אבלציות נפח עמוקות ומבוקרות מרחביות באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטון בגסטרולה דג הזברה
15 ביולי 2021
התפתחות עוברית דורשת תיאום בקנה מידה גדול של תנועת תאים. אבלציה תלת-ממדית של עירור דו-פוטון מאפשרת אבלציה תלת-ממדית מבוקרת מרחבית של קבוצות גדולות של תאים עמוקים. בנוסף, טכניקה זו יכולה לחקור את התגובה של תאים נודדים באופן קולקטיבי ב vivo להסתבכויות בסביבה המכנית שלהם.
בתוך העוברים, תאים מתקשרים זה עם זה, מחליפים מידע כימי ומכאני. אחת ה דרך יעילה לבחן אינטראקציות אלה היא להרוג תאים מסוימים ולנטר את ההשלכות על תאים שכנים. השיטה שאנו מתארים מאפשרת לנו לנפח במדויק תאים, אפילו בתוך העובר, מבלי לפגוע ברקמות השכנות.
הכן את המיקרוסקופ הדו-פוטוני על ידי הגדרת הלייזר הראשון לאורך הגל אבלציה 820 ננומטר, ואת הלייזר השני אל אורך הגל הדמיה mCherry 1, 160 ננומטר. באמצעות מראות ניידות בנתיב האופטי, יישר את שתי קרני הלייזר בכניסה וביציאה של ראשי הסריקה, ולאחר מכן מדוד את העוצמה המרבית של הלייזר הראשון ב- 820 ננומטר. מקם את מד הכוח מתחת למטרה, סגור את התא השחור והגדר את כוח הלייזר הראשון ל- 100%התחל איסוף נתונים במד הכוח, פתח את תריס הלייזר ולאחר מכן מדוד את עוצמת הפלט וחשב את אחוז כוח הלייזר הדרוש כדי להגיע ל- 300 מילי וואט.
הגדר את הלייזר הראשון לאורך גל העירור GFP של 920 ננומטר וכוח ל- 7%התאם את כוח הלייזר השני ל- 15%הפעל את גלאי ה- PMT עבור קווים ירוקים ואדומים, והגדר רגישות PMT של קו ירוק ואדום ל- 65. התאם את שדה הראייה ל- 400 על 400 מיקרומטר, רזולוציית תמונה ל- 512 על 512 פיקסלים ותדר סריקה ל- 800 הרץ. בחר מצב הדמיה של זמן 3D ולאחר מכן צור תיקיה והפעל שמירה אוטומטית לשמירת נתונים לאחר כל רכישה.
להרכיב את תא החימום ולהגדיר אותו 28 מעלות צלזיוס. המתן לפחות 10 דקות עד שהאולם והמטרה להתחמם. תחת סטריאמפיקוסקופ פלואורסצנטי, לזהות עוברים ב 70% epiboly להביע GFP.
באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק, מעבירים שלושה עד ארבעה עוברים נבחרים בצלחת מצופה אגרוז ומניחים אותם בקפידה במלקחיים עדינים. ב בקבוקון זכוכית קטן, להוסיף מיליליטר אחד של פתרון של פניצילין-סטרפטומיצין בינוני המכיל 2%agarose, ומניחים את בקבוקון בתנור בלוק מחומם מראש, יבש ב 42 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטה זכוכית מלוטשת אש, להעביר עובר dechorionated ל בקבוקון, דואג לא להוסיף מדי מדיום עובר לאגרוז.
יש להשליך את מדיום העובר הנותר מהפיפטה. שאפו את העובר בחזרה, יחד עם מספיק אגרוז כדי לכסות את החלקה של צלחת התחתונה זכוכית. לפוצץ את agarose עם העובר על שקופית הזכוכית של המנה, להבטיח את העובר אינו נוגע באוויר או בצד הפלסטיק של המנה.
לאחר מכן, מלאו את התא סביב מגלשת הזכוכית באגרוז. באמצעות ריס, כוון את העובר כך שהאזור המיועד יהיה בחלק העליון. לאחר חמש דקות, כאשר agarose מוגדר לחלוטין, להוסיף כמה טיפות של פנסילין-סטרפטומיצין מדיום למגלשת הזכוכית.
מניחים את צלחת התחתונה של הכוס מתחת למטרה בתא המחומם. לטבול את המטרה מדיום עובר פניצילין-סטרפטומיצין לפני סגירת התא. הזז את המחוון כדי להגדיר את נתיב האור למשקפת.
