanisms on stretch-dependent Ca2+ entry during the slow force response.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 63, 37-46 (2013).</li>
<li>Dowrick, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+force+response+to+stretch%3A+Controversy+and+contradictions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">The slow force response to stretch: Controversy and contradictions.</a> Acta Physiologica. 226 (1), 13250(2019).</li>
<li>Stuyvers, B. D. M. Y., Miura, M., Ter Keurs, H. E. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diastolic+viscoelastic+properties+of+rat+cardiac+muscle%3B+involvement+of+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Diastolic viscoelastic properties of rat cardiac muscle; involvement of Ca2+.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 13-28 (1997).</li>
<li>Tang, E. J. L. P., Laven, R. C., Hajirassouliha, A., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+displacement+in+isolated+heart+muscle+cells+using+markerless+subpixel+image+registration%5BTitle%5D)+AND+%22Conference+Record+-+IEEE+International+Instrumentation+and+Measurement+Technology+Conference%22%5BJournal%5D)">Measurement of displacement in isolated heart muscle cells using markerless subpixel image registration.</a> Conference Record - IEEE International Instrumentation and Measurement Technology Conference. , (2019).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li>
<li>Cheuk, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+markerless+tracking+of+the+strain+distribution+of+actively+contracting+cardiac+muscle+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">A method for markerless tracking of the strain distribution of actively contracting cardiac muscle preparations.</a> Experimental Mechanics. 61 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Lippok, N., Coen, S., Nielsen, P., Vanholsbeeck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersion+compensation+in+Fourier+domain+optical+coherence+tomography+using+the+fractional+Fourier+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Dispersion compensation in Fourier domain optical coherence tomography using the fractional Fourier transform.</a> Optics Express. 20 (21), 23398(2012).</li>
<li>Cheuk, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-Dimensional+imaging+of+cardiac+trabeculae+contracting+in+vitro+using+gated+OCT%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Four-Dimensional imaging of cardiac trabeculae contracting in vitro using gated OCT.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 64 (1), 218-224 (2017).</li>
<li>Ritland, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+between+refractive+index+and+density+of+a+glass+at+constant+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Ceramic+Society%22%5BJournal%5D)">Relation between refractive index and density of a glass at constant temperature.</a> Journal of the American Ceramic Society. 38 (2), 86-88 (1955).</li>
<li>Tuchina, D. K., Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+glucose+and+glycerol+diffusion+in+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innovative+Optical+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantification of glucose and glycerol diffusion in myocardium.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 8 (3), (2015).</li>
<li>Taberner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamometer+for+nature%27s+engines%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Instrumentation+and+Measurement+Magazine%22%5BJournal%5D)">A dynamometer for nature's engines.</a> IEEE Instrumentation and Measurement Magazine. 22 (2), 10-16 (2019).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trainable+Weka+Segmentation%3A+A+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li>
<li>Jiang, Y., Julian, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacing+rate%2C+halothane%2C+and+BDM+affect+fura+2+reporting+of+%5BCa2%2B%5D%28i%29+in+intact+rat+trabeculae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pacing rate, halothane, and BDM affect fura 2 reporting of [Ca2+](i) in intact rat trabeculae.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273 (6), 2046-2056 (1997).</li>
<li>Miura, M., Boyden, P. A., Ter Keurs, H. E. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+waves+during+triggered+propagated+contractions+in+intact+trabeculae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ca2+ waves during triggered propagated contractions in intact trabeculae.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 274 (1), (1998).</li>
<li>Han, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radius-dependent+decline+of+performance+in+isolated+cardiac+muscle+does+not+reflect+inadequacy+of+diffusive+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Radius-dependent decline of performance in isolated cardiac muscle does not reflect inadequacy of diffusive oxygen supply.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (4), 1222-1236 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במחקר זה, אנו מציגים תצורה המאפשרת הרכבה של שלוש מערכות אופטיות המשלבות ברייטפילד, פלואורסצנטיות והדמיה OCT כדי לאסוף נתונים מטרבקה לבית אקס ויואו (איור 1 ואיור 2). שילוב מתוזמר כזה אפשרי הודות לעיצוב תא המדידה (איור 3) כדי לאפשר את הסידור האורתוגונלי של OCT לציר הפלואורסצנטיות הבהירה. מערכת הרכבת השרירים ממלאת תפקיד חשוב לא פחות בהצלחת כימותים סימולטניים של מדדים מרכזיים באפיון דינמיקת עירור-התכווצות שרירי הלב. החידוש שלו נהדף לאפשר הליכי סריקת שרירים ללא הפרעה נראית לעין לביצועים המכניים של השריר(איור 6). עם תצורת ההדמיה המשולבת ומערכת הקרס הממונע למדידת כוח, מערכת זו יכולה להעריך את ההטרוגניות האזורית באורך הארעי, ההעתקה והסרקום של Ca2+ , יחד עם מידע גיאומטרי מקרוסקופי של טרבקולה מתכווצת לאורך כל מהלך הזמן של העווית (איורים 7 ואיור 8).
בהתחשב בכל מקום של מערכות הדמיה brightfield-epifluorescence בתוך מעבדות מחקר לב, רבייה של תוצאות אלה ניתן להשיג עם כמה שיקולי חומרה קלים. כאן, אנו מציגים את ערכת הכלים לעיבוד תמונה לשילוב של אפיפלואורסצנטיות ברייטפילד ו- OCT, החיונית בניתוח ההטרוגניות התכווצות הבסיסית. השילוב של OCT דורש נתיב אופטי ללא הפרעה, בעוד ההדמיה המגודרת דורשת קו הדק חיצוני בין הגירוי לבין מצלמת ההדמיה OCT ו- Brightfield, ווים להרכבה על השרירים המסוגלים להזיז את הדגימה בכל תא המדידה. התוכנה והשיטות הנדרשות לאחר העיבוד זמינות באופן חופשי. בפרט, תוכנת פילוח בשימוש, WEKA14, הוא קוד פתוח. הטכניקה של מעקב ללא סמן של נקודות חומר 8 ,אורךsarcomere, הדמיה נפחית מגודרת10, וקודי דור רשת נגישים גם הם וניתן להיות זמינים על פי בקשה מהמחבר המתאים.
כדאיות שרירים, טעינה אופטימלית של Fura-2 ומיקוד תמונה הם שלושת העמודים המהווים את היסודות של ניסוי מוצלח. שימוש בתמיסת ביתור המכילה BDM למניעת התכווצות, הובלת השריר במזרק, חמצון מתמשך של הפתרון והכנת פתרונות ניסיוניים חדשים ביום הניסוי, כל אלה תורמים לשיעור כדאיות שרירים גבוה. לפני טעינת trabecula עם Fura-2AM, autofluorescence חייב להיות נאסף עבור כל תנאי אחד מעוניין ללמוד כפי שהוא יכול להיות השפעה משמעותית על Ca2 + ארעי15. חמצון של פתרון טעינת Fura-2AM מסובך על ידי הכללה הכרחית של pluronic-F127 פעילי שטח כדי לסייע טעינת צבע. כדי להילחם היווצרות בועה עודפת שנוצרה הנגרמת על ידי פעילי שטח זה, טיפה קטנה של אנטי קצף בפתרון הטעינה מאפשר למשתמש להגדיל את קצב חמצון, ובכך לשפר את הסיכוי כי trabecula שומר על כדאיות תפקודית לאורך כל תהליך הטעינה. לבסוף, מוקד ההדמיה חייב להיות אחיד לאורך השריר כדי למקסם את יחס האות לרעש של מידע Brightfield ופלואורסצנטיות.
ישנן שתי מגבלות שיש לקחת בחשבון עם השיטות המוצגות כאן. הראשון הוא הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות. בעוד שהרזולוציות המרחביות של הדמיית OCT ו- brightfield גבוהות, הרזולוציה של מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות מוגבלת לאינטגרל של הפלואורסצנטיות מהנפח שנתפס בחלון הדמיה של 540 מיקרומטר על 540 מיקרומטר. יש היקף כדי להגדיל את הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ פלואורסצנטיות באמצעות מצלמת התקן מצמיד טעינה גבוהה, במקום PMT, כדי ללכוד את אות הפלואורסצנטי על חשבון אות ליחס רעש16. השני הוא קוטר הטרבקולה שניתן ללמוד במונחים של אורך סרקומר מדיד ועומק גיאומטרי. גישת החלונות-FFT למחשוב אורך סרקומר מנצלת את היתרון של רזולוציה מרחבית משופרת אך קשורה לחוסן מופחת(איור 8D). במקרים שבהם יש לחקור טרבקולה קודרת או בקוטר גדול, פתירה מחדש של FFT תצטמצם מאוד בשל הניגודיות המופחתת הקשורה לרצועות סרקומריות בדגימות רקמות גדולות יותר. כמו כן, בתוך OCT, השתקפויות הגב מעומק הדמיה של יותר מ 300 מיקרומטר יהיה חלש מדי כדי להיפתר במהלך שלב הפילוח. לפיכך, הטכניקה שלנו מוגבלת trabeculae של קוטר פחות מ 300 מיקרומטר. עם זאת, לא מומלץ ללמוד דגימות קוטר גדול כמו ייתכנו בעיות עם חמצון מפוזר של ליבת השריר במהלך שיעורים גבוהים של גירוי17.
השיטה שלנו מאפשרת הערכה של תפקוד מכני יוני בשיתוף עם גיאומטריית שרירים בשרירים בריאים וחולים, ומספקת גישה חזקה להבנת פיזיולוגיה של שריר הלב, פתופיזיולוגיה ופרמקולוגיה. צינור עיבוד התמונה המתואר כאן מחלץ נתונים שיהיו מכריעים להבנה עמוקה יותר של הטרוגניות מתכווצת. אחת הדרכים למימוש מלא של הפוטנציאל של ערכת נתונים כה עשירה היא בבניית מודלים מתמטיים המשלבים ומפרשים נתונים אלה, ולבצע תחזיות שניתן לבחון באופן ניסיוני באמצעות המכשיר שלנו.

