Name: בקרות אנטיגן סינתטיות לאימונוהיסטוכימיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: למד ליצור בקרות אנטיגן סינתטיות לאימונוהיסטוכימיה באמצעות ג'לי BSA ופורמלדהיד. שיטה זו מאפשרת לכייל ולתקנן בדיקות IHC ולשפר את מהימנות התוצאות האבחוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לעמיתיהם ג'פרי טום ואימין סונג על סינתזת פפטידים, ל-Nianfeng Ge על בניית TMA, לשרי לאו על צביעת IHC, למליסה אדיק על סריקה מיקרוסקופית דיגיטלית, ול-Hai Ngu על כימות תמונה דיגיטלית.

1. הכנת תמיסת מלאי וכלים
<ol><li>הכן 20 מ"ל של תמיסת BSA של 25% w/v על ידי ערבוב אבקת BSA 5 גרם ב-14 מ"ל של PBS, pH 7.2 בצינור חרוטי של 50 מ"ל עד לפיזור שווה. מערבולת לפי הצורך כדי לפזר את אבקת ה-BSA.<ol><li>שמור את הפתרון למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר פירוק מלא. התאם את עוצמת הקול הסופית ל- 20 מ"ל עם PBS כדי ליצור פתרון מניות של 25% w/v.</li>
	</ol></li>
	<li>יש להכין 20 מ"ל של תמיסת BSA של 31.3% w/v על ידי ערבוב של 6.26 גרם אבקת BSA ב-13 מ"ל של PBS, pH 7.2 בצינור חרוטי של 50 מ"ל עד לפיזור שווה. שמור את הפתרון למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר פירוק מלא. התאם את הנפח הסופי ל- 20 מ"ל עם PBS כדי ליצור פתרון מניות של 31.3% w/v.</li>
	<li>מחממים מראש בלוק חום ל-85 מעלות צלזיוס. הערה: הפרוטוקול שלהלן יוצר ג'לים פפטידיים/BSA עם נפחים של 1.26-1.4 מ"ל הנוצרים בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. כדי להשתמש בכמויות קטנות יותר, למשל, כאשר מלאי האנטיגן מגביל, הכינו את הג'לים בצינורות PCR והשתמשו בתרמוצילר המוגדר ל-85 מעלות צלזיוס כגוש חום.</li>
	<li>בדקו שתערובת BSA/פורמלדהיד יוצרת ג'ל כצפוי על ידי ערבוב של 700 μL של תמיסת BSA של 25% עם 700 μL של 37% פורמלדהיד. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה 5 פעמים בתוך 5-10 שניות. הימנעו מיצירת בועות אוויר. אזהרה: פורמלדהיד מרוכז הוא רעיל; להשתמש עם אמצעי בטיחות מתאימים.</li>
	<li>מיד לאחר ערבוב תמיסות BSA ופורמלדהיד, הניחו את צינור המיקרו-סנטריפוג' הסגור בבלוק חום בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את הצינור מגוש החום ואפשר לו להתקרר. אשרו כי הג'ל נוצר כצפוי.</li>
</ol>2. הכנה ודילול של פפטידים
<ol><li>להשיג 5-20 מ"ג של פפטיד lyophilized של הרצף הרצוי. הערה: חומצות האמינו C-terminal 16 של התחום התוך-תאי האנושי ERBB2 המוכר על ידי 4B5 הוא TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.<ol><li>הוסיפו 4 חומצות אמינו ל-N-terminus, אצטיל-YGSG ו-C-terminus, GSGC-amide, כדי להקל על קישור צולב של הפפטיד ל-BSA ולספק ריווח בין מולקולת ה-BSA לאפיטופ הפפטידי. הערה: הרצף המלא הוא: אצטיל-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-אמיד.</li>
		<li>אם תרצה בכך, השתמש ברצף חומצות אמינו N ו-C-terminal אחרים כדי להרחיב את האפיטופ של פפטיד הליבה. הערה: ההשפעה של רצפים שונים משתנה בהתאם לשילובי נוגדנים/אפיטופים שונים. התוספת של פפטיד C-terminal מפחיתה את הקשירה של נוגדנים מסוימים לאפיטופים של C-terminal. במקרים כאלה, להשמיט את הרצף הזה.</li>
		<li>לאשר כי פפטידים ממקורות מסחריים מסופקים בטוהר >95%, שהרכבם מאושר על ידי HPLC וניתוח ספקטרומטריית מסה.</li>
	</ol></li>
	<li>חשב את הנפחים הדרושים עבור 5x (1.25 E-2 M) פתרונות מלאי פפטידים. בהתייחסו לטבלה 1, עמודות C-E, הזן ערכים עבור המשקל המולקולרי של האנטיגן (g/שומה), אחוז טוהר האנטיגן (0-100) ומסת האנטיגן (mg). הערה: נפח הממס (ב-μL) להחייאת הדגימה כדי להשיג תמיסת מלאי של 1.25 E-2 M הוא 800 x משקל מולקולרי של אנטיגן x אחוז טוהר אנטיגן/מסת אנטיגן.<ol><li>הכן ותייג בבירור שמונה צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הערה: הצינורות יכילו מלאי פפטידים של 5x בממס, מלאי פפטידים של 1x בממס, חמישה דילולים סדרתיים של 10x של 2.5 E-4 M עד 2.5 E-8 M פפטיד/BSA/ג'ל פורמלדהיד, וג'ל בקרה שלילי המכיל BSA/פורמלדהיד חסר אנטיגן נוסף. כל דגימות הג'ל נראות זהות. בעת הכנת קבוצות מרובות של דילולים פפטידיים בו זמנית, הקפידו לתייג ולזהות את כל הצינורות ואת קלטות העיבוד בצורה נכונה. השתמש בצינורות microcentrifuge מקודדים בצבעים ובקלטות עיבוד במידת האפשר כדי למזער זיהוי שגוי.</li>
	</ol></li>
