Name: ביטוי GFP המושרה באור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 האופטוגנטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: למדו ביטוי גן מושרה באור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 האופטוגנטית. שיטה זו מאפשרת שליטה מרחבית וזמנית מדויקת בהפעלת גנים לחקירת פונקציות ביולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לסטפן מטרנה ולחברים במעבדות וו ומטורנה על הצעות והערות מועילות על פרוטוקול זה. אנו מודים לאנה ריד, קווין גרדנר ולורה מוטה-מינה על דיון ותובנות יקרי ערך בעת פיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH; R03 DK106358) והוועדה לתיאום חקר הסרטן של אוניברסיטת קליפורניה (CRN-20-636896) ל- S.W.

מחקר זה בוצע באישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה מרסד.
1. חציית דגי זברה ואוסף עוברים
<ol><li>שמור על קווי דגי זברה מהונדסים נפרדים המכילים את מפעיל התמלול של TAEL או את הגן הכתב הנשלט על ידי C120 כדי למזער הפעלה מזויפת.</li>
	<li>לחצות 6-8 דגי זברה בוגרים מכל שורה בשיטות סטנדרטיות9 כדי לייצר עוברים מהונדסים כפולים המכילים הן את רכיבי TAEL והן את רכיבי C120(איור 1B). הערה: לחלופין, שני הרכיבים יכולים לבוא לידי ביטוי באופן ארעי באמצעות מיקרו-ינון של mRNA או DNA פלסמיד בשיטות סטנדרטיות10.</li>
	<li>לאסוף עוברים במנות פטרי המכילות מי ביצים (60 מיקרוגרם / מ"ל מלח ים מיידי האוקיינוס מומס במים מזוקקים), עם כ 30 עוברים לכל תנאי להיבדק.</li>
	<li>מניחים את הכלים בקופסה אטומה לאור או מכסים בנייר אלומיניום כדי למזער הפעלה לא מכוונת באור הסביבה (ראו טבלה 1).</li>
</ol>2. אינדוקציה אור גלובלית
<ol><li>השתמש בלוח LED באור כחול (465 ננומטר) כדי לספק הפעלת אור כחול למספר עוברים בו-זמנית.</li>
	<li>מקם את לוח ה- LED ביחס לצלחות הפטרי המכילות עוברים כך שכוח האור בפועל המתקבל על ידי העוברים הוא כ - 1.5 מ"ר / ס"מ2 כפי שנמדד על ידי מד כוח אור ואנרגיה (איור 2A).</li>
	<li>פעמו את האור במרווחי זמן של שעה אחת בהפעלה/שעה באמצעות ממסר טיימר אם הוא מאיר במשך יותר מ-3 שעות כדי להפחית את הסיכון לצילום להפעלה של תמלול TAEL5,8. הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב את משך התאורה המדויק עבור יישומים ספציפיים. בפרוטוקול זה, דוגמאות של משך תאורה של 30 דקות, 1 שעות, 3 שעות ו 6 שעות מסופקות.</li>
	<li>הסר מכסי צלחת פטרי כדי למזער את פיזור האור מן ה עיבוי.</li>
	<li>מניחים מנות פטרי המכילות עוברי בקרה בקופסה חסינת אור או מכסים בנייר אלומיניום לבקרות כהות.</li>
</ol>3. הערכה כמותית של אינדוקציה על ידי qRT-PCR
<ol><li>יש להסיר עוברים מההארה לאחר משך ההפעלה הרצוי.</li>
	<li>לחלץ RNA כולל מ 30-50 אור מופעל ו 30-50 עוברים כהים באמצעות ערכת בידוד RNA בעקבות הוראות הערכה.<ol>
<li>מעבירים עוברים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ומסירים עודפי מי ביצים. מוסיפים חוצץ תמוגה ומותגנים את העוברים עם עלי פלסטיק.</li>
		<li>העבר את ה- lysate לעמודה שסופקה על-ידי ערכה והמשיך בהוראות הערכה. מיד להמשיך לשלב 3.3 או לאחסן RNA מטוהר ב -20 °C (50 °F) עד -80 °C (70 °F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש RNA כולל של 1 מיקרוגרם לסינתזת cDNA באמצעות ערכת סינתזה של cDNA בהתאם להוראות הערכה.<ol>
<li>קח צינור PCR 0.2 מ"ל דק, הוסף 1 מיקרוגרם של RNA ל 4 μL של 5x cDNA תגובה מאסטר תערובת (המכיל חיץ ממוטב, אוליגו-dT פריימרים אקראיים, ו- dNTPs), 1 μL של פתרון תמלול הפוך 20x, ומים ללא נוקלאז לנפח כולל של 20 μL.</li>
		<li>מניחים את הצינור בתרמוציקלר המתוכנת כדלקמן: 22 °C (70 °F) למשך 10 דקות, 42 °C (55 °F) למשך 30 דקות, 85 °C (5 דקות), ולאחר מכן להחזיק ב 4 °C (70 °F). המשך מיד לשלב 3.4 או לאחסן cDNA ב -20 °C (70 °F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן תגובות qPCR המכילות תערובת מאסטר אנזימים ירוקים SYBR, cDNA מדולל פי 5 (שלב 3.3) ו- 325 ננומטר של כל פריימר עבור GFP. הערה: פריימרים המשמשים בפרוטוקול זה באופן הבא. GFP קדימה: 5'-ACGACGGCAACTACACACACC-3'; GFP הפוך: 5'-GTCCTCCTTGAATGTCGATGC-3'; ef1a קדימה 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a reverse: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').</li>
	<li>בצע תגובות qPCR במחשב PCR בזמן אמת. הערה: תוכנית PCR: הפעלה ראשונית ב 95 °C (55 °F) במשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 30 s ב 95 °C (55 °F), 30 s ב 60 °C (50 °F), ו 1 דקות ב 72 °C (72 °F).</li>
	<li>בצע ניתוח עקומת המסה לאחר השלמת ה- PCR כדי לקבוע את הספציפיות לתגובה. בצע שלושה שכפולים טכניים עבור כל דגימה.</li>
	<li>חשב אינדוקציה המופעלת על ידי אור כשינוי קיפול ביחס לעוברים שנשמרו בחושך באמצעות שיטת2 -ΔΔCt 11. ניתן לקבוע משמעות סטטיסטית באמצעות חבילת תוכנה לסטטיסטיקה.</li>
</ol>4. הערכה איכותית של אינדוקציה על ידי מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות
<ol><li>הסר את העוברים מן התאורה לאחר משך ההפעלה הרצוי.</li>
	<li>לשתק עוברים להדמיה ב 3% methylcellulose המכיל 0.01% tricaine בשקופיות דיכאון זכוכית.</li>
	<li>השג תמונות פלואורסצנטיות וב brightfield בסטריומקרוסקופ פלואורסצנטי המחובר למצלמה דיגיטלית באמצעות הגדרות מסנן GFP סטנדרטיות. השתמש בהגדרות זהות של רכישת תמונות עבור כל הדוגמאות.</li>
	<li>מזג תמונות Brightfield ופלואורסצנטיות לאחר הרכישה עם תוכנת עיבוד תמונה.</li>
</ol>