Superfusion של תכשירי רקמת שריר לב מבודדת הוא פרוטוקול סטנדרטי בשימוש נרחב לחקר הפעלה יונית לב ומכניקה1. בפרט, בידוד של trabeculae, מבנים דמויי מוט מקירות החדר, אפשר הערכה של תופעות כולל הפעלה תלוית אורך של התכווצות 2 ,תגובהתלוית מתיחה של התכווצות3,4, וצמיגות דיאסטולית5 של רקמת לב. טר קורס, היוזם של טכניקה זו של superfusing trabeculae מבודד, השתמש בתחילה בשילוב של הדמיית פלואורסצנטיות עבור מדידות Ca2 + עקיפה לייזר לקביעת אורכים סרקומר2,5. מאז מחקרים מוקדמים אלה, זה הפך נפוץ יותר ויותר כדי לחלץ מידע אורך sarcomere עם רזולוציה מרחבית גדולה יותר באמצעות 2D מהר פורייה טרנספורמציה (FFT) מבוסס טכניקות6 על תמונות מיקרוסקופיה Brightfield. שתי מערכות ההדמיה מאפשרות הערכה חלקית של היחסים הבסיסיים בין שחרור Ca2+ לבין ייצור כוח תלוי אורך Sarcomere.
שריר הלב מפוספס, עם פסים גלויים הקשורים סדרה בסיסית של יחידות התכווצות המורכבות חוטים עבים ועבים. האינטראקציה של חוטים מכוננים אלה המרכיבים sarcomeres ביסוד ייצור כוח, אשר מתחיל כדלקמן: אות חשמלי depolarizing, או פוטנציאל פעולה, גורם למתח תלוי L-סוג Ca2 + ערוצים בקרום התא לפתוח; הזרם התאי שלאחר מכן של Ca2+ עורר את שחרורו של Ca2+ מהניתוק הסרקופלסמי (SR), חנות Ca2+ תאית, בתהליך המכונה Ca2+- המושרה Ca2 + שחרור7; עלייה פתאומית זו בריכוז Ca2+ תאיים מננומולאר לטווח מיקרומולרי מאפשרת לייצור כוח להתרחש; Ca2 + משאבות ללא הרף extrude Ca2 + מתוך cytosol בחזרה לתוך SR ותא חוץ תאי; כאשר ריכוז Ca2+ תאיים חוזר לטווח nanomolar, ייצור כוח מפסיק, ואת השריר מרגיע. במהלך ייצור הכוח, הסיבים העבים והדקים המרכיבים מחליקים זה על זה. אורך הסרקום מכתיב את היקף החפיפה היחסי, ולכן את הפוטנציאל לייצור כוח של השריר מקרוסקופי.
במאמר זה, אנו מרחיבים טכניקות הדמיה פלואורסצנטיות-brightfield אלה כדי לכלול טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (OCT). OCT מנצל את העיקרון הפיזי של הפרעה ומסוגל להשיג את העיוות הגיאומטרי של הרקמה כדי להבין את ההטרוגניות התכווצות השריר8. המכשיר שלנו(איור 1)משתמש במערכת OCT (SD-OCT) דומיין ספקטרלי. ב-SD-OCT, מפצל קרן מפצל את האור מדיודה בעלת אורך-על קצרה באורך קוהרנטיות לזרועות ייחוס ומדידה. זרוע הייחוס מכילה מראה קבועה, וזרוע המדידה מכילה גלוונומטר 2D כדי לנווט את האור. אור אחורי שנקטף מהדגימה נאסף ומפריע לאור המוחזר בזרוע הייחוס כדי ליצור דפוס הפרעה. מידע העומק מקודד בתדר השוליים הספקטרליים. כדי לחלץ את המידע, האות מועבר דרך ספקטרומטר ו- FFT הפוך מוחל על התוצאה. האות 1D המתאים מייצג את המבנים בעומקים שונים, המתאימים לשינויים באינדקס שבירה9 (A-scan). על ידי היגוי הלייזר בציר יחיד, ניתן לבנות חתך רוחב של מדגם העניין (B-scan) ובאופן דומה, על ידי חזרה על התהליך בתבנית צעד-חכם בציר הנותר, ניתן ליצור תמונה תלת ממדית (C-scan). בהרחבה, ניתן לאסוף סדרה של סריקות B בפרוסה אחת עבור נושא משתנה בזמן חוזר המבוסס על גורם מפעיל חיצוני ולחזור על הפעולה כדי ליצור סריקה תלת ממדית, המייצגת תמונה מצוענת משתנה בזמן10.
בשילוב שלוש מערכות ההדמיה, שקלנו את שני העקרונות הבאים. ראשית, חיישני הדמיה לא צריכים לזהות אור ממודל הדמיה חלופי, ושנית, העיצוב הפיזי צריך להכיל שטח פנוי לשלושה מטוסי הדמיה בו זמנית לפחות. כדי לענות על הדרישה הראשונה, המיקרוסקופ Brightfield משתמש ב-LED אורך גל של 660 ננומטר כדי להאיר את הדגימה בתצורה הפוכה. מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות נמצא בתצורת אפיפלואורסצנטיות שבה אותה עדשה אובייקטיבית משמשת הן לערעור והן לאוסף של האור הנפלט. לאור העירור יש אורך גל של בין 340 ננומטר ל-380 ננומטר, וצינור פוטומולטיפלייר (PMT) מודד את האור הנפלט באורך גל של 510 ננומטר. זוג מראות דיכרוכיות מאפשרים לשני הנתיבים האופטיים הללו לחלוק את אותה טביעת רגל פיזית מבלי להפריע למדידה ההפוכה (איור 2). לבסוף, OCT משתמש בפס רחב (רוחב ספקטרלי של 100 ננומטר) עם אורך גל מרכזי של 840 ננומטר, בנפרד משתי הדרכים האחרות. בשל האופי הנמוך של האור המשמש ל- OCT, כל אור מפוזר ממקורות הפלואורסצנטיות הבהירה לא יתרום לתבנית ההפרעה המקודדת מידע עומק. עבור הדרישה השנייה, עיצוב הדיור עבור הצינור נימי יש מסלולים אופטיים נגישים למישורים הנעשים, הנחותים והנעלים של המדגם. במהלך ניסויים, שני ווים פלטינה להחזיק trabecula בתוך צינור נימי חדור עם פתרון קרבס-Henseleit מחומצן (KH). ראש הגלוונומטר של ה-OCT מכוון באופן אורתוגונלי למסלול ההדמיה של ברייטפילד-פלואורסצנטי כדי לנצל את המישור האופטי האורתוגונל השלישי(איור 3).
מאמר זה מתאר את שיקולי התכנון לבניית מכשיר המסוגל להדמיה בו זמנית סידן, אורך סרקומר וגיאומטריית שרירים. כדי להדגים את יכולות המדידה הללו, אנו מתארים את תהליך בידוד הטרבקולה בחדר, הכנת פתרונות החיץ הדרושים, יחד עם השלבים הקריטיים הכרוכים בטיפול וטעינת פלואורסצנטיות של אקס ויוו טרבקולה. לבסוף, מאמר זה מתאר את התהליכים הדרושים לתרגום ערכת הנתונים לפריטים חזותיים שימושיים יותר.

