אבלציות נפח עמוקות ומבוקרות מרחביות באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטון בגסטרולה דג הזברה
July 15th, 2021
התפתחות עוברית דורשת תיאום בקנה מידה גדול של תנועת תאים. אבלציה תלת-ממדית של עירור דו-פוטון מאפשרת אבלציה תלת-ממדית מבוקרת מרחבית של קבוצות גדולות של תאים עמוקים. בנוסף, טכניקה זו יכולה לחקור את התגובה של תאים נודדים באופן קולקטיבי ב vivo להסתבכויות בסביבה המכנית שלהם.
בתוך העוברים, תאים מתקשרים זה עם זה, מחליפים מידע כימי ומכאני. אחת ה דרך יעילה לבחן אינטראקציות אלה היא להרוג תאים מסוימים ולנטר את ההשלכות על תאים שכנים. השיטה שאנו מתארים מאפשרת לנו לנפח במדויק תאים, אפילו בתוך העובר, מבלי לפגוע ברקמות השכנות.
הכן את המיקרוסקופ הדו-פוטוני על ידי הגדרת הלייזר הראשון לאורך הגל אבלציה 820 ננומטר, ואת הלייזר השני אל אורך הגל הדמיה mCherry 1, 160 ננומטר. באמצעות מראות ניידות בנתיב האופטי, יישר את שתי קרני הלייזר בכניסה וביציאה של ראשי הסריקה, ולאחר מכן מדוד את העוצמה המרבית של הלייזר הראשון ב- 820 ננומטר. מקם את מד הכוח מתחת למטרה, סגור את התא השחור והגדר את כוח הלייזר הראשון ל- 100%התחל איסוף נתונים במד הכוח, פתח את תריס הלייזר ולאחר מכן מדוד את עוצמת הפלט וחשב את אחוז כוח הלייזר הדרוש כדי להגיע ל- 300 מילי וואט.
הגדר את הלייזר הראשון לאורך גל העירור GFP של 920 ננומטר וכוח ל- 7%התאם את כוח הלייזר השני ל- 15%הפעל את גלאי ה- PMT עבור קווים ירוקים ואדומים, והגדר רגישות PMT של קו ירוק ואדום ל- 65. התאם את שדה הראייה ל- 400 על 400 מיקרומטר, רזולוציית תמונה ל- 512 על 512 פיקסלים ותדר סריקה ל- 800 הרץ. בחר מצב הדמיה של זמן 3D ולאחר מכן צור תיקיה והפעל שמירה אוטומטית לשמירת נתונים לאחר כל רכישה.
להרכיב את תא החימום ולהגדיר אותו 28 מעלות צלזיוס. המתן לפחות 10 דקות עד שהאולם והמטרה להתחמם. תחת סטריאמפיקוסקופ פלואורסצנטי, לזהות עוברים ב 70% epiboly להביע GFP.
באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק, מעבירים שלושה עד ארבעה עוברים נבחרים בצלחת מצופה אגרוז ומניחים אותם בקפידה במלקחיים עדינים. ב בקבוקון זכוכית קטן, להוסיף מיליליטר אחד של פתרון של פניצילין-סטרפטומיצין בינוני המכיל 2%agarose, ומניחים את בקבוקון בתנור בלוק מחומם מראש, יבש ב 42 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטה זכוכית מלוטשת אש, להעביר עובר dechorionated ל בקבוקון, דואג לא להוסיף מדי מדיום עובר לאגרוז.
יש להשליך את מדיום העובר הנותר מהפיפטה. שאפו את העובר בחזרה, יחד עם מספיק אגרוז כדי לכסות את החלקה של צלחת התחתונה זכוכית. לפוצץ את agarose עם העובר על שקופית הזכוכית של המנה, להבטיח את העובר אינו נוגע באוויר או בצד הפלסטיק של המנה.