	<li>הכן תמיסת מלאי פפטידים 5x ב- 1.25 E-2 M על ידי החייאה של כל המסה של פפטיד ליופילי (20 מ"ג עבור הפפטידים ERBB2) ב- 60 μL של הממס המתאים. הערה: בדוגמה זו, דימתילפורמיד (DMF) נוסף ישירות למיכל של הספק.<ol><li>בדוק את התמיסה כדי לוודא שהפפטיד מומס לחלוטין. במידת הצורך, יש להוסיף ממס נוסף ו/או להנמיך את הדגימה עד להמסת הדגימה לחלוטין, תוך הקפדה שלא לחרוג מהנפח המחושב בטבלה 1 עבור מלאי הפפטידים פי 5. אזהרה: DMF הוא רעיל; להשתמש בזהירות מתאימה. הערה: בהתאם לרצף חומצות האמינו, ולהידרופויביות ולמטען המתאימים, פפטידים עשויים להיות מסיסים ב-DMF, דימתיל סולפוקסיד (DMSO), מים טהורים או תמיסות מדוללות של חומצה אצטית, חומצה פורמית או אמוניום ביקרבונט. ניתן לחשב את מאפייני הפפטידים באמצעות מגוון כלים מקוונים17. ספקי פפטידים מסוימים עשויים להציע ממסים המתאימים לרצפים ספציפיים.</li>
		<li>הוסף ממס לפי הצורך כדי להביא את נפח מלאי הפפטידים פי 5 לנפח הסופי המחושב בטבלה 1. מערבולת ל-5 שניות וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-5000 x גרם ל-5 שניות. ניתן לאחסן פתרונות מלאי פפטידים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>בהתייחס לטבלה 2, עמודה C, הכן 150 μL של תמיסת מלאי פפטידים 1x (2.5 E-3 M) על ידי דילול 30 μL של מלאי הפפטידים 5x לתוך 120 μL של ממס (DMF דוגמה זו). מערבולת ל-5 שניות וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-5000 x גרם ל-5 שניות.</li>
	<li>בהתייחס לטבלה 2, עמודה D, הכן 700 μL של 5 תמיסת פפטיד/BSA E-4 M (דילול 1) על-ידי דילול 140 μL של מלאי פפטידים של 1x ל-560 μL של 31.3% BSA/PBS, pH 7.2. מערבולת ל-5 שניות וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-5000 x גרם ל-5 שניות. הערה: ריכוז ה-BSA הסופי של תמיסה זו הוא 25% (w/v).</li>
	<li>בהתייחס לטבלה 2, עמודות E-H, מכינות ארבעה דילולים סדרתיים עוקבים של 10x של מלאי הפפטידים/BSA של 5 E-4 M על ידי הוספת 70 μL של תמיסת פפטיד/BSA ל-630 μL של 25% BSA/PBS, pH 7.2. מערבולת ל-5 שניות וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-5000 x גרם ל-5 שניות. הערה: לאחר שלב זה, יהיו חמישה דילולים סדרתיים פי 10 של פפטיד (5 E-4 M עד 5 E-8 M) ב-25% BSA/PBS, pH 7.2. ארבע הדגימות הראשונות יכילו 630 μL. המדגם האחרון יכיל 700 μL.</li>
	<li>בהתייחס לטבלה 2, עמודה I, הכינו דגימת BSA של בקרה שלילית המכילה 700 μL של 25% BSA/PBS, pH 7.2 (איור 1A).</li>
</ol>3. הכנת ג'לים BSA-פפטידים
<ol><li>ודא כי בלוק החום או thermocycler יציב ב 85 °C (85 °F).</li>
	<li>עיין בטבלה 3, עמודות B-E. בעבודה על דגימה אחת בכל פעם, הוסיפו לדגימת ה-BSA/פפטיד הראשונה של 25% (דילול 1) 630 μL של 37% פורמלדהיד. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה 5 פעמים בתוך 5-10 שניות. הימנעו מיצירת בועות אוויר. אזהרה: פורמלדהיד מרוכז הוא רעיל; להשתמש עם אמצעי בטיחות מתאימים.<ol><li>לאחר ערבוב תמיסות הפפטיד/BSA והפורמלדהיד, הניחו את צינור המיקרו-סנטריפוג' הסגור בבלוק חום בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: ערבבו היטב את תמיסת BSA-פפטיד ופורמלדהיד, אך אל תשקיעו יותר מ-10 שניות בצנרת התערובת לפני הנחת הדגימה על חום. מכיוון שחיבור צולב של פורמלדהיד מתחיל באופן מיידי, הג'ל עשוי להיווצר באופן שונה אם ההליך מגוון עבור דגימות שונות. ריכוז ה-BSA הסופי בג'לים אלה הוא 12.5% (w/v). ריכוזי BSA סופיים של פחות מ-10% עשויים להניב ג'לים שאינם מתמצקים; ריכוזי BSA סופיים הגדולים מ-16% עשויים לייצר ג'לים שבירים יותר וקשים יותר לניתוח לאחר העיבוד.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.2 ו- 3.2.1 עבור כל אחד מהדילולים 2-4.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.2 ו- 3.2.1 לדילול 5, אך הוסף 700 μL של 37% פורמלדהיד, נפח השווה ל- 700 μL של תמיסת BSA-אנטיגן.</li>
		<li>עיין בטבלה 3 עמודה עמודה G; חזור על שלבים 3.2 ו- 3.2.1 עבור מדגם הבקרה השלילית, והוסיף 700 μL של 37% פורמלדהיד, נפח השווה ל- 700 μL של פתרון BSA בקרה שלילית.</li>
	</ol></li>
	<li>הסר את הצינורות מגוש החום לאחר 10-12 דקות. זמן החימום צריך להיות עקבי ככל האפשר עבור כל דגימה. אפשרו לג'לים להתקרר על הספסל למשך 5-10 דקות (איור 1B).</li>
	<li>באמצעות מרית מעבדה חד פעמית נקייה וגמישה, הסר את דגימת הג'ל בחתיכה אחת מצינור המיקרוצנטריפוגה, והנח אותה במיכל אטום המכיל לפחות 15 מ"ל של פורמלין נייטרלי (NBF), באמצעות מיכל נפרד של NBF לכל דגימה.<ol><li>לחלופין, חתכו את החלק התחתון של צינור המיקרו-צנטריפוגה באמצעות סכין גילוח חדשה בעלת קצה יחיד, ודחפו את הג'ל החוצה מהתחתית עם אוויר או בדיקה מתאימה (איור 1C-G). הערה: ג'ל הפורמלדהיד/BSA המוצק יכול להישאר בצינורות המיקרוצנטריפוגה בטמפרטורת החדר עד 24 שעות. השארת הג'לים בצינור microcentrifuge במשך יותר מ -24 שעות עלולה לגרום להם להיות שבירים וקשים יותר לעיבוד ולניתוח.</li>
