ביטוי GFP המושרה באור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 האופטוגנטית
19 באוגוסט 2021
אופטוגנטיקה היא כלי רב עוצמה עם יישומים רחבי היקף. פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג ביטוי גנים שאינו ניתן לניתוק לאור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 בעלת אור כחול.
פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון שהוא שיטה אופטוגנטית, או מופעלת לאור, לביטוי גנים, באורגניזם שלם. במקרה שלנו, עובר דג זברה. היתרון של טכניקה זו, הוא שהיא משתמשת באור, כסוכן גרימת, המאפשר שליטה מדויקת מאוד, מרווחית וטמפורלית של אינדוקציה.
פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור כל מצב שבו ביטוי גנים לא ניתן לתפוקה יהיה שימושי. זה כולל דברים כמו מעקב אחר שושלת, בדיקת רווח או ניסויי הצלה. ראשית, מיקום לוח ה-LED ביחס לצלחות הפטרי המכילות עוברים להעברת 1.5 מילי-וואט לסנטימטר מרובע של אור למספר עוברים בו-זמנית.
להפחתת הסיכון לפגיעה בתמונה ל- Tail Transcriptional Activator, הצב את האור במרווחי זמן של שעה אחת מופעלת באמצעות ממסר טיימר, אם הוא מואר במשך יותר משלוש שעות. הסר מכסי צלחת פטרי כדי למזער את פיזור האור מן ה עיבוי. הניחו מנות פטרי המכילות עוברי בקרה וקופסה חסינת אור לבקרות כהות.
הסר עוברים מהארת, לאחר משך ההפעלה הרצוי. לחילוץ RNA כולל, השתמש בערכת חילוץ RNA. מעבירים את העוברים לצינור צנטריפוגה זעיר של 1.5 מיליליטר ומסירים את עודפי מי הביצה.
לאחר הוספת חוצץ תמוגה, הומוגניזציה העוברים עם עלי פלסטיק. העבר את ה- lysate לעמודה שסופקה ובצע את הוראות היצרן לטיהור RNA. אחסן את הרנ"א המטוהר, במינוס 20 עד מינוס 80 מעלות צלזיוס, עד לשימוש או לסנתז מיד את cDNA ממיקרוגרם אחד, סה"כ RNA באמצעות ערכת הסינתזה של cDNA, על ידי ביצוע ההוראה של היצרן.
הוסף מיקרוגרם אחד של RNA לקיר דק 0.2 מיליליטר, צינור PCR, המכיל ארבעה microliters, של חמש פעמים cDNA תגובה מאסטר תערובת, ואחריו תוספת של microliter אחד, של 20 פעמים פתרון אנזים transcriptase הפוך. הבא לפצות נפח סופי של 20 microliters, עם מים ללא נוקלאז. מניחים את הצינור במתכנת תרמו מחזור לסינתזה של cDNA.
יש לאחסן את ה-cDNA המסונתז במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש או לשימוש מיידי להערכה כמותית. הגדר את תגובות ה- PCR הכמותיות המכילות תערובת מאסטר אנזימים ירוקים בסייבר. חמישה פריימרים מדוללים cDNA ו- GFP בריכוז של 325 ננומולאר במשולשים ומנהלים את התגובה במכונת PCR מתוכנתת בזמן אמת.
עם השלמת התגובה, לנתח את עקומת ההיתוך כדי לקבוע את הספציפיות התגובה. חשב אינדוקציה המופעלת באמצעות אור כשינוי קיפול ביחס לעוברי הבקרה בשיטת Delta CT הכפולה. ולהשתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לקבוע את המשמעות.
לאחר הסרת העוברים מהארה, לשתק עוברים להדמיה ב 3%methylcellulose המכיל 0.01%Tricaine בשקופיות דיכאון זכוכית. השג תמונות פלואורסצנטיות ותמונות בהירות במיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי המחובר למצלמה דיגיטלית באמצעות הגדרות מסנן GFP סטנדרטיות. מזג תמונות Brightfield ופלואורסצנטיות לאחר הרכישה עם תוכנת עיבוד תמונה.