<ol><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).</li>
<li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
<li>Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAEL%3A+a+zebrafish-optimized+optogenetic+gene+expression+system+with+fine+spatial+and+temporal+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control.</a> Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).</li>
<li>LaBelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAEL+2.0%3A+An+improved+optogenetic+expression+system+for+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish.</a> Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).</li>
<li>Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+natural+and+artificial+DNA+substrates+for+light-activated+LOV-HTH+transcription+factor+EL222%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222.</a> Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).</li>
<li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).</li>
<li>Holder, N., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+DNA%2C+RNA%2C+and+Protein+into+the+Fertilized+Zebrafish+Egg+for+Analysis+of+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Embryology%22%5BJournal%5D)">Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function.</a> Molecular Embryology. , 487-490 (1999).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li>
<li>Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cell+ablation+in+zebrafish+using+optogenetic+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control.</a> Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).</li>
<li>Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+transcription+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of transcription in zebrafish.</a> PloS One. 7 (11), 50738(2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).</li>
</ol>

לא הוכרזו ניגודי עניינים.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת TAEL/C120 האופטוגנטית להשגת ביטוי גנים כחול שאינו ניתן לתפוקה באור. מערכת זו מורכבת מפעיל תמלול, TAEL, כי dimerizes על תאורה עם אור כחול ומפעיל שעתוק של גן עניין במורד הזרם של אלמנט רגולטורי C120. ביטוי מושרה של כתב GFP ניתן לזהות לאחר מעט כמו 30 דקות של חשיפה לאור, דבר המצביע על כך גישה זו בעלת קינטיקה מהירה יחסית מגיבה.
מספר גורמים יכולים להשפיע על רמות האינדוקציה. הקריטיים ביותר הם אורך הגל והעוצמה של הפעלת האור. בפרוטוקול זה נעשה שימוש 465 ננומטר נורות LED...