לאחר מכן, מלאו את התא סביב מגלשת הזכוכית באגרוז. באמצעות ריס, כוון את העובר כך שהאזור המיועד יהיה בחלק העליון. לאחר חמש דקות, כאשר agarose מוגדר לחלוטין, להוסיף כמה טיפות של פנסילין-סטרפטומיצין מדיום למגלשת הזכוכית.
מניחים את צלחת התחתונה של הכוס מתחת למטרה בתא המחומם. לטבול את המטרה מדיום עובר פניצילין-סטרפטומיצין לפני סגירת התא. הזז את המחוון כדי להגדיר את נתיב האור למשקפת.
תדליק את מנורת הפלואורסצנטיות. מצא עובר והגדר את המוקד על פני השטח שלו. כבה את מנורת הפלואורסצנטיות והגדר את נתיב האור ל- PMTs לפני סגירת התא השחור.
התחל הדמיה חיה ולאתר את מסודרם צירי. כדי לקבל אות טוב, להתאים את כוחות הלייזר. השתמש בערוץ האדום כדי להזיז את הבמה לחלק העליון של העובר, והקצה מיקום זה כ- Z שווה לאפס.
בחר שלב זמן של דקה אחת ו- Z-step של שני מיקרומטרים. הגדר את הפרוסה הראשונה ב 15 מיקרומטר מעל mesoderm צירי, ואת הפרוסה האחרונה ב 15 מיקרומטר מתחת mesoderm צירי. הקלט 10 עד 15 דקות של סרט לפני אבלציה.
בהדמיה חיה, אתר את קווי המתאר של הפולסטר, ולאחר מכן, באמצעות אזור אפנון אלקטרו-אופטי של עניין, או כלי EOM-ROI, צייר מלבן גדול של 20 פיקסלים המשתרע על רוחב הפולסטר, והצב את המלבן באמצע הפולסטר. שים לב למיקום האקסיאלי של המישורים הגבוהים והנמוכים ביותר שיש לאבל, ומבטיח שה- ROI לא יחפוף את תא החלמון באף אחד מהמישורים. מקם את הבמה בעמדת Z הנמוכה ביותר כדי להיות אבלה.
הגדר את אורך הגל הראשון של הלייזר ל-820 ננומטר והזן את אחוזי הכוח כפי שחושבו קודם לכן כדי להשיג כוח יציאה של 300 מילי-וואט. הגדר את תדר ההדמיה ל-200 הרץ והדמיה לייזר ראשונה EOM לאפס. לאחר בחירת מצב טיפול החזר על ביצועים, כבה את ה- EOM והגדר את הטיפול כך שיפעל מיד לאחר אפס מסגרת.
עבור את מצב ההדמיה ל- Timelapse והפעל את פעולתה של שמירה אוטומטית. לאחר בחירת מצב מהיר בשלב זמן, התאם את מספר מסגרות הטיפול ומספר המסגרות לערך המתאים לעומק המיועד. תתחילו להדמיה.
הרכישה צריכה להיות שחורה, כמו התריס PMT נסגר במהלך טיפול EOM. לאחר מכן, עלו על הבמה לעמדת Z הבאה, ובצעו אבלציה דומה. חזור על כל תנוחת Z עד שהחלק העליון של הפולסטר יגיע.
כאשר תהליך אבלציה הושלם, הגדר את הלייזר הראשון ל 920 ננומטר ולהתאים את כוח ההדמיה שנבחר בעבר. שים את EOM הדמיית הלייזר הראשונה ל- 100 ובחר במצב שדה מלא. תדירות ההדמיה צריכה להיות 800 הרץ, ויש לכבות את EOM לפני בדיקת הערימה כולה במצב חי כדי לבדוק אם כל מטוס כבר ablated.
לאחר אישור אבלציה, בחר זמן תלת-ממדי למצב הדמיה. הפעל מחדש את שמירה אוטומטית והתחל להקליט את הסרט לאחר אבלציה למשך 40 עד 60 דקות. בסרט שלאחר אבלציה, בדוק אם התאים הממוקדים היו יעילים.