<table><tbody><tr><td>2,3-בוטנדיון מונוקסימה</td><td>אקרוס אורגניקס</td><td>150375000</td><td></td></tr><tr><td>20 פעמים; עדשת מיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>CFI סופר פלואור 20 פעמים;</td><td>נא 0.75</td></tr><tr><td>גלוונומטר דו-ממדי</td><td>Thorlabs</td><td>GVSM002/M</td><td></td></tr><tr><td>50-50 מפצל קרן</td><td>Thorlabs</td><td>FC850-40-50-APC</td><td></td></tr><tr><td>90-10 מפצל אלומה</td><td>Thorlabs</td><td>TW850R2A2</td><td></td></tr><tr><td>מודול קלט אנלוגי</td><td>National Instruments</td><td>NI-9205</td><td>מקליט את אות ה-PMT ב-200 קילו-הרץ</td></tr><tr><td>מקור אור הדמיה</td><td>Brightfield CoolLED</td><td>PE-2</td><td>660&nbsp; nm LAM</td></tr><tr><td>מקור אור בפס רחב</td><td>Superlum</td><td>Broadlighter-840</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>כרטיס Cameralink</td><td>National Instruments</td><td>NI-1429</td><td>תופס מסגרת הדמיה Brightfield</td></tr><tr><td>Carbogen 5</td><td>BOC</td><td>קוד גז: 181</td><td></td></tr><tr><td>עדשת עיבוי</td><td>Nikon</td><td>LWD 0.52</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>DAQ</td><td>National Instruments</td><td>NI-6259</td><td>מפעיל את תנועת הגלוונומטר</td></tr><tr><td>מראה דיכרואית 1</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03</td><td></td></tr><tr><td>מראה דיכרואית 2</td><td>Semrock</td><td>FF552-Di02</td><td></td></tr><tr><td>סורג עקיפה</td><td>Wasatch Photonics</td><td>1200 קווים/מ"מ @840 ננומטר</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Direct-Q 3 מערכת UV</td><td>Merck Millipore</td><td>מכונת מים מזוקקים</td><td>ZRQSVR3WW</td></tr> אמבט <tr><td>יבש</td><td>קורנינג</td><td>6875-SB</td><td>LSE אמבט יבש דיגיטלי</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td></td><td>תוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח</td></tr><tr><td>Fura-2AM פנטה-אשלגן מלח</td><td>Thermofisher</td><td>F14186</td><td></td></tr><tr><td>חומרה כרטיס FPGA</td><td>National Instruments</td><td>NI-7813R</td><td>שולט גם בהפעלת לכידת השדה הבהיר</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Pfizer</td><td>61024</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1069</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td> עמוד תאורה <td></td><td>Nikon</td><td>TI-DH</td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>MedSource</td><td>VAPDRUGISO250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת סריקת קו</td><td>Basler</td><td>spL2048-70km</td><td>מצלמת ספקטרומטר</td></tr><tr><td>מערבל מגנטי</td><td>IKA</td><td>3810000</td><td>RCT בסיסי</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>קוד עיבוד נתונים</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>OCT FPGA</td><td>כרטיס National Instruments</td><td>NI-1483R</td><td></td></tr><tr><td>מיכל חמצן</td><td>BOC</td><td>קוד גז: 100D</td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>מטלר טולדו</td><td>MP220</td><td></td></tr><tr><td>צינור פוטו-מכפיל</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422-20</td><td></td></tr><tr><td>Powerload</td><td>Thermofisher</td><td>P10020</td><td></td></tr><tr><td>Superluminescent דיודה</td><td>Broadlighter</td>מגבר טרנס-אימפדנס <td>D-840</td><td></td></tr><tr><td></td><td>מותאם אישית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>חולדת Wistar</td><td>Vernon Jansen יחידה</td><td></td><td>8 &ndash; 10 שבועות</td></tr><tr><td>מנורת קשת קסנון</td><td>מכשיר סאטר</td><td>DG-4</td><td>Lambda DG-4</td></tr></tbody></table>