	</ol></li>
</ol>4. חיתוך, עיבוד והטמעה של ג'ל BSA
<ol><li>חותכים את חרוט הג'ל לדיסקים גליליים בעובי של כ-5 מ"מ באמצעות סכין גילוח נקי בעל קצה יחיד (איור 1H,I). עוטפים את הדיסקים בעטיפת ביופסיה, ומניחים דיסק ג'ל אחד גדול יותר לתוך קלטת אחת (שישמש במחקר הפיילוט בשלב 5), ואת דיסקי הג'ל הנותרים יחד לתוך קלטת שנייה (איור 2A,E) לשימוש בבניית מיקרו-מערך רקמות (TMA) בשלב 6. הניחו את דיסקי הג'ל העטופים בקלטות עיבוד רקמות מסומנות בבירור.<ol><li>מניחים את הג'לים הקסטות בלפחות 15 מ"ל של 10% NBF לכל דגימת ג'ל לפני העיבוד, באמצעות מיכל נפרד של NBF לכל דגימה. ג'לים יכולים להישאר ב-10% NBF למשך 6-48 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>לעבד את הג'לים במעבד רקמות היסטולוגי אוטומטי, בעקבות לוח זמנים גדול של רקמות עם לחץ ואקום. כל צעד לוקח שעה אחת: 10% NBF, 70% אתנול, 95% אתנול (חזור פעמיים), 100% אתנול (חזור פעמיים), קסילנים (חזור שלוש פעמים), פרפין ב-60 מעלות צלזיוס (חזור שלוש פעמים). הערה: עבור חוקרים הבוחרים לעבד דגימות באופן ידני, עקוב אחר אותו רצף של ריאגנטים וזמנים.</li>
	<li>לאחר השלמת עיבוד הדגימה, הסר את הקסטות ממעבד הרקמה והעבר אותן למרכז הטבעת הפרפין.</li>
	<li>פותחים את הג'לים מהביופסיה עוטפים ומטביעים את הג'לים בפרפין. עבור כל דגימה, הטבעו דיסק אחד של ג'ל בתבנית קטנה בגודל 15 מ"מ x 15 מ"מ (איור 2B-D), ואת דיסקי הג'ל הנותרים יחד בתבנית שנייה גדולה יותר (איור 2F-H). הבלוק הראשון עם דגימה אחת ישמש לבדיקת הג'ל הפפטידי במחקר פיילוט. הבלוק השני יכול לשמש לבניית TMA.</li>
</ol>5. הערכת פיילוט של סדרת דילול הפפטידים
<ol><li>עבור כל סדרת דילול פפטידים, תכנן ליצור שתי שקופיות זכוכית המכילות בסך הכל 6 חלקים נפרדים: קטע אחד מכל אחת מחמש דגימות סדרת הדילול, בתוספת קטע אחד מדגימת הבקרה השלילית BSA בלבד.<ol><li>על מגלשת הזכוכית הראשונה, חתכו מקטע אחד בעובי 4 מיקרומטר מכל אחד מהגושים הקטנים יותר המכילים דיסק ג'ל אחד עם שלושת ריכוזי הפפטידים הגבוהים ביותר (2.5 E-4 M עד 2.5 E-6 M).</li>
		<li>בשקופית שנייה, חתכו קטע אחד בעובי 4 מיקרומטר מכל בלוק עם שני ריכוזי הפפטידים הנמוכים ביותר (2.5 E-7 M ו-2.5 E-8 M) וקטע אחד מגוש הבקרה של BSA בלבד. רשום את סדר הדוגמאות בשקופיות. הערה: צפו שהג'לים המשובצים בפרפין ייחתכו בצורה חלקה, וייצרו מקטעים אחידים ללא פיצול, קריעה או פטפוטים. אם קשה לנתח דגימות ג'ל משובצות פרפין מסוימות, השרו לזמן קצר את פני הבלוק במים מזוקקים קרים כקרח לפני החתך. במידת הצורך, התנסו בזמני השרייה שונים או בתמיסות שונות (למשל, מי אמוניה).</li>
		<li>לאחר חתך, ייבשו את המגלשות בטמפרטורת החדר (כ-23 מעלות צלזיוס) למשך 24 שעות ולאחר מכן 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכתימו את שתי השקופיות שהוכנו עבור כל פפטיד בנוגדן הרצוי בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים של IHC. הערה: ריכוז הנוגדן העיקרי בהחלקה ששימש לארנבת מונוקלונלית 4B5 בהדגמה זו היה 1.5 מ"ג/מ"ל.<ol><li>צפו לראות אות אחיד יחסית בתוך כל מקטע ג'ל, כאשר דגימות הג'ל השונות מראות טווח של עוצמת אות המתאימה לדילול הפפטידים.</li>
	</ol></li>
	<li>אם התוצאות של מחקר הפיילוט משביעות רצון, בנו TMA מבלוקים של תורמי ג'ל המכילים ריכוזים שונים של אנטיגן פפטידי, כמתואר בשלבים הבאים של הפרוטוקול.</li>
</ol>6. בניית ג'ל TMA של BSA
<ol><li>בנה מיקרו-מערך רקמות המכיל ליבות כפולות בקוטר 1 מ"מ מבלוקים של תורמים המכילים ג'ל BSA בלבד וג'ל BSA המכיל את כל חמשת הדילולים של פפטיד ERBB2. הערה: אם תרצה, כלול ג'לים BSA המכילים את אותם חמישה דילולים של פפטיד שאינו מטרה כבקרות שליליות נוספות. אם תרצה, כלול ליבות של קווי תאים מייצגים המבטאים ERBB2 כפקדים חיוביים.</li>
	<li>חתכו חלקים בעובי 4 מיקרומטר של ה-TMA והכתימו ב-1.5 מ"ג/מ"ל של אנטי-ERBB2/HER2/neu ארנב מונוקלונלי 4B5 (ראו טבלת חומרים) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים במעבדה.</li>
	<li>הערך את עוצמת הכתם המתקבלת באופן איכותי על ידי בדיקה או כמותית על ידי סריקה וניתוח של תמונות דיגיטליות (איור 3A,B). הערה: מכיוון שניתוח תמונות דיגיטלי אינו המוקד של פרוטוקול זה, שלבים אלה נותרים לקורא לבצע בהתאם להעדפתו.</li>
</ol>

