טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה מסתגלת באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC)

שיטה זו יכולה לסייע בפתרון הבעיות בשיטות הטיפוח המיקרוביאליות הקונבנציונליות. הוא מספק פלטפורמה ניסיונית זולה, ידידותית לתפעול ואמינה לתוצאה לטיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ולאבולוציה אדפטיבית. טכנולוגיה זו הופכת את הפעילות לאוטומטית ומפחיתה יותר את צריכת העבודה.

ובמקביל, יש לו ביצועי תרבות טובים עם תוצאות אמינות ופעולות פשוטות. הטכנולוגיה משמשת בעיקר בתחומי המחקר המיקרוביולוגיים, כגון מדידת עקומת גדילה, אבולוציה אדפטיבית במעבדה וניתוח רב-שכבתי של גורם יחיד. התחל את ההכנות של הניסוי על ידי חיבור מחט המזרק עם קוטר פנימי של 0.41 מילימטרים וקוטר חיצוני של 0.71 מילימטרים למחבר מהיר A ובקבוק ריאגנט.

לאחר מכן autoclaave כל הציוד ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. כדי להתקין את השבב המיקרופלואידי, פתח את דלת תא ההפעלה והרם את בדיקת הסיבים האופטיים. לאחר יישור חורי השדה החשמלי עם המחטים, הניחו בעדינות את השבב על מעמד השבב, ואז הכניסו את שני עמודי המיקום לחורי המיקום והניחו את בדיקת הסיבים האופטיים.

לאחר מכן, חבר את המחבר המהיר A על השבב ליציאה המתאימה של מערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית או MMC בהתאם למספר המיקום כמתואר בכתב היד. בסיום, סגרו את דלת תא הניתוח. דיללו את ההשעיה המתורבתת של Escherichia coli MG1655 עם המדיום ל-OD600 של 0.05 עד 0.1 כדי להשיג 10 מיליליטרים של תמיסת חיידקים ראשונית.

כדי לאתחל את MMC, לחץ על הכרטיסיה אתחול. כאשר ממשק האתחול מופיע, הגדר את טמפרטורת הטיפוח כ- 37 מעלות צלזיוס ואת ערך האות הפוטואלקטרי כ- 0.6. האתחול יימשך כ-20 דקות.

מאוחר יותר, הניחו בקבוק ריאגנט מעוקר על הספסל הנקי והידקו את הפקק. השתמש במזרק סטרילי של 10 מיליליטרים כדי להזריק שלושה עד חמישה מיליליטרים של שמן MMC ממחט המזרק לצינור הצדדי לתוך בקבוק המגיב. לאחר מכן הטו וסובבו את בקבוק המגיב באיטיות כדי לגרום לשמן לחדור במלואו לקיר הפנימי.

לאחר הזרקת חמישה מיליליטרים של תמיסת חיידקים ראשונית לבקבוק, מלאו את בקבוק הריאזנט על ידי הזרקת חמישה עד שבעה מיליליטרים של שמן MMC. שלף את המחבר המהיר העצמאי A של בקבוק הריאגנט והכנס את המחבר המהיר A למחבר המהיר של הבקבוק B כדי להשלים את פעולת ההזרקה לדוגמה. לאחר שתסיים, פתח את דלת תא הניתוח כדי להכניס את בקבוק המגיבים לאמבטיית המתכת.

שלף את מחבר C2 של השבב ואת המחבר המהיר A של בקבוק המגיב. חבר את מחבר הצינור הצדדי של בקבוק המגיב למחבר C2 ואת מחבר הצינור העליון למחבר O2. לאחר מכן סגרו את דלת תא הניתוח.

כדי לבחור את הפונקציה של מדידת עקומת גדילה, לחץ על עקומת גדילה בממשק הגדרת הפרמטרים הזן את המספר כ- 15. לאחר מכן הפעל את מתג זיהוי ה- OD והגדר את אורך הגל כ- 600 ננומטר. לחץ על הכרטיסיה התחל כדי להתחיל יצירת טיפות.

השלמת התהליך תארך 15 דקות. כאשר חלון קופץ מופיע בממשק הראשי ומבקש הודעה, פתח את דלת תא ההפעלה כדי להוציא את בקבוק המגיב ולחבר את מחברי C2 ו- O2. לאחר סגירת הדלת, לחץ על הלחצן אישור בחלון הקופץ כדי לטפח באופן אוטומטי את הטיפות ולזהות את ערכי ה- OD.