ברייטפילד בו זמנית, פלואורסצנטיות והדמיה טומוגרפית קוהרנטית אופטית של התלקחות טרבקולה לב ex vivo

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

בשריר הלב, Ca2+ ארעי תאיים להפעיל myofilaments התכווצות, גרימת התכווצות, קיצור מקרוסקופי, ועיוות גיאומטרי. ההבנה שלנו של היחסים הפנימיים בין אירועים אלה הוגבלה מכיוון שאיננו יכולים 'לראות' בתוך השריר ולא לעקוב במדויק אחר הטבע המרחבי-זמני של דינמיקת עירור-התכווצות. כדי לפתור בעיות אלה, בנינו מכשיר המשלב חבילה של שיטות הדמיה. באופן ספציפי, הוא משלב מיקרוסקופ Brightfield כדי למדוד שינויים מקומיים של אורך sarcomere ומתח רקמות, מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לדמיין את Ca2 + ארעי, וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית כדי ללכוד את השינויים הגיאומטריים של הרקמה לאורך הזמן של מחזור הלב. אנו מציגים כאן את תשתית ההדמיה ואת מסגרת איסוף הנתונים המשויכת. נתונים נאספים ממבני רקמות מבודדים דמויי מוט המכונה קרנאה trabeculae. במכשיר שלנו, זוג ווים פלטינה הנשלטים על-ידי מיקום מחזיקים כל קצה של דגימת שריר ex vivo בזמן שהוא מועשר ללא הרף בתמיסת מלח עשירה בחומרים מזינים. הקרסים נמצאים תחת שליטה עצמאית, ומאפשרים שליטה בזמן אמת על אורך השריר וכוח. תרגום אורך מאפשר סריקה חלקה של המדגם, התגברות על מגבלות הקשורות לגודל היחסי של חלון הדמיית המיקרוסקופ (540 מיקרומטר על 540 מיקרומטר) ואורך של טרבקולה טיפוסית (>2000 מיקרומטר). אלקטרודות פלטינה משני קצות תא השרירים מעוררות את הטרבקולה בקצב המוגדר על ידי המשתמש. אנו מנצלים את אות הגירוי כגורם מפעיל לסנכרון הנתונים מכל חלון הדמיה כדי לשחזר את כל העוויתות של הדגימה בתנאי מצב יציב. החלת טכניקות עיבוד תמונה על נתוני הדמיה אלה של Brightfield מספקת עקירת רקמות ומפות אורך סרקומר. אוסף כזה של נתונים, כאשר הוא משולב בצינור מידול ניסויים, יספק הבנה עמוקה יותר של הומוגניות התכווצות שרירים והטרוגניות בפיזיולוגיה ובפתופיזיולוגיה.