<ol><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry%3A+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+and+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li>
<li>Hötzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li>
<li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+immunohistochemistry%3A+The+histochemical+society%27s+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li>
<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry%3A+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+and+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li>
<li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li>
<li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li>
<li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li>
<li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li>
<li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunohistochemistry%3A+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li>
<li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+and+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li>
<li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li>
<li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li>
<li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids%3A+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li>
<li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Tissue+surrogates%27+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li>
<li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges%3A+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li>
<li>Schrohl, A. -S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Brünner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+%28HER2%29+immunoreactivity%3A+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li>
<li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pep-Calc.com%3A+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computer-Aided+Molecular+Design%22%5BJournal%5D)">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li>
<li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li>
<li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li>
<li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Forsström, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li>
<li>Forsström, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673(2015).</li>
<li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research%3A+A+white+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li>
</ol>

צ'ארלס א. הוואר, קתי ג'יי הוצל, צ'ארלס א. ג'ונס, כרמינה מ. אספיריטו, לינדה ק. ריינג'ל ופרנקלין ו. פייל הם עובדים ובעלי מניות של ג'ננטק ורוש. שלוחותיהם מייצרות ריאגנטים ומכשירים ששימשו במחקר זה.

שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור דגימות אחידות של הרכב ידוע וריכוז אנטיגן כסטנדרטים בתגובות IHC, תוך שימוש בחומרים ובטכניקות המוכרות לרוב מעבדות ההיסטולוגיה. הצעד המכריע ביותר הוא לזהות את האפיטופ שאליו נקשר הנוגדן בעל העניין. פרוטוקול זה מתאר שימוש באנטיגן פפטידי ליניארי מ-ERBB2/HER2 ICD. ניתן להשתמש באותו פרוטוקול כדי ליצור ג'לים BSA המכילים אוליגונוקלאוטידים, תוויות פלואורסצנטיות, תחומי חלבונים או חלבונים באורך מלא. גישה אחרונה זו יכולה לעזור לנוגדנים הנקשרים לאפיטופים קונפורמיים שאינם נוצרים מחדש על ידי רצף פפטידים ליניאר...