תדליק את מנורת הפלואורסצנטיות. מצא עובר והגדר את המוקד על פני השטח שלו. כבה את מנורת הפלואורסצנטיות והגדר את נתיב האור ל- PMTs לפני סגירת התא השחור.
התחל הדמיה חיה ולאתר את מסודרם צירי. כדי לקבל אות טוב, להתאים את כוחות הלייזר. השתמש בערוץ האדום כדי להזיז את הבמה לחלק העליון של העובר, והקצה מיקום זה כ- Z שווה לאפס.
בחר שלב זמן של דקה אחת ו- Z-step של שני מיקרומטרים. הגדר את הפרוסה הראשונה ב 15 מיקרומטר מעל mesoderm צירי, ואת הפרוסה האחרונה ב 15 מיקרומטר מתחת mesoderm צירי. הקלט 10 עד 15 דקות של סרט לפני אבלציה.
בהדמיה חיה, אתר את קווי המתאר של הפולסטר, ולאחר מכן, באמצעות אזור אפנון אלקטרו-אופטי של עניין, או כלי EOM-ROI, צייר מלבן גדול של 20 פיקסלים המשתרע על רוחב הפולסטר, והצב את המלבן באמצע הפולסטר. שים לב למיקום האקסיאלי של המישורים הגבוהים והנמוכים ביותר שיש לאבל, ומבטיח שה- ROI לא יחפוף את תא החלמון באף אחד מהמישורים. מקם את הבמה בעמדת Z הנמוכה ביותר כדי להיות אבלה.
הגדר את אורך הגל הראשון של הלייזר ל-820 ננומטר והזן את אחוזי הכוח כפי שחושבו קודם לכן כדי להשיג כוח יציאה של 300 מילי-וואט. הגדר את תדר ההדמיה ל-200 הרץ והדמיה לייזר ראשונה EOM לאפס. לאחר בחירת מצב טיפול החזר על ביצועים, כבה את ה- EOM והגדר את הטיפול כך שיפעל מיד לאחר אפס מסגרת.
עבור את מצב ההדמיה ל- Timelapse והפעל את פעולתה של שמירה אוטומטית. לאחר בחירת מצב מהיר בשלב זמן, התאם את מספר מסגרות הטיפול ומספר המסגרות לערך המתאים לעומק המיועד. תתחילו להדמיה.
הרכישה צריכה להיות שחורה, כמו התריס PMT נסגר במהלך טיפול EOM. לאחר מכן, עלו על הבמה לעמדת Z הבאה, ובצעו אבלציה דומה. חזור על כל תנוחת Z עד שהחלק העליון של הפולסטר יגיע.
כאשר תהליך אבלציה הושלם, הגדר את הלייזר הראשון ל 920 ננומטר ולהתאים את כוח ההדמיה שנבחר בעבר. שים את EOM הדמיית הלייזר הראשונה ל- 100 ובחר במצב שדה מלא. תדירות ההדמיה צריכה להיות 800 הרץ, ויש לכבות את EOM לפני בדיקת הערימה כולה במצב חי כדי לבדוק אם כל מטוס כבר ablated.
לאחר אישור אבלציה, בחר זמן תלת-ממדי למצב הדמיה. הפעל מחדש את שמירה אוטומטית והתחל להקליט את הסרט לאחר אבלציה למשך 40 עד 60 דקות. בסרט שלאחר אבלציה, בדוק אם התאים הממוקדים היו יעילים.
כמו אבלציות על פני פולסטרים לא צריך לפגוע בעוברים, המורפולוגיה הרגילה של העוברים אבלים ניתן לראות ב 24 שעות לאחר ההפריה. בתוצאה המוצלחת של אבלציות לייזר, רקמות כיסוי לא הושפעו על ידי אבלציה של מבנים בסיסיים. טיפול אינטנסיבי מדי, או טיפול מועט מדי, הביא לכשלים בבלציה בלייזר.
דוגמה לאבלציה לא מוצלחת מראה תאים מעל הפולסטר להיות אבלה, אשר ניכר על ידי פסולת autofluorescent במישור המוקד מעל הפולסטר. בניסיון לא יעיל אחר, התאים מולבנו אך לא הושחתו, ואותות פלואורסצנטיות נמוכה עדיין חושפים את קווי המתאר של התאים השלמים. לבסוף, תאים מסוימים אפילו לא מולבנו עקב טיפול לייזר מספיק.