על מנת ללכוד את המידע האזורי Ca2+ ו brightfield לכל אורכו של trabecula שהוצג כאן, שבע עמדות שריר נדרשו. איור 6 מצביע על כך שכוח העווית לא הופרע על ידי תנועה זו, וחשף כי לא הייתה תלות בעמדה של ייצור הכוח הפעיל.
סריקות B שנאספו באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית בקצב של 100 הרץ נותחו באמצעות תוסף ImageJ WEKA14 (איור 7A). כל חתך נראה מעוות בשל ההבדל בין הרזולוציות לרוחב (10 מיקרומטר) ועומק (1.73 מיקרומטר (בשריר הלב)). עיוות זה תוקן על-ידי שינוי קנה המידה של ציר העומק של התמונה על-ידי יחס רזולוציית הרזולוציה-עומק לרוחב. איור 7B,C מדגים כי לאחר שינוי קנה המידה של C-scan הגולמי של הטרבקולה הוא גלילי בקירוב בגיאומטריה. ההשתקפות של קיר תא המדידה יכולה לפעמים לחפוף עם נתוני השרירים (איור 7A,B),אך ניתן לאמן את תוכנת הפילוח כדי להסביר זאת (איור 7D,E). לאחר החתך, ניתן לחשב את האזור החתך לאורך השריר לאורך כל העווית(איור 7F). שים לב כי trabecula מסוים זה יש תוספת קטנה המסתעפת ממנו. התנועה של הענף ניכרת ~ 0.75 מ"מ לאורך trabecula. לבסוף, ניתן להמיר את התמונות המפולח לרשתות כדי לסייע בבניית מודלים גיאומטריים(איור 7G).
נתוני הדמיה שנלכדו בכל אחת ממיקומים שונים של טרבקולה בקצב של 100 fps נתפרו יחד כדי ליצור תמונה מלאה אחת של הטרבקולה(איור 8A). הרזולוציה של תמונות אלה היא 0.535 מיקרומטר/פיקסל. השימוש בפונקציות שקלול ליניאריות באזורים החופפים של חלונות שכנים מסייע להדמיה וממזער את ההשפעה של הסצנה הקיימת בתמונות Brightfield. כדי למדוד את האות הפלואורסצנטי, חלון 540 מיקרומטר על 540 מיקרומטר של הטרבקולה מואר באופן מחזורי עם 340 ננומטר, 365 ננומטר ואור אורך גל של 380 ננומטר בקצב של 600 הרץ. היחס בין הפלואורסצנטיות הנפלטת הקשורה לאור העירור של 340 ננומטר ו-380 ננומטר תואם לסידן התאי לאחר שהטרבקולה נטענת ב-Fura-2. מכיוון שמדידה זו היא יחס, קצב המדידה האפקטיבי הוא 200 הרץ. הממוצע (n = 10) ארעי Ca2+ תאיים מכל חלון מיושר עם האזור שהם צולמו (איור 8B). בעוד שיא הארעיים נראה עקבי למדי, הדיאסטולי [Ca2+] נמוך יותר בתוך האזור בין 900 מיקרומטר ל 1800 מיקרומטר לאורך הטרבקולה. באופן דומה, התוצאות של מעקב ההעתקה (איור 8C) וחישובי אורך הסרקום(איור 8D)מצביעים גם הם על נוכחות של שונות אזורית. טכניקת המעקב ללא סמן המשמשת מסוגלת לעבד את ההעתקה של כל פיקסל, בהינתן ניגודיות מספקת. בעת מיפוי ההתפלגות של אורכי sarcomere בדואר, אזור מתאם צולב של 128 פיקסלים על ידי 128 פיקסלים (~ 67 מיקרומטר על 67 מיקרומטר) שימש לחישוב אורך sarcomere אזורי. אזור זה עוטף כ-29 סרקומרים כאשר סגירת המדגם קרובה לאורך סרקומר אופטימלי. גודל השלב (הן בכיווני x והן ב- y-כיוונים) בין המרכז של כל חלון מתאם צולב הוגדר ל- 50 פיקסלים (~ 26 מיקרומטר) לעיבוד נתונים אלה. ההתאמה של הערכות אורך sarcomere נבדקו בהתבסס על הרוחב והמשרעת של ההתאמה הגאוסית לאות FFT. תנאים אלה לא התקיימו באזור השריר בין 0μm ו 500 מיקרומטר ולכן לא ניתן לחשב שם מידע באורך סרקומר. בהתחשב בתזוזות הקשורות, סביר להניח כי sarcomeres באזור זה התארכו במהלך שלב התכווצות. בהתאם לספקולציות אלה, אורכו הממוצע של הסרקום בצד ימין של הטרבקולה מתקצר בתקופה זו. על ידי שילוב המידע המסופק על ידי כל אחד מהלוחות, נראה כי האזור עם האזור החתך הגדול ביותר אינו מייצר את הכוח המשמעותי ביותר. בהנחה כי השונות האזורית של Ca2 + ארעי יש שיפוע חלקה בקירוב, איור 8B מציין כי המשרעת הגדולה ביותר Ca2 + ארעי מתרחש איפשהו בין 1300 מיקרומטר ו 1600 מיקרומטר לאורך trabecula. מפת ההעתקה מציינת שהאזור שעובר את התנועה הנמוכה ביותר מיישר קו עם שיא Ca2+ ארעי. עם זאת, באזור זה יש את האזורים הקטנים ביותר בחתך של המדגם. עם נתונים אלה בחשבון, אפשר להסיק כי אזור זה יצר את הלחץ ביותר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig01.jpg"> איור 1: תמונה ביאורית של הקרדיומיומטר. כל אחד מהרכיבים האופטיים העיקריים הוא מתואר. ה- Inset מכיל תקריב, מבט אחורי, של מטרת המיקרוסקופ במקום, מתחת לתא המדידה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig02.jpg"> איור 2: מסלול אופטי למיקרוסקופיה בו זמנית של ברייטפילד ופלואורסצנטיות. מקור התאורה של מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות הוא מנורת קשת קסנון, שהפלט שלה עובר מחזורית בין 340 ננומטר, 365 ננומטר ואור של 380 ננומטר. נתיב פלט מנורת הקשת מכיל מראה דיכרואית עם אורך גל מנותק של 409 ננומטר המשקף את אור UV על מראה המכווונים את האור למטרה מיקרוסקופ פלואורסצנטית. העדשה ממקדת את אור העירור על המדגם ואוסף את האור הנפלט, אשר יש אורך גל ארוך יותר של 510 ננומטר. אור זה הנפלט עובר דרך המראה הדיכרואית הראשונה, אך לא השנייה, מכיוון שיש לה אורך גל מנותק של 552 ננומטר. לאחר מכן, עדשת שדה ממקדת את האור המוחזרים על החיישן של ה- PMT. בינתיים, מקור התאורה (660 ננומטר LED) עבור מיקרוסקופ Brightfield ממוקם מעל המדגם. האור המועבר מתמקד במדגם על ידי עדשת מרוכז, ומטרת הפלואורסצנטיות × 20 לוכדת את תמונת השידור המתקבלת. אורך הגל המשמש להארה בהירה עולה על אורך הגל החתוך של כל מראה דיכרואית, כך שהוא עובר דרך שניהם לפני שהתמונה מתמקדת בחיישן של מצלמת CMOS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig03.jpg"> איור 3: עיצוב מחזיק תא מדידה. (A)תצוגה איזומטרית של מחזיק תא המדידה עם נתיבים אופטיים. תאורת ברייטפילד מתרחשת מפני השטח המעולים(z-ציר); תאורת פלואורסצנטיות מתרחשת מפני השטח הנחותים(z-ציר), וזרוע המדידה OCT אות הוא אורתוגונל לציר התאורה האחר (ציר y). במהלך הניסוי, שני ווים פלטינה מחזיקים טרבקולה בתוך צינור נימי זכוכית המתפקד כתא המדידה. מנועי סליל קול שולטים בכל וו ומיקומים שלהם נמדדים באמצעות אינטרפרומטריה לייזר. המיקום הנוכחי מושווה לנקודת הגדרה המוגדרת על-ידי המשתמש, ובאמצעות בקר PID המקודד בתוך FPGA, השגיאה ממוזערת. (B)תא מדידה במקום עם תאורת שדה בהיר מופעלת. התצוגה האחורית מוצגת ב- Inset איור 1 . (C)סכמטי של זרימת superfusate דרך מחזיק תא המדידה. Superfusate נכנס לחלק האחורי של הבלוק וזורם בכיוון המצוין על ידי חצים. האלקטרודות במעלה ובמורד הזרם מבססות את גירוי השדה לזיונים של טרבקולה רכובה בתא המדידה. הצללה כחולה מציינת את האזורים שבהם הסופר-מפוזר זורם במהלך ניסוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig04.jpg"> איור 4: הלוח הקדמי של תוכנת רכישת התמונה ובקרת התמונות. (A)ממשק משתמש הדמיה ברייטפילד. (B)ממשק משתמש של הדמיית OCT. (C)ממשק משתמש של בקרת חומרה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig05.jpg"> איור 5: ניתוח טרבקולה ופרוטוקול הרכבה. (א)לב עכברוש חדיר לנגנדורף בתא הניתוח. (ב) אותו לב עם האטריה הוסרה. קווים מקווקווים מציינים את מסלול כריתת הצואה כדי לפתוח את החדרים. (ג)לב פתוח כדי לחשוף את הפנים של שני החדרים. התיבה המקווקות מציינת את האזור שבו נמצאים בדרך כלל טרבקולה. (D)אזור קיר חדר ימני שנמחה (זהה לזה שצוין בתיבה המקווקות ב- C). קווים מקווקווים מדגישים שלושה טרבקולה. (ה)טרבקולה שנבחרה מהשלושה ב- D. (ו)הטרבקולה מלוח E עם רקמת הקיר הוסרה. (G)הטרבקולה המבודדת בסוף מזרק של 1 מ"ל. (ח)הטרבקולה בתא הרכבה. הטרבקולהרכובה בין שני קרסי פלטינה. הטרבקולה, המותקנת בין ווים, בתוך תא המדידה(איור 3B). הנקודה הירוקה היא חפץ מהמסנן הדיכרי הראשון. (K)זווית משנית של הטרבקולה המותקנת בתוך תא המדידה. המרחק בין הטרבקולה לעדשת המטרה של המיקרוסקופ הוא כ-1 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig06.jpg"> איור 6: מיקום התלות במדידת הכוח. הכוח המיוצר על ידי השריר מכל אחת ממיקומים הדמיה (n = 7) overlaided. ייצור הכוח הפעיל הממוצע היה 0.527 mN ± 0.003 mN, זמן להתכווצות 50 % 77.1 ms ± 0.3 ms, וזמן ל 50 % הרפיה 328.1 ms ± 0.9 ms (כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2.jpg"> איור 7: ניתוח הדמיה OCT. (A)דוגמה לפילוח WEKA. חתך הרוחב של השריר מודגש באדום, והרקע מודגש בירוק. (B)תצוגה מעולה של נתוני סריקת C גולמיים של טרבקולה. הקו הזוויתי הבהיר לכיוון החלק העליון של התמונה הוא ההשתקפות של קיר תא המדידה. (C)מבט רוחבי של נתוני סריקת C גולמיים של טרבקולה. (D)תצוגה מעולה של נתוני OCT המפולחים. (ה)תצוגה לרוחב של נתוני OCT המפולחים. (F)האזור החתך לאורך הטרבקולה(ציר x)לאורך זמן(ציר y). האזור החתך הממוצע לאורך אורך השריר היה 0.0326 מ"מ2 ± 0.0005 מ"מ2 (ממוצע ± S.E.) (ז)רשת של הטרבקולה. רשת המערכת כבר מיושר בקירב עם חלקת שטח חתך של לוח F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2lage.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig08.jpg"> איור 8: ניתוח הדמיית ברייטפילד ופלואורסצנטיות. (A)תמונה תפורה (שבעה חלונות הדמיה) של הטרבקולה. (B)כ- 2 + ארעי לאורך הטרבקולה. (C)עקירת xממוצעת מכל חלון הדמיה. תזוזה חיובית מייצגת תנועה ימינה ושלילית שמאלה. (D)אורכים סרקומריים ממוצעים מכל חלון הדמיה עם ניגודיות התמונה הדרושה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: רשימת הפתרונות <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/Tables_of_solutions.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

