Name: בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון G (GPCRs) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למדו שיטת נפיחת אגרוז לשילוב קולטני GPCR בממברנות שומניות גדולות. הטכניקה מדגימה שילוב קולטן הסרוטונין 5-HT1AR תוך שמירה על פעילות תפקודית במערכת מודל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למת'יו בלוסר על דיון ועצות יקרות ערך. עבודה זו נתמכה על ידי המשרד למחקר ימי (N00014-16-1-2382) והקרן הלאומית למדע (PHY-1915017).

1. תיוג חלבונים
<ol><li>אפשר NHS-רודמין, שברי ממברנה 5-HT1A , ועמוד התפלה אחד 7 K MWCO ספין להתפלש בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש להמיס 1 מ"ג NHS-רודמין ב-100 מיקרו-לן של דימתיל סולפוקסיד (DMSO).</li>
	<li>הוסף 5 μL של פתרון 1 M נתרן ביקרבונט כדי להגדיל את ה- pH של פתרון 5-HT1AR ל- pH 8.</li>
	<li>הוסף 3.66 μL של פתרון NHS-רודמין ל 50 μL של פתרון 5-HT1AR ו pipette בעדינות למעלה ולמטה בצינור microcentrifuge. הערה: יש להקפיד על עודף טוחן של NHS-רודמין פי 10 לפחות.</li>
	<li>שומרים על התערובת מוגנת מפני אור ומניחים על סיבוב בטמפרטורת החדר במשך שעה 1.</li>
	<li>לשטוף עמוד ספין 7 k MWCO עם 200 μL של תמיסת מלח פוספט 1x (1x PBS) שלוש פעמים במשך 1.5 דקות ב 1.5 RCF עבור כל לשטוף.</li>
	<li>מוסיפים את החלבון המסומן לעמודה אחת ומאזנים את הכמות בצינור מיקרוצנטריפוגה אחר.</li>
	<li>ספין את החלבון המסומן פעם אחת במשך 5 דקות ב 1.5 RCF.</li>
	<li>קח ספקטרום UV-vis באמצעות ספקטרופוטומטר ננו טיפה ב 280 ננומטר ו 554 ננומטר ולחשב את יעילות תיוג בעקבות המדריך של היצרן.</li>
	<li>יש לאחסן את החלבון המסומן המכוסה ב-5 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. הפתרון יציב כשבוע לאחר התיוג.</li>
</ol>2. ג'וונים עם 5-HT 1A משולבים בממברנה
<ol><li>הכנת חומרים וריאגנטים
	<ol>
<li>אפשרו לחלבון, שומנים ו-BSA (אלבומין בסרום בקר) להתכווצ לטמפרטורת החדר.</li>
		<li>במהלך תקופה זו, לנקות את כיסויים על ידי הצבת אותם מתנול sonicating במשך 30 דקות ב 40 °C (50 °F). ודא כי מתנול מכסה לחלוטין את כיסויים ואת מפלס המים באמבט המים הוא מעל הרמה של מתנול במיכל. הערה: מתנול רעיל ויש לטפל בו במכסה כימי מתאים.</li>
		<li>יבש את מתנול עודף על כיסויים עם זרם עדין של אוויר. מניחים את מתלה כיסוי מכוסה בתנור 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להבטיח כי כיסויים עודפים להתייבש.</li>
		<li>התחל בתהליך ניקוי הפלזמה. ראשית, מניחים את כיסויי הניקוי לתוך מנקה הפלזמה ולסגור את שסתום צריכת האוויר כדי לפנות את כל האוויר בתוך התא.</li>