היווצרות של בועות נובעת cavitation המושרה על ידי טיפול לייזר אינטנסיבי מדי. ערימות Z נלכדו כל דקה במשך 40 דקות בבלציה מוצלחת, ותיעדו הן את האותות הציטופלסמיים והן את אותות ה-mCherry הגרעיניים. בנוסף, גרעינים השייכים לחצי האחורי של הפולסטר מסומנים בנקודה מגנטה ומעקב לאורך זמן, לפני ואחרי אבלציה.
כמדד להתמדה בנדידה, נלמד מתאם אוטומטי של התאים לפני ואחרי אבלציה. תאים השייכים לחלקו העורפי של הפולסטר הציגו תנועה מתמשכת לפני אבלציה, אשר פוחתת באופן דרסטי לאחר אבלציה, מה שמצביע על אובדן של הגירה קולקטיבית מכוונת. יישור נכון של הלייזרים ומדידת כוח הלייזר הם קריטיים כדי לקבל תוצאות ניתנות לשחזור.
זה גם המפתח כדי לבדוק את יעילות אבלציה על התמונות הראשונות לאחר אבלציה. אנו משתמשים בבלציות לייזר כדי לפקפק בתפקידן של אינטראקציות בין תאים בהנחיית נדידת התאים בתוך העובר. אבל ההליך יכול להיות מותאם בקלות לשאלות רבות אחרות שבהן תאים או רקמות צריך להיות ablated בדיוק, פוטנציאל עמוק באורגניזם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את השימוש באבלה בלייזר המתווכת על ידי עירור פוטונים כפולים כדי לחקור אינטראקציות בין תאים במהלך ההתפתחות העוברית. על ידי אבלה של תאים ספציפיים, חוקרים יכולים לצפות בהשפעות על תאים שכנים, דבר המספק תובנות לגבי נדידה קולקטיבית של תאים ואינטראקציות מכניות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- התפתחות עוברית
רקע
- תאים בתוך עוברים מתקשרים באמצעות אותות כימיים ומכניים.
- טכניקות אבלציה יכולות לסייע בחקר אינטראקציות אלו באמצעות התבוננות בהשפעות של מוות תאי.
- מיקרוסקופיית דו-פוטון מאפשרת פגיעה מדויקת בתאים ללא פגיעה ברקמות סביבם.
- שיטה זו משפרת את הבנתנו לגבי דינמיקה תאית in vivo.
מטרת המחקר
- לבחון את השפעותי האבליציה של תאים על תאים שכנים בסביבות עובריות.
- להעריך את התגובות המכניות של תאים נודדים באופן קולקטיבי.
- לשפר טכניקות לאבליציה של תאים בשליטה מרחבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של מיקרוסקופ דו-פוטוני עם אורכי גל ספציפיים של לייזר עבור אבלציה (ablation) ודימוי.
- יישור של קרני הלייזר באמצעות מראות ניידות.
- מדידה של הספק הלייזר להבטחת אבלציה יעילה.
- איסוף נתונים לניתוח השפעות האבלציה על התנהגות התאים.
תוצאות עיקריות
- אבליציה מוצלחת של תאים מטרות ללא פגיעה ברקמות סמוכות.
- תצפית על התנהגות משתנה בתאים שכנים לאחר האבליציה.
- תובנות לגבי האינטראקציות המכניות המנחות נדידת תאים.
- הדגמת היעילות של אבליציה בלייזר דו-פוטוני בביולוגיה התפתחותית.
מסקנות
- אבליציה בלייזר דו-פוטוני היא כלי בעל ערך לחקר אינטראקציות בין תאים בעוברים.
- הטכניקה מאפשרת תצפית מפורטת על דינמיקה קולקטיבית של תאים.
- הממצאים תורמים להבנת תהליכי התפתחות עוברית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שליטה מרחבית מדויקת באבלאציה תאית מאפשרת בחינה מכניסטית של תהליכים ברמת הרקמה במערכות ביולוגיות מורכבות. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות על ידי בידוד תרומות תאיות ספציפיות לתנועות מורפוגנטיות, ובכך מפחיתה את העמימות בפירוש מסלולים. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור הפרעות סוב-תאיות לתוצאות פנוטיפיות במודל הרלוונטי למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות השמדה סלקטיבית של אוכלוסיות תאים מוגדרות להערכת השלכות תפקודיות.
- ערך תפעולי: מספק הפרעה מבוקרת מרחבית להבהרת קשרים סיבתיים באינטראקציות תאיות, ללא נזק נלווה לרקמות סמוכות.