פרוטוקול זה מציג אוסף של נתונים גיאומטריים סרקומר, סידן ומקרוסקופיים מ trabecula ex vivoמתכווצת באופן פעיל . מדידות סימולטניות אלה מתאפשרות על ידי שילוב של שלוש שיטות הדמיה.

ברייטפילד בו זמנית, פלואורסצנטיות והדמיה טומוגרפית קוהרנטית אופטית של התלקחות טרבקולה לב Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שילוב של שלוש מערכות הדמיה במכשיר יחיד, המאפשר מדידה סימולטנית של הפונקציה המכנית, הדינמיקה היונית והשינוי הגיאומטרי של רקמת הלב המתכווצת. באופן ספציפי, אנו מודדים את ייצור הכוח של הרקמה, סידן ארעי, עקירות מקומיות ושינוי צורה. שילוב של שיטות הדמיה אלה יכול לעזור לענות על שאלות מרכזיות במחלות לב, עם השלכות משמעותיות על פיתוח אסטרטגיות טיפול יעילות.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו ללמוד את ההטרוגניות של פעילות השרירים. ההתקן המשמש בפרוטוקול זה מכיל שלוש מערכות הדמיה המסוגלות להדמיה של אותה דגימה, מיקרוסקופ ברייטפילד, מיקרוסקופ פלואורסצנטי וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית. סדרה של מראות דיכרואיות משמשות להפרדת פליטת הפלואורסצנטיות לבין תמונת השידור של Brightfield.התכונות הבסיסיות של התקן זה הן שני ווים להרכבה המופעלים באופן עצמאי, תא מדידה עם שלושה צירים ברורים אופטית וקו הדק חיצוני המסנכרן את מצלמות Brightfield ו- OCT עם ממריץ. בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד לבודד, להכין ולדמות טרבקולה לבבית ולהציג כמה תוצאות מייצגות. לאחר כריתת לב מעכברוש מרדים, העבר אותו לתא הניתוח.בעזרת שני מלקחיים מעוקלים, משכו את צינור העורקים מעל צינורית ההזדוה. החזק את העורקים במקום עם כוח אחד. בינתיים, פתח את קו הצינורות כדי לאפשר פתרון ניתוח לזרום דרך צינורית זלוף.ברגע vasculature הכלילי הוא פינה של דם ואת הלב הוא perfused לחלוטין עם פתרון ביתור, לאבטח את aorta במקום באמצעות תפר. מקם את הלב על ידי סיבוב הצינורית כך העורק הכלילי השמאלי נראה על פני השטח מעולה. הצמידו את פסגת הלב לתחתית תא הניתוח.תנתק את שניהם אטריה. חותכים לאורך הצד הימני של המחיצה לשיא הלב. הצמידו את החדר השמאלי הפתוח לבסיס תא הניתוח.לאחר מכן, חיתוך לאורך הצד השמאלי של המחיצה, לפתוח את החדר הימני להצמיד אותו לבסיס של תא הניתוח, מדי. זהה טרבקולה חופשית בחדר הימני. בעזרת מספריים קפיץ ומלקחיים, חותכים את רקמת הקיר המקיפה את הטרבקולה.לאחר מכן, לחתוך את רקמת הקיר לשניים, אורתוגונל לכיוון הטרבקולה. לקצץ את רקמת הקיר עד הממד שלה מתאים לתצורת הרכבה בשימוש. תשאיר את הטרבקולה הנקרה בתא הניתוח.לשטוף מים חמים, מים מזוקקים, ולאחר מכן פתרון superfusate דרך תא המדידה. הפעל את מקור האור של המיקרוסקופ הבהיר והקש F1 כדי לאפשר לכידה. כוונן ידנית את הוו במורד הזרם עד שהוא ירוכז בתמונת Brightfield.לחץ על ציר אפס במורד הזרם ולאחר מכן הפוך במורד הזרם ללא זמין כדי להפוך את המנוע לזמין. הזז את מחוון נקודת ההזזה במורד הזרם עד שסוף הוו יתיישר לקצה אזור העניין המוגדר כברירת מחדל. אפס מחדש את ציר הזרם במורד ולאחר מכן הזז את מחוון נקודת הזרם במורד ל- 1,000.חזור על התהליך עם ה- hook במעלה הזרם, אך אל תזיז את מחוון נקודת ההפעלה במעלה הזרם לאחר אפס מחדש של הציר במעלה הזרם. לחץ על העבר להרכבה. הפעל את מערכת תאורת הפלואורסצנטיות על-ידי החלפת מתג המנורה לפני שתפעיל במהירות את מערכות המשנה של הבקר על-ידי החלפת המתג הראשי.החלף את המצב התפעולי לריקת טורבו על-ידי לחיצה על לחצן המצב בלוח הקדמי, ואחריו שניים ולאחר מכן אחד. לחץ על לחצן מקוון כדי להפוך שליטה חיצונית לזמינה. השהה את זרימת העל דרך תא המדידה.מלאו את תא ההרכבה בפתרון ביתור. באמצעות מזרק של מיליליטר אחד, העבירו את הטרבקולה מתא הניתוח לתא הרכבה. אפשר לטרבקולה לרדת לתא הרכבה באמצעות כוח המשיכה.הורידו את רמת הנוזל בתא הרכבה כך שהם ישרים עם החלק האמצעי של הקרסים. התאם את המרחק בין הווים כדי לשקף את אורך המרווח של הטרבקולה על-ידי הזזת מחוון נקודת ההסטה במורד הזרם. באמצעות מיקרוסקופ כדי לסייע בהדמיה, לאחוז קלות את אחת מחתיכות רקמת הקצה במלקחיים ולהרכיב אותה על הוו במעלה הזרם.הר את החתיכה השנייה של רקמת הקצה על הקרס במורד הזרם. לאחר רכוב מאובטח, להעביר את trabecula בחזרה לתא המדידה על ידי לחיצה על לעבור לתא ולחדש את זרימת superfusate. הגדר את תדירות הגירוי לאחד, משך גירוי ל 10, מתח גירוי ל 10.התחל גירוי על ידי לחיצה על גירוי על. הפעל את מערכת התאורה של הבהירות. הקש F1 ובחר אזור עניין המקיף אזור מפוסן בממשק המשתמש.