		<li>לאחר התא הוא תחת ואקום, לנקות את כיסויים במשך 5 דקות באמצעות הגדרת כוח RF גבוהה ואקום כמעט שלם, עם צריכת אוויר קלה בלבד לתוך תא הוואקום. כדי להבטיח את הרמה הנכונה של פלזמה, להתאים את הפתיחה של תא ואקום כך צבע התוצאה של הפלזמה הוא יציב, ורוד בהיר. הערה: זה חיוני בעת שימוש באוויר כי הפלזמה נשארת צבע ורוד בהיר למשך שלב הטיפול בפלזמה, כמו צבע סגול כהה יותר מציין כי יש כמות לא נכונה של אוויר בתא ויביא לטיפול פלזמה תת-אופטימלית.</li>
		<li>לאחר 5 דקות עברו, לכבות את כוח RF ולשחרר את הוואקום. הערה: עם ההסרה מתא הפלזמה, אנא ודא כי כיסויים להישאר מכוסה.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת הידרוג'ל
	<ol>
<li>שלבו 6 מ"ג של אגרת התכה נמוכה במיוחד עם 300 מיקרו-אל של מים אולטרה-תותים (כלומר, 2% (w/v) אגרוז). הערה: 2% אגרוז ישמש לייצור GUV ללא חלבון. פתרון אגרוז ניתן לשמור על 45 °C (55 °F) במשך יומיים.</li>
		<li>שלב 9 מ"ג של אגרוז בטמפרטורה נמוכה במיוחד עם 300 μL של מים אולטרה-תותים עבור 3 w / v% agarose על ידי כפי שהוכן בשלב 3.1. 3% אגרוז ישמש לייצור חלבונים משולבים GUVs.</li>
		<li>מערבולת את הפתרון לזמן קצר לפני הצבתם על בלוק חום 90 °C (90 °F) במשך 10 דקות. לאחר מכן, מערבולת הצינור שוב לפני העברתו בלוק חום 45 °C (45 °F) כדי לשמור אותו בצורה מותכת עד לשימוש נוסף.</li>
	</ol></li>
	<li>אגרוז וערבוב חלבונים
	<ol>
<li>לערבב 21 μL של 3% agarose עם 7 μL של 5-HT1AR קרום שברים. פיפטה למעלה ולמטה לאט פעמים רבות כדי להבטיח ערבוב הולם. לאחר מכן, דגירה ב 45 °C (55 °F) במשך 1 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>תצהיר הידרוג'ל ושומנים
	<ol>
<li>עבור GUVs ללא חלבון: לעשות סרט דק על כיסויים פלזמה טריים ניקה באמצעות 20 μL של 2% agarose. שחררו במהירות כיסוי נוסף על גבי טיפת האגורוז והחליקו בעדינות את הכיסויים לגזרים כדי ליצור סרט דק על שני הכיסויים. הערה: שלב זה הוא מסובך בכך שהחלקה של טיפה חייבת להתרחש בזמן agarose הוא עדיין בצורה מותכת.</li>
		<li>עבור GUVs משולב חלבון: Pipette תערובת חלבון / אגרוז למעלה ולמטה עוד פעם אחת, ולאחר מכן להפקיד 20 μL של 2% agarose על כיסוי ניקה פלזמה. בצע את הוראות הליהוק החלקה כמתואר לעיל.</li>
		<li>אפשר לאגורוז לג'ל מוגן מפני אור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להפקיד את השומנים טיפה על גבי שכבת אגרוז. השתמש בסך הכל 10 μL של 2 מ"ג / מ"ל של 1-פלמיטויל-2-oleoyl-גלייצרו-3-פוסכולין (POPC) עם 0.4 מול% 1,2-דיפלמיטויל-sn-גליצרי-3-פוספוטנולמין (DPPE) המסומן עם ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (או תערובת שומנים של עניין) בכלורופורם על גבי סרט אגרוז. להפקיד את הטיפות באמצעות מחט כרומטוגרפיה גז ולהפיץ טיפה אחת בכל פעם סביב באמצעות זרם אוויר עדין. הערה: יש צורך בזהירות עם צעד זה כדי להפוך שכבה אחידה יחסית של שומנים על גבי הידרוג'ל. כמו כן, כלורופורם רעיל ויש לטפל בו במכסה כימי מתאים.</li>