כמו אבלציות על פני פולסטרים לא צריך לפגוע בעוברים, המורפולוגיה הרגילה של העוברים אבלים ניתן לראות ב 24 שעות לאחר ההפריה. בתוצאה המוצלחת של אבלציות לייזר, רקמות כיסוי לא הושפעו על ידי אבלציה של מבנים בסיסיים. טיפול אינטנסיבי מדי, או טיפול מועט מדי, הביא לכשלים בבלציה בלייזר.
דוגמה לאבלציה לא מוצלחת מראה תאים מעל הפולסטר להיות אבלה, אשר ניכר על ידי פסולת autofluorescent במישור המוקד מעל הפולסטר. בניסיון לא יעיל אחר, התאים מולבנו אך לא הושחתו, ואותות פלואורסצנטיות נמוכה עדיין חושפים את קווי המתאר של התאים השלמים. לבסוף, תאים מסוימים אפילו לא מולבנו עקב טיפול לייזר מספיק.
היווצרות של בועות נובעת cavitation המושרה על ידי טיפול לייזר אינטנסיבי מדי. ערימות Z נלכדו כל דקה במשך 40 דקות בבלציה מוצלחת, ותיעדו הן את האותות הציטופלסמיים והן את אותות ה-mCherry הגרעיניים. בנוסף, גרעינים השייכים לחצי האחורי של הפולסטר מסומנים בנקודה מגנטה ומעקב לאורך זמן, לפני ואחרי אבלציה.
כמדד להתמדה בנדידה, נלמד מתאם אוטומטי של התאים לפני ואחרי אבלציה. תאים השייכים לחלקו העורפי של הפולסטר הציגו תנועה מתמשכת לפני אבלציה, אשר פוחתת באופן דרסטי לאחר אבלציה, מה שמצביע על אובדן של הגירה קולקטיבית מכוונת. יישור נכון של הלייזרים ומדידת כוח הלייזר הם קריטיים כדי לקבל תוצאות ניתנות לשחזור.
זה גם המפתח כדי לבדוק את יעילות אבלציה על התמונות הראשונות לאחר אבלציה. אנו משתמשים בבלציות לייזר כדי לפקפק בתפקידן של אינטראקציות בין תאים בהנחיית נדידת התאים בתוך העובר. אבל ההליך יכול להיות מותאם בקלות לשאלות רבות אחרות שבהן תאים או רקמות צריך להיות ablated בדיוק, פוטנציאל עמוק באורגניזם.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את השימוש באבלציה של לייזר באמצעות עירור דו-פוטון כדי לחקור אינטראקציות בין תאים במהלך התפתחות עוברית. על ידי אבלציה של תאים ספציפיים, חוקרים יכולים להתבונן בהשפעות על תאים שכנים, ובכך לספק תובנות לגבי נדידת תאים קולקטיבית ואינטראקציות מכניות.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה תאית
- התפתחות עוברית
רקע
- תאים בתוך עוברים מתקשרים באמצעות אותות כימיים ומכניים.
- טכניקות אבלציה יכולות לסייע בחקר אינטראקציות אלו על ידי התבוננות בהשפעות של מוות תאי.
- מיקרוסקופיה דו-פוטון מאפשרת מיקוד מדויק של תאים מבלי לפגוע ברקמות הסובבות.
- שיטה זו משפרת את הבנתנו את הדינמיקה התאית in vivo.
מטרת המחקר
- לחקור את ההשפעות של אבלציה תאית על תאים שכנים בסביבות עוברים.
- להעריך את התגובות המכניות של תאים שנודדים באופן קולקטיבי.
- לחדד טכניקות לאבלציה תאית מבוקרת מרחבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מיקרוסקופ דו-פוטון עם אורכי גל ספציפיים של לייזר לאבלציה והדמיה.
- יישור קורות לייזר באמצעות מראות נעות.