לחץ על חשב אורך סרקומר כדי לחשב את אורך הסרקום הממוצע באזור המסומן. להגדיל את אורך השריר עד אורך sarcomere הממוצע הוא כ 2.32 מיקרון. הזז את השריר על-ידי התאמת מחוון נקודת הקבע המרכזית בכרטיסיה מרכז ופקד הפרדה כך שקצה הוו במורד הזרם יהיה גלוי רק בתמונת הבהירות.לאסוף את מידע פלואורסצנטיות עבור 10 עוויתות. הגדל את ערך נקודת המרכז ב- 200 ואסוף מידע פלואורסצנטי נוסף בשווי 10 עוויתות. חזור על תהליך זה עד שתמונת Brightfield תכילה את הוו במעלה הזרם.לאסוף את שווה של החלון הסופי של מידע פלואורסצנטיות. החזר את הטרבקולה למיקום מרכזי על-ידי הגדרת ערך נקודת הקבע המרכזית לאפס. הפחיתו את תדר הגירוי ל-0.2 הרץ ועברו מסופרפוזאט K-H לפתרון הטעינה Fura-2.מדוד את אות הפלואורסצנטיות כל 10 דקות. דמיין את האות בכרטיסיית אות PMT. לאחר אות 360 ננומטר גדל על ידי גורם של 10, להחזיר את תדר הגירוי הרץ אחד ולעבור בחזרה לפתרון סופר-פוסאט K-H.בדוק את מדידת היחס כל 10 דקות עד שהאות מתייצב, ובשלב זה, איסוף הנתונים יכול להתחיל. החזר את השריר למצב שבו הקצה של וו במורד הזרם הוא רק נוכח בתוך התמונה Brightfield. לכוד מידע פלואורסצנטי על ידי לחיצה על הפעל מקור פלואורסצנטי.התחל להזרים נתוני חומרה. בממשק המשתמש של הדמיית Brightfield, הגדר את מצב הלכידה לגורם מפעיל חיצוני, הגדל את קצב הפריימים ל- 100 הרץ והגדר את מספר התמונות ללכידה ל- 100. לחץ על Control-shift-S, ואחריו F1, כדי להקליט את נתוני ההדמיה של Brightfield עבור חלון זה.הגדל את ערך נקודת הקבע המרכזית ב- 200 וחזור על תהליך לכידת Brightfield. המשך בפרוטוקול הסריקה עד לאיסוף נתוני ההדמיה עבור החלון הסופי. החזר את הטרבקולה למיקום מרכזי על-ידי הגדרת ערך נקודת הקבע המרכזית לאפס.הפעל את מקור התאורה OCT על-ידי סיבוב המקש הראשי, לחיצה על לחצן ההפעלה ולאחריו לחצן SLDs. כסו את ראש הגלוונומטר ולחצו על 'קבל רקע' כדי למדוד את תבנית ההפרעה ברקע ולהפחית אותה מהמדידה. הגדר את מצב לכידת התמונה לתצוגה חיה.מרכז את הטרבקולה בצירי X ו- Y על-ידי התאמת ערכי היסט X ו- Y. כאשר הטרבקולה ממורכזת, סרוק לאורך ציר ה- y על-ידי התאמת מיקום ה- Y כדי למצוא את המיקומים המתאימים לווים במעלה הזרם ובמורד הזרם. שים לב למיקומים אלה כלפי מטה.הגדר טווח Y להבדל המוחלט בין ערכים אלה חלקי 10. הגדר את מצב לכידת התמונה לגירוי מופעל, טווח X עד 100 ולחץ על לחצן הגדר פרמטרים פעילים. לחץ על זרם נתונים ולאחר מכן רכוש.על מנת ללכוד את המידע האזורי של סידן וברייטפילד לכל אורכו של הטרבקולה המוצג כאן, נדרשו שבע תנוחות שריר. נתון זה של הכוח הממוצע מכל אחת מהעמדות שהוצבו מצביע על כך שכוח עווית לא הופרע על ידי תנועה זו, וחשף כי לא הייתה תלות בעמדה של פעולת ייצור הכוח. סריקות אלה שנאספו באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית בקצב של 100 הרץ נותחו באמצעות תוסף ImageJ, Weka.כל חתך נראה מעוות בשל ההבדל בין הרזולוציות לרוחב ועומק. פעולה זו תוקנה על-ידי שינוי קנה המידה של כל ציר באופן עצמאי ברזולוציה המתאימה לו. לאחר שינוי קנה המידה של C-scan גלם של trabecula, השריר הוא גלילי בקירוב.ההשתקפות של קיר תא המדידה יכולה לפעמים לחפוף עם נתוני השריר, אבל תוכנת פילוח ניתן לאמן להסביר את זה. לאחר חתך, ניתן לחשב את האזור החתך לאורך השריר לאורך כל העווית. שים לב כי זה trabecula מסוים יש ענף קטן.תנועת הענף ניכרת בערך באמצע הדרך לאורך הטרבקולה. לבסוף, ניתן להמיר את התמונות המפולח לרשתות כדי לסייע בבניית מודלים גיאומטריים. נתוני הדמיה שנלכדו בכל אחד משבעת המיקומים בקצב של 100 פריימים לשנייה נתפרו יחד כדי ליצור תמונה מלאה אחת של הטרבקולה.היחס בין הפלואורסצנטיות המושמטת הקשורה לאור העירור של 340 ו-380 ננומטר תואם לסידן התאי לאחר שהטרבקולה נטענת בפורה-2. הממוצע של 10 חולפים סידן תאיים מכל חלון מיושרים עם האזור שהם היו בתמונה. בעוד שיא הארעי עבור trabecula זה נראה עקבי למדי, סידן דיאסטולי מופחת לאורך אורכו.באופן דומה, התוצאות של מעקב עקירה וחישובי אורך sarcomere גם מצביעים על נוכחות של שונות אזורית. טכניקת המעקב ללא סמן המשמשת מסוגלת לחשב את ההעתקה של כל פיקסל. ההתאמה של הערכות אורך הסרקום נבדקו בהתבסס על הרוחב והמשרעת של ההתאמה הגאוסית לאות FFT.תנאים אלה לא התקיימו באזור השריר בין אפס ל -500 מיקרון, כך שלא ניתן היה לחשב שם מידע על אורך סרקומר. בהתחשב בתזוזות הנלוות, סביר להניח כי sarcomeres באזור זה התארכו במהלך שלב התכווצות של עווית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לבודד trabeculae לב ולהכין אותם הדמיה multimodal באופן אמין.תהליך זה קובע מסלול לאיסוף ערכת נתונים הנדרשת לבניית מודלים של אלמנטים סופיים בעלי ידע פיזיולוגי של התכווצות רקמת לב.