		<li>להרכיב את תאי סייקס-מור (S-M) על ידי הצבת טבעת O על גבי כיסוי, ולאחר מכן הצבת הרכיב העליון של התא על גבי טבעת O. השתמש במפתח שסופק על ידי היצרן כדי להרכיב את התא על ידי הברגת רכיבי התא יחד כדי לאטום את התא ולמנוע כל דליפה. הערה: יש להדק את החלק העליון של התא על טבעת ה- O אך יש צורך בזהירות כדי להבטיח שהכיסוי יישאר שלם מכיוון שהכיסוי יכול להיסדק אם טבעת ה- O אינה יושבת כראוי בתא. כמו כן, ודא כי התא אטום חזק מספיק, כך התא לא לדלוף כאשר פתרון הנפיחות מתווסף. אי הידוק התא מספיק יגרום דליפות ואובדן מדגם.</li>
	</ol></li>
	<li>נפיחות וקציר של שלפוחיות
	<ol>
<li>יש להרטיב את המערכת כולה על ידי צנרת עדינה של 450 μL של 200 מ"ר סוכרוז ב-1x PBS והקשה עדינה על התאים כדי להבטיח כיסוי חיץ הולם של שכבות השומנים ההידרוג'ל. הערה: פתרון סוכרוז ניתן להחליף עם מאגר rehydration המכיל בדיקות ביולוגיות של עניין.</li>
		<li>מניחים את התאים ב 45 °C (5 °F) לכסות את החלק העליון של התא עם כיסוי כדי למנוע אידוי. אפשר לדגימה להתנפח, מוגן מפני פסולת ואור במשך שעה.</li>
		<li>הוסף 100 μL של 1 מ"ג / מ"ל BSA במים אולטרה-דור לכל באר של צלחת 96 באר שנועדה לשמש. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה.</li>
		<li>יש לשטוף שלוש פעמים במים טהורים במיוחד ופעם אחת עם סוכרוז 200 מ"מ ב-1x PBS.</li>
		<li>לבסוף, להוסיף 200 mM של גלוקוז ב 1x PBS עד לתוספת של פתרון מדגם GUV. הערה: BSA שימש לחסימת ספיעת GUV.</li>
		<li>לאחר מתן ההידרוג'ל להתנפח, לנער בעדינות ולהקיש על התא כדי לנטרל את כל GUVs שעשוי להישאר מחובר משטח הידרוג'ל. לאחר מכן, בזהירות pipette את פתרון GUV-סוכרוז. הערה: כצעד אופציונלי כדי להבטיח שכל שללנות מנותקות מפני השטח, בעדינות pipette חלק מתלה סוכרוז בחזרה על פני ההידרוג'ל.</li>
		<li>העבר את ההשעיה לתוך צינור microcentrifuge שהוכן בעבר המכיל 700 μL של גלוקוז 200 mM ב 1x PBS. הערה: שיפוע הצפיפות יוביל ליישב את שלל לתחתית צינור הצנטריפוגה.</li>
		<li>אפשר שלשלות להסתפק במשך שעה נוספת כדי להבטיח כי שלל יכול לשקוע לתחתית צינור microcentrifuge, המאפשר איסוף אופטימלי.</li>
		<li>לאחר יישוב של GUVs גלוקוז, להעביר 300 μL מתחתית צינור הצנטריפוגה (שלפוחיות התיישבו) לתוך צלחת 96-באר מוכן מראש שטופלו BSA כדי לבחון את שלפוחיות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. הערה: הקפד להימנע מהתחתית של צינור microcentrifuge כדי למזער את כמות הפסולת שנאספו במדגם הסופי.</li>
	</ol></li>
	<li>תבדוק את הדגימות מתחת למיקרוסקופ.