- מדידת עוצמת הלייזר להבטחת אבלציה יעילה.
- איסוף נתונים לניתוח ההשפעות של האבלציה על התנהגות התאים.
תוצאות עיקריות
- אבלציה מוצלחת של תאים ממוקדים ללא פגיעה ברקמות סמוכות.
- תצפית על התנהגות משתנה בתאים שכנים לאחר האבלציה.
- תובנות לגבי האינטראקציות המכניות המנחות נדידת תאים.
- הוכחת האפקטיביות של אבלציה בלייזר דו-פוטון בביולוגיה התפתחותית.
מסקנות
- אבלציה בלייזר דו-פוטון היא כלי חשוב לחקר אינטראקציות תאיות בעובריים.
- הטכניקה מאפשרת תצפית מפורטת על הדינמיקה התאית הקולקטיבית.
- ממצאים תורמים להבנת תהליכי התפתחות עוברית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Precise spatial control in cellular ablation enables mechanistic interrogation of tissue-level processes in complex biological systems. This approach supports target validation by isolating specific cellular contributions to morphogenetic movements, reducing ambiguity in pathway interpretation. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking subcellular perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selectively ablating defined cell populations to assess functional consequences.
- Operational Value: Provides spatially controlled perturbation to clarify causal relationships in cellular interactions without confounding damage to adjacent tissues.
- Translational Value: Supports mechanistic de-risking by validating target roles in developmental processes relevant to congenital disorders or regenerative medicine.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducible readouts of cellular behavior changes post-ablation, enabling assay standardization.
- Operational Value: Facilitates preparation of validated biological systems for compound screening by establishing baseline dynamic responses to targeted perturbations.
- Scalability Value: Adaptable across scales (microns to >100 microns) and developmental stages, supporting reuse in diverse assay formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent perturbation strategies in disease-relevant zebrafish models.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing clear phenotypic readouts following target modulation.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by demonstrating that ablation of specific tissues recapitulates expected migratory or signaling defects.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven ablation to validate targets before lead identification, with outputs informing go/no-go decisions based on phenotypic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating axial mesendoderm function in gastrulation models.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, quantifiable ablation parameters and reproducible cellular response tracking.
- Analytics: Provides directional persistence and migration tracking readouts that allow comparative analysis of cellular behavior pre- and post-perturbation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via use in transgenic zebrafish lines expressing GFP and mCherry, enabling longitudinal imaging.
- Enterprise Reuse: Framed as a reusable capability for deep tissue ablation across cell types and scales, not limited to a single experimental endpoint.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through spatially resolved ablation that isolates mechanistic contributors to collective cell migration.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via laser power calibration, EOM-ROI targeting, and Z-stack validation across ablation depths.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false positives in target validation through direct functional interrogation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking ablation phenotypes to developmental defects with translational relevance.
Implementation Considerations
- Required expertise in two-photon microscopy alignment, laser power calibration, and EOM-ROI configuration for precise ablation targeting.
- Instrumentation needs include tunable lasers (820 nm ablation, 920 nm and 1,160 nm imaging), PMT detectors, and stage control for Z-stack acquisition.
- Cross-team standardization requires shared protocols for laser power measurement (300 mW exit power), imaging frequency settings (200 Hz ablation, 800 Hz imaging), and ROI dimensions (20-pixel rectangle).
- Adaptation considerations include adjusting ablation depth, laser power percentage, and Z-step size for different tissue types, developmental stages, or target volumes.
- Practical limitations include dependence on precise laser alignment and power measurement to avoid off-target effects such as bleaching, cavitation bubbles, or incomplete ablation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Preparation of the Two-photon Microscope
2:19
Mounting the Embryo
3:46
Locating the Embryo and Pre-Ablation Imaging
4:53
Target Location, Laser Ablation and Post-ablation Verification
7:20
Results: Analysis of the Zebrafish Embryo Before and Post Ablation
9:07
Conclusion