כימות של ביטוי GFP הצביע על אינדוקציה של ביטוי ברגע 30 דקות לאחר החשיפה לאור הכחול. רמות ביטוי GFP אז המשיך לגדול עד שש שעות, לאחר ההפעלה בהתמדה. אינדוקציה GFP הוערך גם באופן איכותי על ידי בחינת עוצמת הפלואורסצנטיות בו זמנית נקודות לאחר ההפעלה.
פלואורסצנטיות GFP מעל רמות הרקע נצפתה לראשונה בשלוש שעות לאחר ההפעלה והפכה בהירה יותר באופן ניכר בשש שעות לאחר ההפעלה. לעומת זאת, עוברים שולטים בכל נקודות הזמן, נשמרים בחושך, לא הציגו, שום פלואורסצנטיות GFP ניכרת. האור המפעיל חייב להיות בטווח הכחול של ספקטרום האור הנראה.
אור החדר ואור השמש מכילים אור כחול. אז הגן על הבקרות השליליות שלך ממקורות אור סביבתיים. מערכת TAEL C120, מקודדת גנטית ומודולרית ויכולה להניע ביטוי של כל גן מעניין.
אז, בשילוב עם טכניקות אחרות, זה יכול לשמש כדי לענות על מגוון של שאלות ביולוגיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים את השימוש באופטוגנטיקה להשגת ביטוי גנים המושרה על ידי אור בעוברים של דגי זברה. מערכת TAEL/C120 המגיבה לאור כחול מאפשרת בקרה מדויקת על ביטוי גנים באורגניזם שלם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אופטוגנטיקה
- ביטוי גנים
- מודלים של דגי זברה
רקע
- אופטוגנטיקה היא שיטה המופעלת על ידי אור להשראת ביטוי גנים.
- טכניקה זו מספקת בקרה מרחבית וזמנית על ההשראה.
- זה שימושי במיוחד למעקב אחר שושלות תאים (lineage tracing) ולבדיקות להענקת תפקוד (gain-of-function).
- עוברי דגי זבrafish משמשים כמודל לחקר ביטוי גנים in vivo.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה לביטוי גנים המושרה על ידי אור.
- לספק פרוטוקול לחוקרים המעוניינים ביישומים אופטוגנטיים.
- להקל על ביצוע ניסויים הדורשים בקרה מדויקת על ביטוי גנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקום פאנל LED ביחס לצלחות פטרי המכילות עוברים.
- הגשה של 1.5 milliwatts per square centimeter של אור.
- השראה של ביטוי גנים במספר עוברים בו-זמנית.
- שימוש במערכת האופטוגנטית TAEL/C120 לבקרת גנים.
תוצאות עיקריות
- השראת ביטוי גנים מוצלחת בעוברי זברופיש.
- הדגמת בקרה מרחבית וזמנית על הפעלת גנים.
- אספקת פרוטוקול מהימן למחקרי אופטוגנטיקה עתידיים.
- הדגשת היתרונות בשימוש באור כחומר מעורר.
מסקנות
- אופטוגנטיקה מציעה כלי רב עוצמה לחקר תפקוד גנים.
- מערכת TAEL/C120 יעילה להשראת ביטוי גנים in vivo.
- ניתן להחיל שיטה זו על תרחישי מחקר ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
בקרה אופטוגנטית של ביטוי גנים מאפשרת חקירה ספאציו-טמפורלית מדויקת של מטרות ביולוגיות in vivo, ובכך מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. מערכת TAEL/C120 מספקת פלטפורמה מקודדת גנטית, הניתנת להפעלה באמצעות אור, לצורך תיקוף היפותזות טיפוליות עם קריאות כמותיות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות למודולציה הפיכה ותלוית-מינון של ביטוי גנים בעוברים של דגי זברה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות הפעלה גנטית הניתנת להשראה ולהפיכה במודל חולייתנים שלם.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרה על ידי קישור ביטוי מושרה באור למדדי פנוטיפ באמצעות רפורטר GFP וכמותיות qRT-PCR.