- ערך תרגומי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי תיקוף תפקידי מטרה בתהליכי התפתחות הרלוונטיים להפרעות מולדות או לרפואה רגנרטיבית.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של שינויים בהתנהגות תאית לאחר אבלציה, ובכך מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מקל על הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקת תרכובות על ידי קביעת תגובות דינמיות בסיסיות להפרעות ממוקדות.
- ערך סקביליות: ניתן להתאמה למקשמות שונות (מיקרונים עד 100 מיקרונים <) ולשלבים התפתחותיים שונים, דבר התומך בשימוש חוזר בפורמטים מגוונים של בדיקות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על רצף מהשלב של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי ה enabling של אסטרטגיות הפרעה עקביות במודלים של דגי זברפיש הרלוונטיים למחלה.
- ערך תפעולי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת תוצרי קריאה פנוטיפיים ברורים בעקבות מודולציה של המטרה.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון בבחירת המטרה על ידי הדגמה שבלעוץ של רקמות ספציפיות משחזר פגמים של נדירה או סיגנלינג כמצופה.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
השיטה משתלבת בתהליכי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות לביצוע אבלציה (ablation) מונחית-השערה לאימות מטרות לפני זיהוי מובילים (leads), כאשר התוצאים מסייעים בקבלת החלטות של go/no-go בהתבסס על הפחתת סיכונים פנוטיפית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי בידוד תפקוד המזנדודרם האקסיאלי (axial mesendoderm) במודלים של גסטולציה.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקות באמצעות פרמטרי אבלציה סטנדרטיים וכמותיים ומעקב הדיר שמיש אחרי תגובה תאית.
- אנליטיקה: מספקת מדדים של התמדה כיוונית ומעקב נדידה המאפשרים ניתוח השוואתי של התנהגות תאית לפני ואחרי הפרעה.
- מחקר תרגומי: מתחבר להמשכיות פרה-קלינית באמצעות שימוש בקווי דגי zebrafish טרנסגניים המבטאים GFP ו-mCherry, מה שמאפשר דימות לאורך זמן (longitudinal imaging).
- שימוש חוזר ארגוני: מוגדר כיכולת הניתנת לשימוש חוזר עבור אבלציה של רקמה עמוקה על פני סוגי תאים וקנה מידה שונים, ללא הגבלה לנקודת סיום ניסויית אחת.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חזוי בתיקוף המטרה באמצעות אבלציה ברזולוציה מרחבית המבודדת גורמים מכניסטיים לתנועת תאים קולקטיבית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה וסבירות לשחזור באמצעות כיול עוצמת הלייזר, מיקוד EOM-ROI ותיקוף Z-stack לאורך עומקי אבלציה שונים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות go/no-go על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות בתיקוף המטרה באמצעות חקירה פונקציונלית ישירה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון על ידי קישור פנוטיפים של אבלציה לליקויים התפתחותיים בעלי רלוונטיות טרנסלציונלית.
שיקולי יישום
- דרישה למומחיות בכיול של מיקרוסקופיה דו-פוטונית, כיול הספק לייזר והגדרת EOM-ROI עבור מיקוד מדויק של אבלציה.
- דרישות הציוד כוללות לייזרים בעלי אורך גל משתנה (820 nm לאבלציה, 920 nm ו-1,160 nm לדימיוג), גלאי PMT ובקרת במה עבור רכישת Z-stack.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת פרוטוקולים משותפים למדידת הספק הלייזר (הספק יציאה של 300 mW), הגדרות תדירות דימיוג (200 Hz לאבלציה, 800 Hz לדימיוג) וממדי ROI (מלבן של 20 פיקסלים).
- שיקולי התאמה כוללים כיוון של עומק האבלציה, אחוז הספק הלייזר וגודל צעד ה-Z עבור סוגי רקמות שונים, שלבי התפתחות או נפחי מטרה שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות תלות בכיול מדויק של הלייזר ובמדידת ההספק כדי למנוע השפעות לא רצויות כגון הלבנה (bleaching), בועות קביטציה או אבלציה לא שלמה.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Preparation of the Two-photon Microscope
2:19
Mounting the Embryo
3:46
Locating the Embryo and Pre-Ablation Imaging
4:53
Target Location, Laser Ablation and Post-ablation Verification
7:20
Results: Analysis of the Zebrafish Embryo Before and Post Ablation
9:07
Conclusion
