בקרות אנטיגן סינתטיות לאימונוהיסטוכימיה

ג'ל אנטיגן BSA מאופיין היטב בתקני IHC הניתנים לשחזור שיכולים להשלים את הבקרות הקיימות. פרוטוקול זה משתמש בהיסטולוגיה סטנדרטית ובריאגנטים של IHC ובשיטות כדי ליצור סטנדרטים הניתנים לשחזור של הרכב ידוע. בקרות אלה מספקות הזדמנות למעבדות שונות לכייל ולתקנן מבחני IHC עבור מבחנים רלוונטיים רבים מבחינה אבחנתית.

חשוב למצוא ממס מתאים להמסת הפפטיד או החלבון. זה יכול להיות מסובך לערבב תמיסות אנטיגן ופורמלדהיד במהירות מבלי להציג בועות. כדי להתחיל, להכין 20 מיליליטר של 25% משקל לפי נפח BSA פתרון על ידי ערבוב חמישה גרם של אבקת BSA ב 14 מיליליטר של PBS, בצינור חרוטי 50 מיליליטר עד לפיזור שווה.

מערבבים את התמיסה להמסת אבקת BSA. שמור את התמיסה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס לפירוק מלא. למחרת, התאם את הנפח הסופי ל -20 מיליליטר עם PBS.

באופן דומה, הכינו 20 מיליליטר של תמיסת BSA במשקל 31.3% לפי נפח על ידי ערבוב 6.26 גרם אבקת BSA ב-13 מיליליטר של PBS. לאחר דגירה של לילה לפירוק מלא, התאם את הנפח הסופי ל -20 מיליליטר עם PBS. כדי לבדוק כי תערובת פורמלדהיד BSA יוצרת ג'ל, לחמם בלוק חום ל 85 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן ערבבו 700 מיקרוליטרים של תמיסה של 25% BSA עם 700 מיקרוליטרים של 37% פורמלדהיד. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים תוך חמש עד עשר שניות מבלי ליצור בועות אוויר. מיד לאחר הערבוב, מניחים את צינור המיקרו-צנטריפוגה הסגור בבלוק החום שחומם מראש ל-85 מעלות צלזיוס.

לאחר 10 דקות, הסר את הצינור מגוש החום. תן לו להתקרר ולאשר כי הג'ל נוצר כצפוי. הכן ותייג בבירור שמונה צינורות מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן להכין תמיסת מלאי פפטיד 5x, להוסיף ריכוז 12.5 מילימולר על ידי החייאת כל המסה של פפטיד ליברליזציה ב 60 microliters של הממס המתאים. שים לב לפתרון כדי להבטיח כי הפפטיד מומס לחלוטין. לאחר מכן הוסיפו נפח נוסף של ממס לפי הצורך כדי ליצור תמיסה של 12.5 מילימולאר בהתאם למשקל המולקולרי של הפפטידים, למסה ולטוהר.

בדוגמה זו, למלאי הפפטידים 5x יש נפח סופי של 626.9 מיקרוליטרים. דגימות פפטידים אחרות ידרשו נפח סופי שונה. לאחר מכן, הכינו 150 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי פפטידים 1x הוסיפו ריכוז של 2.5 מילימולאר על ידי דילול 30 מיקרוליטרים של מלאי הפפטידים 5x ל-120 מיקרוליטרים של הממס.

מערבבים את התמיסה במשך חמש שניות וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו 700 מיקרוליטרים של תמיסת BSA פפטידית 0.5 מילימולרית על ידי דילול 140 מיקרוליטרים של מלאי הפפטידים 1x ל-560 מיקרוליטרים של תמיסת BSA של 31.3%. לאחר מערבולת, צנטריפוגה של התמיסה בטמפרטורת החדר.

באופן דומה, הכן ארבעה דילול סדרתי רציף של פי 10 של מלאי BSA הפפטידי על ידי הוספת 70 מיקרוליטרים של תמיסת BSA הפפטידית ל-630 מיקרוליטר של תמיסת BSA של 25%. כדי להכין את ג'ל הפפטיד BSA, הוסיפו 37% פורמלדהיד לדילולי BSA הפפטידיים ביחס של אחד לאחד העובדים בדגימה אחת בכל פעם. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים תוך חמש עד עשר שניות מבלי ליצור בועות אוויר.