- ערך ניבוי: מקל על ניסויי הגברת תפקוד (gain-of-function) וניסויי הצלה (rescue) להערכת מספיקות המטרה והרלוונטיות של המסלול בהקשרים רלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: יוצר ביטוי GFP כמותי התלוי באור, הניתן למדידה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ו-qRT-PCR לצורך סריקת תרכובות או תנאים.
- שחזוריות: מאפשר פרוטוקולי אינדוקציה סטנדרטיים עם עוצמת אור מוגדרת (1.5 mW/cm²) ובקרה זמנית לצמצום השונות בין חזרות.
- סקילביליות (יכולת הרחבה): תואם לפורמטים של מספר בארות באמצעות פנלי LED לטיפול במספר עוברים בו-זמנית תחת תאורה מבוקרת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מידול מחלות: תומך במודלים פרה-קליניים מבוססי דגי זברה, שבהם בקרה זמנית של ביטוי גנים מדמה התערבויות טיפוליות הניתנות להשראה.
- הלימה של סממנים ביולוגיים: תוצרי GFP ו-qRT-PCR משמשים כמדדי פרמקודינמיקה הניתנים לתרגום לבחינת מעורבות מסלולים וביצוע מודולציה של מטרות.
- הפחתת סיכונים: מאפשר הפחתת סיכונים במטרות על ידי בדיקת נחיצות ומספיקות באמצעות תכנוני הצלה ו-gain-of-function הניתנים להשראה, טרם ביצוע מחקרים ביונקים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), ומאפשרת תיקוף חוזר של מטרות מולקולריות במערכת של בעלי חוליות.
- ביולוגיה של גילוי: בוחנת את מספיקות המטרה ואת הפעלת המסלול באמצעות ביטוי מושרה בתזמון מסוים ובגירוי של אור in vivo.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים ונורמליים (fold-change של GFP) להשוואת תנאים גנטיים או פרמקולוגיים.
- אנליזה: משתמשת ב-qRT-PCR בשיטת double delta CT ובעוצמת פלואורסצנציה להשוואה סטטיסטית בין קבוצות מושרויות לבתי ביקורת בחושך.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ביטוי מושרה לתוצאות פנוטיפיות בדגי zebrafish, ובכך תומך ברצף לבדיקות יעילות פרה-קליניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מערכת TAEL/C120 מודולרית יכולה להביא לביטוי של כל גן רצוי, מה שמאפשר שימוש חוזר במגוון מטרות ופרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי מתן בקרה זמנית מדויקת על ביטוי גנים באורגניזם מורכב.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות אספקת אור סטנדרטית ובקרות חשיכה פנימיות כדי להתחשב בשונות סביבתית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) על ידי מתן אפשרות למודולציה מהירה והפיכה של המטרה להערכת השלכות פנוטיפיות.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תומך בתעדוף מותאם סיכונים באמצעות תיקוף של מטרות במערכת הניתנת להשראה ורלוונטית פיזיולוגית, לפני קידום הדברים בשלב הדורש משאבים רבים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול דגי זברה, מיקרו-הזרקה והקמה של חומרת אופטוגנטיקה.
- תלוי במערכות תאורת LED המסוגלות לספק עצימות אור כחול מדויקת ובקרת תזמון.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים למשך החשיפה לאור ולשמירה על בקרת חושך כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לשלבים עובריים שונים או לרקעים גנטיים שונים.
- מוגבל על ידי חדירות האור ברקמות אטומות, אם כי מגבלה זו מופחתת בעוברי דגי זברה בשל שקיפותם האופטית.