מערכות ביטוי גנים לא ניתנות לתקדים מסייעות לשלוט בכמות, בתזמון ובמיקום של ביטוי גנים. עם זאת, השגת שליטה מרחבית וטמפורלית מדויקת באורגניזמים רב-תאיים הייתה מאתגרת. בקרת זמן מושגת בדרך כלל על ידי הוספתתרכובות מולקולה קטנה 1 או הפעלה של מקדמי הלם חום2. עם זאת, שתי הגישות חשופות לסוגיות של תזמון, כוח אינדוקציה ותגובות לחץ מחוץ למטרה. שליטה מרחבית מושגת בעיקר על ידי שימוש ביזמים ספציפיים לרקמות3, אבל גישה זו דורשת מקדם מתאים או אלמנט רגולטורי, אשר לא תמיד זמינים, וזה לא תורם אינדוקציה ברמת תת רקמות.
בניגוד לגישות קונבנציונליות כאלה, מפעילי שעתוק אופטוגנטיים המופעלים על ידי אור יש פוטנציאל לשליטה מרחבית וטמפורלית עדינה יותר של ביטויגנים 4. מערכת TAEL/C120 בעלת אור כחול פותחה ומותבת לשימוש בעוברי דגי זברה5,6. מערכת זו מבוססת על גורם שעתוק אנדוגני המופעל על ידי אור מהחיידק E. litoralis7,8. מערכת TAEL/C120 מורכבת מפעיל תמלול בשם TAEL המכיל תחום הפעלה Kal-TA4, תחום LOV מגיב אור כחול (חישת מתח אור)ותחוםכריכת DNA של הסליל-תור-סליל (HTH). כאשר מוארים, תחומי LOV עוברים שינוי קונפורמציה המאפשר לשתי מולקולות TAEL לעמעם, להיקשר למקדם C120 מגיב TAEL, וליזום תמלול של גן במורד הזרם של עניין5,8. מערכת TAEL/C120 מציגה אינדוקציה מהירה וחזקה עם רעילות מינימלית, והיא יכולה להיות מופעלת על ידי מספר שיטות אספקת אור שונות. לאחרונה, שיפורים במערכת TAEL / C120 נעשו על ידי הוספת אות לוקליזציה גרעינית ל- TAEL (TAEL-N) ועל ידי צימוד האלמנט הרגולטורי C120 למקדם בסיס cFos (C120F) (איור 1A). שינויים אלה שיפרו את רמות האינדוקציה ביותר מפי 15.
בפרוטוקול זה, לוח LED פשוט משמש להפעלת מערכת TAEL / C120 ולזירוז הביטוי בכל מקום של גן כתב, GFP. אינדוקציה של ביטוי יכולה להיות מנוטרת באופן איכותי על ידי התבוננות בעוצמת הפלואורסצנטיות או כמותית על ידי מדידת רמות התמליל באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR). פרוטוקול זה יציג את מערכת TAEL/ C120 ככלי רב-תכליתי וקל לשימוש המאפשר רגולציה חזקה של ביטוי גנים ב- vivo.