אימונוהיסטוכימיה (IHC) מאפשרת זיהוי רגיש וספציפי ומדויק מרחבית של אנטיגנים מטרה בקטעי רקמות קבועים פורמלין, משובצי פרפין (FFPE). עם זאת, תוצאות צביעת IHC עשויות להיות מושפעות ממשתנים מרובים, כולל זמן איסכמיה חם וקר, קיבוע רקמות, טיפול מקדים ברקמות, תגובתיות וריכוז נוגדנים, כימיה של זיהוי בדיקה וזמני תגובה1. לפיכך, ביצועים ופרשנות הניתנים לשחזור של תגובות IHC דורשים שליטה קפדנית במשתנים אלה ושימוש בדגימות בקרה חיוביות ושליליות מאופיינות היטב. בקרות נפוצות כוללות רקמות משובצות פרפין או קווי תאים בתרבית הידועים מניתוחים עצמאיים כדי להביע את האנטיגן המעניין, אך דגימות כאלה לא תמיד זמינות1. יתר על כן, רמות הביטוי של אנטיגני המטרה ברקמות ובקרות קו התא מובנות בדרך כלל רק באופן איכותי ועשויות להיות משתנות. בקרות המכילות ריכוזים ידועים וידועים במדויק של אנטיגן מטרה יכולות לסייע באופטימיזציה של תנאי תגובת IHC. שיטה כללית, הניתנת להתאמה למגוון סוגי אנטיגנים בטווח ריכוזים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ליצירת דגימות בקרת IHC סינתטיות, תוארה על ידי המחברים2. פרוטוקול מפורט מסופק כאן ליצירה ושימוש בסוג זה של תקן.
בקרות מתאימות חיוניות לפרשנות תקפה של מבחני IHC 1,3,4. רקמות, תאים בתרבית ומצעים מצופים פפטידים שימשו כבקרות IHC בהתאם לצרכים הספציפיים של החוקרים. היתרונות והמגבלות הטמונים בשימוש ברקמות כבקרות IHC נדונו בהרחבה 1,4. עבור נוגדנים רבים, ניתן לבחור בקרות מתאימות מתוך רקמות נורמליות נבחרות המכילות אוכלוסיות תאים המבטאות את אנטיגן המטרה על פני טווח דינמי רחב. בקרות רקמות מתאימות פחות כאשר אנטיגן המטרה אינו מאופיין היטב לגבי אתר ביטוי או שפע, או כאשר אנטיגנים בעלי פוטנציאל לתגובה צולבת מתבטאים יחד באותם תאים או אתרי רקמה. בהקשרים אלה, בלוקים של קווי תאים בתרבית המבטאים את האנטיגן המעניין יכולים להיות מועילים. כדי לספק ראיות נוספות לספציפיות המטרה, ניתן להנדס את קווי התאים כך שאנטיגנים בעלי ביטוי יתר או תת-ביטוי. לדוגמה, גישה כזו שימשה לאחרונה להערכת מגוון של בדיקות נגד PD-L1 באמצעות מיקרו-מערך רקמה של קווי תאים איזוגניים המבטאים טווח של אנטיגן PD-L15. המגבלות המעשיות לשימוש השגרתי בבלוקים של קווי תאים כוללות את העלות והזמן הדרושים כדי לייצר מספרי תאים מספיקים ואת העובדה שהביטוי של אנטיגנים מסוימים עשוי שלא להיות עקבי באופן אמין, אפילו בתוך שורות תאי קלונל6. פפטידים סינתטיים הם אפשרות שלישית לבקרת IHC עבור נוגדנים המזהים אפיטופים ליניאריים קצרים. סטיבן בוגן ועמיתיו פרסמו בהרחבה על השימוש בפפטידים המוצמדים לפני השטח של שקופיות זכוכית 7,8 וחרוזי זכוכית9. מחקר אחד של קבוצה זו הראה כי ניתוח כמותי של בקרות IHC מבוססות פפטידים יכול לזהות שונות בתהליך הכתם שהוחמצה על ידי הערכה איכותית של בקרות רקמות שנותחו במקביל10. בעוד שתקנים המשתמשים באנטיגנים מבוססי חרוזים יכולים להיות ישימים באופן נרחב, פרטים רבים הם קנייניים עבור המחברים, ומגבילים אימוץ נרחב.
גישה נוספת לתקני IHC משלבת אנטיגנים ממוקדים בג'לים חלבוניים שנוצרו באופן מלאכותי. תפיסה זו הודגמה לראשונה על ידי פר ברנדצאג בשנת 1972 במחקר שבו סרום ארנבים רגיל עבר פולימריזציה באמצעות גלוטרלדהיד11. בלוקים קטנים של הג'ל שנוצר הושרו לאחר מכן במשך 1-4 שבועות בתמיסות המכילות את האנטיגנים האימונוגלובולינים המעניינים בריכוזים שונים. לאחר קיבוע אלכוהול והטבעת פרפין, חלקים מהפקדים שהתקבלו הוכתמו בעוצמות המתאימות ללוגריתם של תמיסות האנטיגן שבהן הושרו. מאוחר יותר, החוקרים הכינו צמדי גלוטארלדהיד של חומצות אמינו ספציפיות ב-BSA מדולל או בתמיסות הומוגנטיות במוח כבקרות חיוביות במחקרי מיקרוסקופיה חיסונית-אלקטרונית 12,13. עבודה עדכנית יותר בחנה את השימוש בג'לים העשויים מתמיסות חלבון קבועות פורמלדהיד כפונדקאיות עבור רקמת FFPE בניתוח ספקטרומטריית מסה14. עבודה נוספת שנערכה לאחרונה בחנה את המבנה והתכונות של ג'לים הנוצרים על ידי חימום תמיסות אלבומין בסרום אנושי או בקר בריכוזים שונים וב-pH15. מחברים אלה מצאו כי אלבומין בסרום יוצר שלושה סוגים של ג'לים הנבדלים זה מזה באלסטיות מכנית, בשימור מבנה משני וביכולת קשירת חומצות שומן בהתאם לתנאי הניסוי. יחד, מאמרים אלה מדגימים את ההיתכנות הכללית של הגישה הנהוגה כאן. תמיסות חלבונים בעלות הרכב מוגדר יוצרות ג'לים דמויי רקמה הניתנים לעיבוד, חתך והכתמה נוספים בשיטות היסטולוגיות שגרתיות.
פרוטוקול זה מתאר את היווצרותה של בקרת IHC סינתטית העשויה מאלבומין בסרום בקר (BSA) שעבר פולימריזציה בחום ובפורמלדהיד. הג'לים יכולים לשלב מגוון רחב של אנטיגנים, כולל חלבונים באורך מלא, תחומי חלבונים ופפטידים ליניאריים, כמו גם אנטיגנים שאינם חלבונים כולל אוליגונוקלאוטידים2. הדגמה זו משתמשת באנטיגן לדוגמה, פפטיד ליניארי המקודד את חומצות האמינו C-terminal 16 של חלבון ERBB2 (HER2/neu) האנושי TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (ראו טבלת חומרים). רצף זה כולל את האפיטופים המוכרים על ידי שלושה נוגדנים זמינים מסחרית ורלוונטיים מבחינה אבחנתית, כולל המגיב הפוליקלונלי הרצפטי ביותר (ENPEYLGLDVP) והנוגדנים החד-שבטיים CB11 (AENPEYL) ו-4B5 (TAENPEYLGL) (ראו טבלת חומרים)16.
השיטה המודגמת כאן משתמשת בריאים בריאים בריאים ריאגנטים באמצעות תהליכים וטכניקות המוכרות לכל מעבדה היסטולוגית מתאמנת. המגבלה המשמעותית ביותר היא הצורך לזהות ולרכוש את האנטיגנים של היעד, דבר שניתן להשיג במקרים רבים בעלות צנועה יחסית. מכיוון שבקרות סינתטיות אלה הן בעלות הרכב מוגדר לחלוטין ועשויות בשיטות פשוטות, ניתן ליישם אותן במעבדות רבות עם תוצאות הניתנות לשחזור. השימוש בהם עשוי להקל על הערכה אובייקטיבית וניתנת לכימות של תוצאות צביעת IHC ולאפשר יכולת שכפול תוך-מעבדתית ובין-מעבדתית גדולה יותר.