לאחר הערבוב, מניחים את צינור המיקרו-צנטריפוגה הסגור בבלוק חום בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר שכל תמיסות הפפטיד BSA והפורמלדהיד הוכנו וחוממו, אפשרו לג'לים להתקרר על הספסל במשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, באמצעות מרית מעבדה חד פעמית נקייה וגמישה, הסר את דגימת הג'ל מצינור המיקרו-צנטריפוגה בחתיכה אחת.

ומניחים אותו במיכל אטום המכיל לפחות 15 מיליליטר של פורמלין חוצץ נייטרלי, באמצעות מיכל נפרד עבור כל דגימה. לחלופין, באמצעות סכין גילוח חדש בעל קצה יחיד, חתכו את החלק התחתון של שפופרת המיקרו-צנטריפוגה ודחפו את הג'ל החוצה מלמטה באמצעות אוויר או בדיקה מתאימה. בעזרת סכין גילוח נקי בעל קצה אחד חותכים את חרוט הג'ל לדיסקים גליליים בעובי של כחמישה מילימטרים.

לאחר עטיפת הדיסקים בעטיפת ביופסיה, מניחים דיסק ג'ל אחד גדול יותר לתוך קלטת אחת ואת דיסקיות הג'ל הנותרות יחד לתוך קלטת שנייה לשימוש בבניית מיקרו-מערך רקמות. לפני העיבוד, מניחים את ג'ל הקלטת בלפחות 15 מיליליטר של 10% פורמלין חוצץ ניטרלי לכל ג'ל, באמצעות מיכל נפרד עבור כל דגימה. לאחר מכן, לעבד את הג'לים במעבד רקמות היסטולוגיה אוטומטי לאחר לוח זמנים של רקמות גדולות עם לחץ ואקום.

לאחר השלמת עיבוד הדגימה, הסר את הקלטות ממעבד הרקמות והעבר אותן למרכז ההטבעה של הפרפין. לאחר הסרת הג'לים ממעטפת הביופסיה, הטמיעו את הג'לים בפרפין או כל דגימה הטמיעו דיסק אחד של ג'ל בתבנית קטנה של 15 על 15 מילימטר. ואת דיסקיות ג'ל הנותרים יחד בתבנית שנייה גדולה יותר.

עבור כל סדרת דילול פפטידים, צור שתי שקופיות זכוכית המכילות בסך הכל שישה חלקים נפרדים. מקטע אחד מכל אחת מחמש דגימות סדרת הדילול ומקטע אחד מדגימת הבקרה השלילית של BSA בלבד. לאחר החלוקה וייבוש השקופיות, צבעו את שתי השקופיות שהוכנו לכל פפטיד בנוגדן הראשוני הרצוי.

על פי פרוטוקולים אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים מצפים לראות אות אחיד יחסית בתוך כל מקטע ג'ל. עם דגימות הג'ל השונות המציגות טווח של עוצמת אות המתאימה לדילולים הפפטידיים. עבור בניית מיקרו-מערך רקמת ג'ל BSA, חותכים חתכים חתכים בעובי ארבעה מיקרומטר של מיקרו-מערך הרקמה ומכתימים בנוגדן חד שבטי ארנב על פי פרוטוקולים סטנדרטיים של המעבדה.

הערך את עוצמת הכתם המתקבלת באופן איכותי על ידי בדיקה או קנה כמותית סריקה וניתוח של תמונות דיגיטליות. לאחר תגובה עם הנוגדנים המתאימים, שליטה שלילית BSA רק דגימות ג'ל הראו אות מינימלי. עוצמת האות בדגימת ג'ל בודדת היא אחידה יחסית ועולה עם העלייה בריכוזי האנטיגן.

יותר מ-10% מתאי MDA-MB-175 מראים כתמים קלושים ובהיקף מלא. לעומת זאת, יותר מ -10% מתאי SKBR-3, מראים צביעה ממברנית אינטנסיבית היקפית לחלוטין עבודה מהירה לאחר הוספת הפורמלדהיד מכיוון שהתמיסות יתחילו לג'ל גם בטמפרטורת החדר. אנו משתמשים בשיטה זו כדי ליצור בקרות IHC בעת בדיקת נוגדנים חדשים כדי לתת לנו ביטחון שהבדיקה תבוצע כצפוי, גם כאשר נוגדני הבדיקה אינם מראים אות.

בקרות רקמות או קווי תאים משתנות מטבען. בקרות אנטיגן סינתטיות מאפשרות לנו למדוד את ההשפעה של שינוי תנאי תגובת ISD ספציפיים בצורה מדויקת יותר.