<table><tbody><tr><td>BioRender כלי איור מדעי מבוסס אינטרנט BioRender</td><td></td><td></td><td>https://biorender.com/</td></tr> <tr><td>מצלמה דיגיטלית CCD צבעונית</td><td>Lumenara</td><td>755-107</td><td></td></tr><tr><td>קונסולת מד כוח ואנרגיה קומפקטית, מסנן עירור LCD דיגיטלי 4 אינץ'</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>, 545 ננומטר</td><td>אולימפוס</td><td>ET545/25x</td><td></td></tr><tr><td>illustra RNAspin Mini kit</td><td>GE בריאות</td><td>95017-491</td><td></td></tr><tr><td>אינסטנט אוקיינוס מלח ים</td><td>מיידי אוקיינוס</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>MARS AQUA ניתן לעמעום 165 W אור אקווריום LED (כחול ולבן)</td> <td>Amazon</td><td>B017GWDF7E</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7140</td><td></td></tr><tr><td>NEARPOW מתג טיימר דיגיטלי לתכנות</td><td>Amazon</td><td>B01G6O28NA</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR ירוק תערובת מהירה</td><td>Quantabio</td><td>101414-286</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת עיבוד תמונה פוטושופ</td><td>תוכנת</td> גרפים וסטטיסטיקה Adobe <td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qScript XLT cDNA SuperMix</td><td>Quantabio</td><td>10142-786</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3 מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Applied Biosystems</td><td>A28137</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין (אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונט)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120 מקור אור LED פלואורסצנטי</td><td>Excelitas</td><td>010-00326R</td><td>הופסק. הוא הוחלף ב-X-Cite mini+</td></tr></tbody></table>

ביטוי gfp המושרה באור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת tael/c120 האופטוגנטית

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

מערכות ביטוי גנים לא יסולא בפז הן כלי רב ערך לחקר תהליכים ביולוגיים. מערכות ביטוי אופטוגנטיות יכולות לספק שליטה מדויקת על תזמון ביטוי הגנים, המיקום והמשרעת באמצעות אור כסוכן המעורר. בפרוטוקול זה, מערכת ביטוי אופטוגנטית משמשת להשגת ביטוי גנים שאינו ניתן לניתוק לאור בעוברי דגי זברה. מערכת זו מסתמכת על גורם שעתוק מהונדס הנקרא TAEL המבוסס על גורם שעתוק המופעל על ידי אור ממקור טבעי מהחיידק E. litoralis. כאשר הוא מואר באור כחול, TAEL דימרייז, נקשר לאלמנט הרגולטורי הקוגניטיבי שלו הנקרא C120, ומפעיל תמלול. פרוטוקול זה משתמש בעוברי דגי זברה מהונדסים המבטאים את גורם התמלול של TAEL תחת שליטתו של מקדם ה- ubb בכל מקום. יחד עם זאת, האלמנט הרגולטורי C120 מניע את הביטוי של גן עיתונאי פלואורסצנטי (GFP). באמצעות לוח LED פשוט כדי לספק הפעלת אור כחול, אינדוקציה של ביטוי GFP ניתן לזהות תחילה לאחר 30 דקות של תאורה ומגיע לשיא של אינדוקציה יותר מפי 130 לאחר 3 שעות של טיפול באור. אינדוקציה של ביטוי יכולה להיות מוערכת על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) ועל ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו היא גישה רב-תכליתית וקלה לשימוש לביטוי גנים אופטוגנטיים.

עבור הדגמה זו, קו כתב GFP מגיב C120(Tg(C120F:GFP)ucm107)נחצה עם קו מהונדס המבטא TAEL-N בכל מקום מן ubiquitin b (ubb) מקדם (Tg (ubb:TAEL-N)ucm113))כדי לייצר עוברים מהונדסים כפולים המכילים את שני האלמנטים. 24 שעות לאחר ההפריה, העוברים נחשפו להפעלת האור הכחול, פעמו בתדר של 1 שעות על /1 שעה כבויה. אינדוקציה של ביטוי GFP כותמה על-ידי qRT-PCR ב- 30 דקות, שעה אחת, 3 שעות ו- 6 שעות לאחר ההפעלה (איור 2B וטבלה 1). בהשוואה לעובר...

אופטוגנטיקה היא כלי רב עוצמה עם יישומים רחבי היקף. פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג ביטוי גנים שאינו ניתן לניתוק לאור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 בעלת אור כחול.