<table><tbody><tr><td>אנטי-HER2 / neu שיבוט 4B5</td><td>Ventana</td><td>5278368001</td><td></td></tr><tr><td>ביופסיה עוטפת Leica</td><td></td><td>3801090</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין,</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td> טהורה במיוחד <td>BSA #9998</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>קורנינג</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>תבנית בסיס חד פעמית (15 מ"מ x 15 מ"מ)</td> <td>פישר</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>תבנית בסיס חד פעמית (24 מ"מ x 24 מ"מ)Fisher</td><td></td> <td>22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>מרית חד פעמית</td><td>VWR</td><td>80081-188</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>37% פורמלדהיד</td><td>אלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה</td><td>15686</td><td></td></tr><tr><td>ERBB2 / HER2 פפטיד</td><td></td><td></td><td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td></tr><tr><td>Leica Autostainer XL</td><td>Leica</td><td>ST5010</td><td></td></tr><tr><td>מגנטי לערבב בר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT מצלמת שקופיות שלמה</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% ניטרלי חוצץ פורמלין</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרופוגה ללא נוקלאז 1.5 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרפלסט פרפלסט</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>פפטיד מחשבון פרמטרים</td><td>Pep-Calc17</td><td>https://www.pep-calc.com/</td><td></td></tr> <tr><td>ספקי פפטידים</td><td>ABclonal Science</td><td></td><td>המשתמשים צריכים ליצור קשר עם ספקי פפטידים לקבלת פרטים על מסה, טוהר ועלות.</td></tr><tr><td></td><td>משתמשי Anaspec Peptide</td><td></td><td>צריכים ליצור קשר עם ספקי פפטידים לקבלת פרטים על מסה, טוהר ועלות.</td></tr><tr><td></td><td>משתמשים מדעיים</td><td></td> של CPC <td>צריכים ליצור קשר עם ספקי פפטידים לקבלת פרטים על מסה, טוהר ועלות.</td></tr><tr><td></td> משתמשי פפטיד <td></td><td>בניו אינגלנד</td><td>צריכים ליצור קשר עם ספקי פפטידים לקבלת פרטים על מסה, טוהר ועלות.</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגיב אלכוהול</td><td>תרמו מדעי</td><td>9111</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח קצה יחיד</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus שקופיות מיקרוסקופ טעונות חיובית</td><td>Thermo Scientific</td><td>6776214</td><td></td></tr><tr><td>TMA רקמות גרנד מאסטר</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>VWR</td><td>ברקוד 89370-088</td><td></td></tr></tbody></table>

בקרות אנטיגן סינתטיות לאימונוהיסטוכימיה

Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

מבחני אימונוהיסטוכימיה (IHC) מספקים תובנות חשובות על דפוסי ביטוי חלבונים, שהפרשנות המהימנה שלהם דורשת דגימות בקרה חיוביות ושליליות מאופיינות היטב. מאחר שפקדי רקמות או קו תאים מתאימים אינם תמיד זמינים, שיטה פשוטה ליצירת בקרות IHC סינתטיות עשויה להועיל. שיטה כזו מתוארת כאן. הוא ניתן להתאמה לסוגי אנטיגנים שונים, כולל חלבונים, פפטידים או אוליגונוקלאוטידים, במגוון רחב של ריכוזים. פרוטוקול זה מסביר את השלבים הדרושים ליצירת בקרות אנטיגן סינתטיות, תוך שימוש כדוגמה בפפטיד מהתחום התוך-תאי של אונקוגן אריתרובלסטי אנושי B2 (ERBB2/HER2) (ICD) המוכר על ידי מגוון נוגדנים רלוונטיים מבחינה אבחנתית. דילולים סדרתיים של פפטיד HER2 ICD בתמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) מעורבבים עם פורמלדהיד ומחוממים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס כדי להתמצק ולקשר את תערובת הפפטיד/BSA. ניתן לעבד, לחתוך ולהכתים את הג'ל שנוצר כמו רקמה, ולהניב סדרה של דגימות של ריכוזי אנטיגן ידועים המשתרעים על פני מגוון רחב של עוצמות צביעה.
פרוטוקול פשוט זה עולה בקנה אחד עם נהלי מעבדה היסטולוגיים שגרתיים. השיטה דורשת רק שלמשתמש תהיה כמות מספקת של האנטיגן הרצוי. חלבונים רקומביננטיים, תחומי חלבונים או פפטידים ליניאריים המקודדים אפיטופים רלוונטיים עשויים להיות מסונתזים באופן מקומי או מסחרי. מעבדות המייצרות נוגדנים פנימיים יכולות לשריין אליקוטים של האנטיגן המחסן כמטרה להדברה סינתטית. ההזדמנות ליצור בקרות חיוביות מוגדרות היטב במגוון רחב של ריכוזים מאפשרת למשתמשים להעריך את ביצועי הבדיקה התוך-מעבדתית והבין-מעבדתית, לקבל תובנה לגבי הטווח הדינמי והלינאריות של הבדיקות שלהם, ולמטב את תנאי הבדיקה למטרות הניסוי הספציפיות שלהם.

פפטידים צריכים להתמוסס לחלוטין בממס מתאים בטמפרטורת החדר כדי ליצור פתרון ברור אופטית. אם חומר חלקיקי נראה לעין עדיין קיים לאחר 30-60 דקות, ייתכן שיהיה זה מועיל להוסיף נפחים נוספים של הממס המקורי או ממס חלופי שאינו עולה על הנפח המיועד של תמיסת מלאי הפפטידים 5x המחושבת בטבלה 1. באופן דומה, תמיסת הפפטיד/BSA המשולבת צריכה להישאר שקופה (איור 1A).
דגימות ג'ל פפטיד/BSA אמורות ליצור מסת גומי אטומה לאחר חימום עם 37% פורמלדהיד (איור 1B-...

עבודה זו מתעדת שיטה פשוטה ליצירת בקרות אנטיגן סינתטיות לאימונוהיסטוכימיה. הטכניקה ניתנת להתאמה למגוון אנטיגנים במגוון רחב של ריכוזים. הדוגמאות מספקות אסמכתא שבאמצעותה ניתן להעריך את הביצועים ויכולת השכפול של בדיקות תוך ובין בדיקות.