simultaneous-brightfield-fluorescence-optical-coherence-tomographic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מאמר זה מתאר טכניקה גבוהה ברזולוציה של זמן ומרחב התנועה תמונה אופטית פעולה פוטנציאל על פני השטח של Langendorff-perfused הלבבות חולדה באמצעות צבע פוטנציומטרית (di-8-ANEPPS).

מיפוי אופטי של Langendorff-perfused לבבות עכברוש

אנו מציעים גישה מנורמל נולד עבור טומוגרפיה הקרנה אופטי (BnOPT) אשר מהווה את מאפייני הקליטה של ​​דגימות צילמו להשיג מדויק כמותי שחזורים הקרינה טומוגרפית. אנו משתמשים באלגוריתם המוצע לשחזר את התפלגות הקרינה בדיקה מולקולרית בתוך איברי חיה קטנה.

נורמליזציה נולד עבור טומוגרפיה Fluorescence הקרנה אופטית עבור הדמיה בלב שלם

דוח זה מספק תיאור מפורט של המתודולוגיה ואת התוצאות של מיפוי אופטי סימולטני endocardial ו epicardial של עירור חשמלי של אטריום נותר בשלמותו הלב Langendorff-perfused כבשה במהלך פרפור פרוזדורי למתוח-Induced.

ברזולוציה גבוהה מיפוי אופטי Endocardial ו Epicardial במודל הכבשים של פרפור פרוזדורי למתוח-induced

מאמר זה מתאר את ההליכים הבסיסיים לעריכת ניסויים מיפוי אופטי בלב Langendorff-perfused הארנב באמצעות מערכת הדמיה פנורמית, ואת שיטת כפול (מתח סידן) הדמיה.

Multiparametric מיפוי אופטי של הלב Langendorff-perfused הארנב

פרוטוקול זה מתאר את היישום של ניאון בשילוב האינפרה-אדום הקרוב (NIRF) הדמיה וטומוגרפיה-מחושב מיקרו (microCT) המאפשר הדמיה thromboemboli מוחין. טכניקה זו מאפשרת כימות של נטל פקיק ואבולוציה. טכניקת דימות NIRF מדמיינת שכותרתו fluorescently פקיק במוח הניכר, ואילו טכניקת microCT מדמיינת פקיק בתוך חיות בעלות באמצעות-חלקיקי זהב.

משולב האינפרה-אדום הקרוב הדמיה פלורסנט וטומוגרפיה-מחושב מיקרו ישירות חזותי מוחין Thromboemboli

בלב, אירועים מולקולריים לתאם את פונקצית חשמל התכווצות של האיבר. סט של טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה מקומיות הציגו כאן מאפשר ההקלטה של ​​משתני הסלולר לבבות שלמים. זיהוי מנגנונים בהגדרת תפקוד הלב הוא קריטי להבנה כיצד הלב עובד תחת מצבים פתולוגיים.

בשדה מקומי מיקרוסקופ פלואורסצנטי: הדמיה איתותי הסלולר לבבות שלמים

מטרת מחקר זה הייתה ליצור שיטה לחקירת דינמיקה קרדיולוגית באמצעות מודל בעלי חיים טרנסלבותית. הגישה הניסיונית המתוארת משלבת אופקרדיוגרפיה כפולה בשילוב עם מחקר אלקטרולוגי להערכת פעילות החשמל במודל לב פורצין מבודד, שלם.

אופקרדיוגרפיה ולימודי אלקטרופיזיולוגיה של לשעבר Vivo נגדורף

אנו מדווחים על שיטה לשחזור מזוסקופי של לב העכבר כולו על ידי שילוב של התקדמות חדשה בטרנספורמציה וצביעה של רקמות עם פיתוח של מיקרוסקופ אור סרוק אקסיאלי.

הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תמונות טומוגרפיה ממוחשבות מיקרו ברזולוציה גבוהה של לבבות שלמים של יונקים גדולים בריאים ופתולוגיים עם שיפור ניגודיות סלקטיבית של קולגן.

טכניקות הכנת רקמות להדמיית טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו משופרת ניגודיות של מודלים לבביים של יונקים גדולים עם מחלות כרוניות

הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופ מתקדם של יריעות אור יחד עם שיטות מותאמות לניקוי רקמות כדי לחקור מבנים לבביים מורכבים בלבבות מכרסמים, טומן בחובו פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש.

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

שחזור תלת מימדי (תלת מימדי) של נזק לבבי באוטם שריר הלב החריף (repAMI) מאפשר כימות נאמן ולוקליזציה משותפת של דפוסים המשפיעים על המחלה הקשורים. כאן, ניתנת גישת הדמיה מונחית יריעת אור אוטומטית למדידה בו-זמנית של נזק לבבי, אזור בסיכון ותגובת תאי חיסון.

ניתוח תלת מימד סימולטני של נזק לבבי ותגובה חיסונית באוטם שריר הלב החריף באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור

חקור שילוב של ברייטפילד, פלואורסצנטיות וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית לניתוח תפקוד מכני ודינמיקה יונית של תלקחות לב אקס ויוו בחולדות. שיטה זו מאפשרת הערכה סימולטנית של כוח, סידן ושינויי צורה בשריר הלב.

ברייטפילד בו זמנית, פלואורסצנטיות והדמיה טומוגרפית קוהרנטית אופטית של התלקחות טרבקולה לב Ex Vivo

גלה סרטונים נוספים