ביטוי GFP המושרה באור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 האופטוגנטית

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון שהוא שיטה אופטוגנטית, או מופעלת לאור, לביטוי גנים, באורגניזם שלם. במקרה שלנו, עובר דג זברה. היתרון של טכניקה זו, הוא שהיא משתמשת באור, כסוכן גרימת, המאפשר שליטה מדויקת מאוד, מרווחית וטמפורלית של אינדוקציה.פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור כל מצב שבו ביטוי גנים לא ניתן לתפוקה יהיה שימושי. זה כולל דברים כמו מעקב אחר שושלת, בדיקת רווח או ניסויי הצלה. ראשית, מיקום לוח ה-LED ביחס לצלחות הפטרי המכילות עוברים להעברת 1.5 מילי-וואט לסנטימטר מרובע של אור למספר עוברים בו-זמנית.להפחתת הסיכון לפגיעה בתמונה ל- Tail Transcriptional Activator, הצב את האור במרווחי זמן של שעה אחת מופעלת באמצעות ממסר טיימר, אם הוא מואר במשך יותר משלוש שעות. הסר מכסי צלחת פטרי כדי למזער את פיזור האור מן ה עיבוי. הניחו מנות פטרי המכילות עוברי בקרה וקופסה חסינת אור לבקרות כהות.הסר עוברים מהארת, לאחר משך ההפעלה הרצוי. לחילוץ RNA כולל, השתמש בערכת חילוץ RNA. מעבירים את העוברים לצינור צנטריפוגה זעיר של 1.5 מיליליטר ומסירים את עודפי מי הביצה.לאחר הוספת חוצץ תמוגה, הומוגניזציה העוברים עם עלי פלסטיק. העבר את ה- lysate לעמודה שסופקה ובצע את הוראות היצרן לטיהור RNA. אחסן את הרנ"א המטוהר, במינוס 20 עד מינוס 80 מעלות צלזיוס, עד לשימוש או לסנתז מיד את cDNA ממיקרוגרם אחד, סה"כ RNA באמצעות ערכת הסינתזה של cDNA, על ידי ביצוע ההוראה של היצרן.הוסף מיקרוגרם אחד של RNA לקיר דק 0.2 מיליליטר, צינור PCR, המכיל ארבעה microliters, של חמש פעמים cDNA תגובה מאסטר תערובת, ואחריו תוספת של microliter אחד, של 20 פעמים פתרון אנזים transcriptase הפוך. הבא לפצות נפח סופי של 20 microliters, עם מים ללא נוקלאז. מניחים את הצינור במתכנת תרמו מחזור לסינתזה של cDNA.יש לאחסן את ה-cDNA המסונתז במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש או לשימוש מיידי להערכה כמותית. הגדר את תגובות ה- PCR הכמותיות המכילות תערובת מאסטר אנזימים ירוקים בסייבר. חמישה פריימרים מדוללים cDNA ו- GFP בריכוז של 325 ננומולאר במשולשים ומנהלים את התגובה במכונת PCR מתוכנתת בזמן אמת.עם השלמת התגובה, לנתח את עקומת ההיתוך כדי לקבוע את הספציפיות התגובה. חשב אינדוקציה המופעלת באמצעות אור כשינוי קיפול ביחס לעוברי הבקרה בשיטת Delta CT הכפולה. ולהשתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לקבוע את המשמעות.לאחר הסרת העוברים מהארה, לשתק עוברים להדמיה ב 3%methylcellulose המכיל 0.01%Tricaine בשקופיות דיכאון זכוכית. השג תמונות פלואורסצנטיות ותמונות בהירות במיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי המחובר למצלמה דיגיטלית באמצעות הגדרות מסנן GFP סטנדרטיות. מזג תמונות Brightfield ופלואורסצנטיות לאחר הרכישה עם תוכנת עיבוד תמונה.כימות של ביטוי GFP הצביע על אינדוקציה של ביטוי ברגע 30 דקות לאחר החשיפה לאור הכחול. רמות ביטוי GFP אז המשיך לגדול עד שש שעות, לאחר ההפעלה בהתמדה. אינדוקציה GFP הוערך גם באופן איכותי על ידי בחינת עוצמת הפלואורסצנטיות בו זמנית נקודות לאחר ההפעלה.פלואורסצנטיות GFP מעל רמות הרקע נצפתה לראשונה בשלוש שעות לאחר ההפעלה והפכה בהירה יותר באופן ניכר בשש שעות לאחר ההפעלה. לעומת זאת, עוברים שולטים בכל נקודות הזמן, נשמרים בחושך, לא הציגו, שום פלואורסצנטיות GFP ניכרת. האור המפעיל חייב להיות בטווח הכחול של ספקטרום האור הנראה.אור החדר ואור השמש מכילים אור כחול. אז הגן על הבקרות השליליות שלך ממקורות אור סביבתיים. מערכת TAEL C120, מקודדת גנטית ומודולרית ויכולה להניע ביטוי של כל גן מעניין.אז, בשילוב עם טכניקות אחרות, זה יכול לשמש כדי לענות על מגוון של שאלות ביולוגיות.