כאשר עקומת הגדילה מגיעה לשלב הנייח, לחץ על לחצן ייצוא נתונים כדי לייצא את נתוני ה- OD. בחר בנתיב שמירת הנתונים וייצא את ערך ה- OD שנרשם במהלך תקופת הטיפוח בתבנית CVS כדי להתוות את עקומת הצמיחה, השתמש בתוכנת מיפוי כגון Excel ו- Origin 9.0. הזריקו את הנפחים הנדרשים של תמיסת החיידקים הראשונית, המדיום הטרי ושמן ה-MMC לתוך בקבוקי המגיבים המעוקרים הנפרדים לתמיסת החיידקים הראשונית במדיום הטרי כפי שהוסבר קודם לכן.

כדי לבחור את הפונקציה של אבולוציה אדפטיבית, לחץ על ALE בתוכנה. בממשק הגדרת הפרמטרים, הפעל את מתג זיהוי ה- OD ולאחר מכן הגדר את כל הפרמטרים המתוארים בכתב היד ולחץ על הכרטיסיה התחל כדי להתחיל יצירת טיפות. התהליך יימשך כ-25 דקות.

במהלך כל תקופת תת-טיפוח, שים לב אם ערכי ה- OD המרביים של הטיפות גדלו באופן משמעותי. אם הגידול מתרחש ועומד בדרישות הניסוי, לחץ על לחצן ייצוא הנתונים כדי לייצא את נתוני ה- OD. כדי לחלץ את טיפות היעד מה- MMC, לחץ על הכרטיסיה הקרנה כדי לבחור את הפונקציה של חילוץ טיפות.

לאחר מכן בחר באפשרות איסוף ולחץ על מספרי טיפות היעד. בסיום, לחץ על אישור. המתן עד שהחלון המוקפץ יבקש הודעה. לאחר מכן הכניס את המחבר המהיר של CF לצינור microcentrifuge לאיסוף ולחץ על אישור. לאחר דקה עד שתי דקות שבהן ממשק התוכנה יופיע חלון חדש שיבקש הודעה, הכנס את המחבר המהיר של CF בחזרה ולחץ על אישור כדי לגרום ל- MMC להמשיך לפעול.

כאשר טיפת היעד הבאה מגיעה לאתר זיהוי הטיפות, אסוף אותה כפי שצוין קודם לכן. השתמשו בפיפטה של 2.5 מיקרוליטר כדי להוציא ולהניח את הטיפה על צלחת מוצקה של 90 מילימטר, ולאחר מכן פזרו את הטיפה באופן שווה עם מוט מצופה משולש זכוכית עם אורך צדדי של שלושה סנטימטרים, ואז טפחו את הטיפה באינקובטור טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. מאוחר יותר, בחרו שלוש עד חמש מושבות עצמאיות של חיידקים כדי לטפח כל מושבה בנפרד בבקבוק שייק שייק של 50 מיליליטר עם 10 מיליליטר של מדיום טרי באינקובטור רועד בקצב של 200 סיבובים לדקה ו-37 מעלות צלזיוס למשך 48 עד 72 שעות.

לאחר הדגירה, יש לעקוב אחר התקנות הסטנדרטיות הקשורות כדי לאחסן את תמיסת החיידקים המתורבתים בצינור הגליצרול. הניתוח הייצוגי מראה את עקומות הגדילה של 50 טיפות בכל תהליך האבולוציה ההסתגלותי. נצפה כי זן המתנול החיוני Escherichia coli או MeSV2.2 הציג צמיחה איטית ראשונית ואחריה צמיחה מהירה.

עקומת הגדילה של טיפה שש בכל תהליך האבולוציה ההסתגלותי תוכננה בנפרד. הערך המרבי של OD600 בדור הראשון היה 0.37, שעלה ל-0.58 בתקופת התת-טיפוח האחרונה, מה שמעיד על כך שהזן בטיפות שש הבין אבולוציה אדפטיבית ברורה. יתר על כן, הושוו עקומות הגדילה של זן הטיפות שש והמתח הראשוני.

זן הטיפות שש הפגין קצב גדילה וריכוז תאים ספציפיים מקסימליים גבוהים יותר בשלב הנייח מאשר הזן הראשוני. הדבר החשוב ביותר הוא להבטיח כי החיבור של שבב המכשיר ואת בקבוק המגיב הוא נכון, וזה הטיפות עבור פעולות להמשיך כרגיל. שיטה זו מספקת לחוקרים רעיון חדש לגידול מיקרואורגניזמים וגם מספקת פלטפורמה יעילה ובעלות נמוכה לאבולוציה מסתגלת של זנים.