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

ג'ל אנטיגן BSA מאופיין היטב בתקני IHC הניתנים לשחזור שיכולים להשלים את הבקרות הקיימות. פרוטוקול זה משתמש בהיסטולוגיה סטנדרטית ובריאגנטים של IHC ובשיטות כדי ליצור סטנדרטים הניתנים לשחזור של הרכב ידוע. בקרות אלה מספקות הזדמנות למעבדות שונות לכייל ולתקנן מבחני IHC עבור מבחנים רלוונטיים רבים מבחינה אבחנתית.חשוב למצוא ממס מתאים להמסת הפפטיד או החלבון. זה יכול להיות מסובך לערבב תמיסות אנטיגן ופורמלדהיד במהירות מבלי להציג בועות. כדי להתחיל, להכין 20 מיליליטר של 25% משקל לפי נפח BSA פתרון על ידי ערבוב חמישה גרם של אבקת BSA ב 14 מיליליטר של PBS, בצינור חרוטי 50 מיליליטר עד לפיזור שווה.מערבבים את התמיסה להמסת אבקת BSA. שמור את התמיסה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס לפירוק מלא. למחרת, התאם את הנפח הסופי ל -20 מיליליטר עם PBS.באופן דומה, הכינו 20 מיליליטר של תמיסת BSA במשקל 31.3% לפי נפח על ידי ערבוב 6.26 גרם אבקת BSA ב-13 מיליליטר של PBS. לאחר דגירה של לילה לפירוק מלא, התאם את הנפח הסופי ל -20 מיליליטר עם PBS. כדי לבדוק כי תערובת פורמלדהיד BSA יוצרת ג'ל, לחמם בלוק חום ל 85 מעלות צלזיוס.לאחר מכן ערבבו 700 מיקרוליטרים של תמיסה של 25% BSA עם 700 מיקרוליטרים של 37% פורמלדהיד. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים תוך חמש עד עשר שניות מבלי ליצור בועות אוויר. מיד לאחר הערבוב, מניחים את צינור המיקרו-צנטריפוגה הסגור בבלוק החום שחומם מראש ל-85 מעלות צלזיוס.לאחר 10 דקות, הסר את הצינור מגוש החום. תן לו להתקרר ולאשר כי הג'ל נוצר כצפוי. הכן ותייג בבירור שמונה צינורות מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.לאחר מכן להכין תמיסת מלאי פפטיד 5x, להוסיף ריכוז 12.5 מילימולר על ידי החייאת כל המסה של פפטיד ליברליזציה ב 60 microliters של הממס המתאים. שים לב לפתרון כדי להבטיח כי הפפטיד מומס לחלוטין. לאחר מכן הוסיפו נפח נוסף של ממס לפי הצורך כדי ליצור תמיסה של 12.5 מילימולאר בהתאם למשקל המולקולרי של הפפטידים, למסה ולטוהר.בדוגמה זו, למלאי הפפטידים 5x יש נפח סופי של 626.9 מיקרוליטרים. דגימות פפטידים אחרות ידרשו נפח סופי שונה. לאחר מכן, הכינו 150 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי פפטידים 1x הוסיפו ריכוז של 2.5 מילימולאר על ידי דילול 30 מיקרוליטרים של מלאי הפפטידים 5x ל-120 מיקרוליטרים של הממס.מערבבים את התמיסה במשך חמש שניות וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו 700 מיקרוליטרים של תמיסת BSA פפטידית 0.5 מילימולרית על ידי דילול 140 מיקרוליטרים של מלאי הפפטידים 1x ל-560 מיקרוליטרים של תמיסת BSA של 31.3%. לאחר מערבולת, צנטריפוגה של התמיסה בטמפרטורת החדר.באופן דומה, הכן ארבעה דילול סדרתי רציף של פי 10 של מלאי BSA הפפטידי על ידי הוספת 70 מיקרוליטרים של תמיסת BSA הפפטידית ל-630 מיקרוליטר של תמיסת BSA של 25%. כדי להכין את ג'ל הפפטיד BSA, הוסיפו 37% פורמלדהיד לדילולי BSA הפפטידיים ביחס של אחד לאחד העובדים בדגימה אחת בכל פעם. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים תוך חמש עד עשר שניות מבלי ליצור בועות אוויר.לאחר הערבוב, מניחים את צינור המיקרו-צנטריפוגה הסגור בבלוק חום בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר שכל תמיסות הפפטיד BSA והפורמלדהיד הוכנו וחוממו, אפשרו לג'לים להתקרר על הספסל במשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, באמצעות מרית מעבדה חד פעמית נקייה וגמישה, הסר את דגימת הג'ל מצינור המיקרו-צנטריפוגה בחתיכה אחת.ומניחים אותו במיכל אטום המכיל לפחות 15 מיליליטר של פורמלין חוצץ נייטרלי, באמצעות מיכל נפרד עבור כל דגימה. לחלופין, באמצעות סכין גילוח חדש בעל קצה יחיד, חתכו את החלק התחתון של שפופרת המיקרו-צנטריפוגה ודחפו את הג'ל החוצה מלמטה באמצעות אוויר או בדיקה מתאימה. בעזרת סכין גילוח נקי בעל קצה אחד חותכים את חרוט הג'ל לדיסקים גליליים בעובי של כחמישה מילימטרים.לאחר עטיפת הדיסקים בעטיפת ביופסיה, מניחים דיסק ג'ל אחד גדול יותר לתוך קלטת אחת ואת דיסקיות הג'ל הנותרות יחד לתוך קלטת שנייה לשימוש בבניית מיקרו-מערך רקמות. לפני העיבוד, מניחים את ג'ל הקלטת בלפחות 15 מיליליטר של 10% פורמלין חוצץ ניטרלי לכל ג'ל, באמצעות מיכל נפרד עבור כל דגימה. לאחר מכן, לעבד את הג'לים במעבד רקמות היסטולוגיה אוטומטי לאחר לוח זמנים של רקמות גדולות עם לחץ ואקום.לאחר השלמת עיבוד הדגימה, הסר את הקלטות ממעבד הרקמות והעבר אותן למרכז ההטבעה של הפרפין. לאחר הסרת הג'לים ממעטפת הביופסיה, הטמיעו את הג'לים בפרפין או כל דגימה הטמיעו דיסק אחד של ג'ל בתבנית קטנה של 15 על 15 מילימטר. ואת דיסקיות ג'ל הנותרים יחד בתבנית שנייה גדולה יותר.עבור כל סדרת דילול פפטידים, צור שתי שקופיות זכוכית המכילות בסך הכל שישה חלקים נפרדים. מקטע אחד מכל אחת מחמש דגימות סדרת הדילול ומקטע אחד מדגימת הבקרה השלילית של BSA בלבד. לאחר החלוקה וייבוש השקופיות, צבעו את שתי השקופיות שהוכנו לכל פפטיד בנוגדן הראשוני הרצוי.על פי פרוטוקולים אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים מצפים לראות אות אחיד יחסית בתוך כל מקטע ג'ל. עם דגימות הג'ל השונות המציגות טווח של עוצמת אות המתאימה לדילולים הפפטידיים. עבור בניית מיקרו-מערך רקמת ג'ל BSA, חותכים חתכים חתכים בעובי ארבעה מיקרומטר של מיקרו-מערך הרקמה ומכתימים בנוגדן חד שבטי ארנב על פי פרוטוקולים סטנדרטיים של המעבדה.הערך את עוצמת הכתם המתקבלת באופן איכותי על ידי בדיקה או קנה כמותית סריקה וניתוח של תמונות דיגיטליות. לאחר תגובה עם הנוגדנים המתאימים, שליטה שלילית BSA רק דגימות ג'ל הראו אות מינימלי. עוצמת האות בדגימת ג'ל בודדת היא אחידה יחסית ועולה עם העלייה בריכוזי האנטיגן.יותר מ-10% מתאי MDA-MB-175 מראים כתמים קלושים ובהיקף מלא. לעומת זאת, יותר מ -10% מתאי SKBR-3, מראים צביעה ממברנית אינטנסיבית היקפית לחלוטין עבודה מהירה לאחר הוספת הפורמלדהיד מכיוון שהתמיסות יתחילו לג'ל גם בטמפרטורת החדר. אנו משתמשים בשיטה זו כדי ליצור בקרות IHC בעת בדיקת נוגדנים חדשים כדי לתת לנו ביטחון שהבדיקה תבוצע כצפוי, גם כאשר נוגדני הבדיקה אינם מראים אות.בקרות רקמות או קווי תאים משתנות מטבען. בקרות אנטיגן סינתטיות מאפשרות לנו למדוד את ההשפעה של שינוי תנאי תגובת ISD ספציפיים בצורה מדויקת יותר.