light-induced-gfp-expression-zebrafish-embryos-using-optogenetic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת שליטה של ​​פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה עם חדירה עמוקה אופטי phototoxicity מופחת. אנו מתארים את השימוש בטכנולוגיה זו עבור תיוג תא חי עוברי דג הזברה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לזירוז, תמונה של אור תגובה מולקולות שונות.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

סרטון זה מתאר טכניקות אופטוגנטיות על ידי הפעלת נוירונים סומטוסנסוריים מהונדסים גנטית ורישום תגובה התנהגותית מעוררת באמצעות מצלמת וידאו במהירות גבוהה.

Optogenetics של דגי זברה: הפעלת נוירון סומטוסנסורי מהונדס גנטית לחקר תגובות התנהגותיות של זחלים

בסרטון זה, אנו מדגימים הליך ליצירת קו טרנסגני יציב של דג זברה המבטא באופן מכונן חלבון מחוון מתח פלואורסצנטי בעקבות הזרקה משותפת של מערכת טרנספוזון Tol2 הכוללת את mRNA טרנספוזאז ומבנה טרנספוזון Tol2 המקודד את מחוון המתח הפלואורסצנטי.

Tol2 Transposon-mediated Zebrafish Transgenesis: הליך ליצירת דגי זברה טרנסגניים בעקבות הזרקה משותפת של מערכת Tol2 לעוברים מופרים של דגי זברה

טכניקות Optogenetic הפכו אותו ניתן ללמוד על התרומה של נוירונים ספציפיים להתנהגות. אנו מתארים שיטה בדג זברת זחל להפעלת נוירונים חושיים יחידים להביע channelrhodopsin ריאנט (שף) עם מדינה-דיודה שאובה מוצקה ליזר (DPSS) ולהקליט את ההתנהגויות שהושרו עם מצלמת וידאו במהירות גבוהה.

הפעלה של נוירונים Optogenetic דג זברה החושית באמצעות שף tdTomato

ההתפתחות של דג הזברה יכולה להיות אחרי על פני ימים עם מיקרוסקופיה גיליון אור כאשר עוברים מוטבעות בצינורות פולימר ברורים אופטי עם agarose ריכוז נמוך.

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

לומד את האירועים המוקדמים ביותר של התפתחות תא preneoplastic ואינטראקציה תא חיסון מולדת הוא מרכזי להבנה ולטיפול בסרטן. כאן אנו מתארים שיטה לגרום לתנאי תמורות תאי אפיתל והדמית החיה הבאה של אינטראקציה תא חיסון מולדת עם G12V HRAS לבטא בתאי עור בזחלי דג הזברה.

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב&quot;מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום למעבר פאזה של חלבון מחייב DNA TAR 43 (TDP-43) על ידי אור בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה באמצעות דגי זברה כמודל.

מעבר שלב אופטוגנטי של TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

מניפולציה אופטוגנטית של מסלולי איתות יכולה להיות אסטרטגיה רבת עוצמה לחקור כיצד איתות מפוענח בהתפתחות, התחדשות, הומאוסטזיס ומחלות. פרוטוקול זה מספק הנחיות מעשיות לשימוש במפעילי איתות מסוג Nodal וחלבון מורפוגני עצם (BMP) מבוססי חישת אור-חמצן בעובר המוקדם של דגי הזברה.

הפעלת איתות אופטוגנטי בעוברים של דגי זברה

פרוטוקול זה משתמש בהדמיה של יריעות אור כדי לחקור את תפקוד התכווצות הלב בזחלי דגי זברה ולקבל תובנות על מכניקת הלב באמצעות מעקב אחר תאים וניתוח אינטראקטיבי.

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

למדו ביטוי גן מושרה באור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 האופטוגנטית. שיטה זו מאפשרת שליטה מרחבית וזמנית מדויקת בהפעלת גנים לחקירת פונקציות ביולוגיות.

ביטוי GFP המושרה באור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 האופטוגנטית

גלה סרטונים נוספים