synthetic-antigen-controls-for-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימלי ומפורט לצביעה חיסונית כפולה בחלקי רקמת מערכת העצבים המרכזית של חולדה (CNS) ובלוטות הלימפה ההיקפית (LN) קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין.

Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

פרוטוקול רמת מבוא זה מתאר את הריאגנטים, הציוד והטכניקות הנדרשים להשלמת צביעה אימונוהיסטוכימית של מוחות מכרסמים, תוך שימוש בסמנים למיקרוגליה ואלמנטים עצביים כדוגמה.

פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים

פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת בחיי עיר MHC-tetramer מכתים עם אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע לוקליזציה, פנוטיפ וכמות תאי T אנטיגן ספציפי ברקמות. פרוטוקול זה משמש כדי לקבוע את המאפיינים המרחבי, פנוטיפי של אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T ביחס אחרים סוג התא ומבני ברקמות.

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה פשוטה ונגישה להמחיש, לכמת, ומיפוי תאים חיסוניים ב-formalin-קבוע פרפין מוטבע רקמת הגידול סעיפים. מתודולוגיה זו משלבת הדמיה קיימת טכניקות ניתוח דיגיטלי עם המטרה של הרחבת יכולת ריבוב וניתוח רב פרמטרים של הדמיה מספר.

הדמיה, קוונפיקציה, ומיפוי של אוכלוסיות תאים החיסונית במיקרו סביבה הגידול

מספר שיטות שונות הוקמו עבור חיסוני הקולנוע באמצעות נוגדנים עיקריים מאותו מין מארח. כאן, אנו מתארים את השימוש של מיקרוגל בתיווך נוגדן בנוכחות של fluorophore-tyramide כדי לחסום נוגדנים לחצות את הנוגדן במהלך כתמים חיסוני במגה-בניין על formalin-קבוע מוטבע האדרנל העכבר סעיפים.

המיקרוגל והפלואורופפור-טירמידה לשימוש בחומרים מדומים על העכבר באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין מארח

מוצג כאן פרוטוקול ליצירת בקרות כדוריות תאים קבועות בפורמלין, משובצות פרפין, לאימונוהיסטוכימיה.

עיבוד מתוקנן עבור בקרות אימונוהיסטוכימיה של כדוריות תאים קבועות בפורמלין, משובצות פרפין.

לכידת שינויים דינמיים בהפעלת החלבונים של תאי דם אדומים מעוררים אתגרים מתודולוגיים, כמו שימור שינויים דינמיים לגירויים חריפים לצורך הערכה מאוחרת יותר. הפרוטוקול המוצג מתאר טכניקות הכנת דגימה וצביעה המאפשרות שימור וניתוח של שינויי חלבון רלוונטיים וזיהוי לאחר מכן.

זיהוי מבוסס חיסונים של שינויים דינמיים בחלבוני תאי דם אדומים

פרוטוקול ניסיוני זה מתאר ומייעל שיטת צביעה של אימונוהיסטוכימיה מרובת אולמים (IHC), בעיקר על ידי אופטימיזציה של תנאי דגירה של נוגדנים חד-ערוציים והתאמת ההגדרות של נוגדנים ותעלות לפתרון בעיות של אוטופלואורסנציה ותקשורת צולבת ערוצים ברקמות סרטן ריאות ממוצא קליני.

צביעה אימונוהיסטוכימית מולטיפלקס לרקמת סרטן ריאות משובצת פרפין

אימונוהיסטוכימיה מחזורית מולטיפלקס מאפשרת זיהוי באתרו של סמנים מרובים בו זמנית באמצעות דגירה חוזרת של נוגדני אנטיגן, סריקת תמונה ויישור תמונה ואינטגרציה. כאן אנו מציגים את פרוטוקול הפעולה לזיהוי מצעי תאי מערכת החיסון בטכנולוגיה זו בסרטן ריאות ובדגימות גרורות מוחיות זוגיות.

אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מחזורית מרובת משתתפים

למד ליצור בקרות אנטיגן סינתטיות לאימונוהיסטוכימיה באמצעות ג'לי BSA ופורמלדהיד. שיטה זו מאפשרת לכייל ולתקנן בדיקות IHC ולשפר את מהימנות התוצאות האבחוניות.

בקרות אנטיגן סינתטיות לאימונוהיסטוכימיה

גלה סרטונים נוספים