	<ol>
<li>הברק לייזר 488 ננומטר על המדגם (המאפשר לנו לדמיין את הממברנה, כמו bilayer כבר מסומן עם ATTO-488-DPPE).</li>
		<li>הברק לייזר 561 ננומטר על המדגם (המאפשר לנו לדמיין את החלבון, שכן הוא כבר מסומן עם NHS-רודמין). הערה: יש צורך בזהירות בעת הדמיית המדגם כמו פוטוקסידיקציה יכול לערער את שלפוחיות. שלל נצפו באותו היום.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62830/62830fig01.jpg"> איור 1: איור של שלבי הפרוטוקול המפורטים. נוצר עם BioRender.com <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62830/62830fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

זיהינו שני שלבים קריטיים להצלחת הפרוטוקול הכולל: טיפול בפלזמה ותצהיר שומנים. ניקוי פלזמה של כיסויים חיוני כדי להבטיח שיש כיסוי נאות והידבקות של הידרוג'ל אגרוז לכיסוי הזכוכית. ניקוי פלזמה משיג שני דברים: ראשית, הוא מסיר עקבות של חומר אורגני מפני השטח של הזכוכית; שנית, הוא מפעיל את משטח הכיסוי, ומאפשר עלייה בגשימות ככל שהידופיליות משטח הזכוכית עולה 62,63. נגיעה במשטח הכיסוי לאחר הפלזמה תנטרל ותזהם את המשטח האולטרה-דק ומומלץ מאוד נגדו. ההמלצה שלנו היא לגעת רק בקצוות...

ממברנות מודל סינתטי הם כלים רבי עוצמה בחקירה של המאפיינים הבסיסיים ואת הפונקציות של biomembranes. שלטי ענק חד-צדדי (GUVs) הם אחת הפלטפורמות הבולטות ביותר לחקר מגוון תכונות קרום פלזמה וניתן להנדסן כדי לחקות מצבים פיזיולוגיים שונים1,2,3,4,5,6,7,8. הוא מבוסס היטב כי קרום הפלזמה והארגון שלה לשחק תפקיד מפתח בהמון של תהליכים תאיים, כגון העברת אותות, הידבקות, אנדוציטוזיס, ותחבורה9,10,11,12,13,14,15.
GUVs כבר מפוברק בשיטות שונות, כולל הידרציה עדינה16, נפיחות הידרוג'ל17, electroformation18, טכניקות מיקרופלואידיות19,20,21,22, jetting23, וחילופי ממס24,25,26. בשל אתגרים בטיפול בחלבוני ממברנה אינטגרליים (IMPs), פלטפורמות במבחנה לחקור אותם הוגבלו. GUVs מציגים פלטפורמה פשוטה לחקר IMPs בסביבה המחקה את הסביבה המקורית שלהם. למרות שהיו מספר גישות לחזרת חלבונים ב- GUVs, אתגרים נובעים משלב חלבונים עם הכיוון הנכון ושמירה על פונקציונליות חלבון27.
שחזור החלבון המוצלח ביותר ב- GUVs דורש את שיטת החלפת חומרי הניקוי; אשר כרוך solubilizing החלבונים מהסביבה הטבעית שלהם על ידי דטרגנטים, ואחריו טיהור חלבון, ולאחר מכן החלפת מולקולות דטרגנט עם שומנים באמצעות שיטות שונות28. בעוד חומרי ניקוי משמשים לייצוב המבנה שלישוני של IMPs במהלך הטיהור, micelles דטרגנט הם סביבה לא טבעית יחסית עבור חלבונים אלה, אשר מיוצבים טוב יותר, במיוחד עבור מחקרים פונקציונליים, ב bilayers השומנים28,29,30. יתר על כן, שילוב חלבוני טרנסממברן פונקציונליים לתוך bilayer השומנים באמצעות טכניקות ייצור GUV מסורתיות היה קשה בשל הגודל, העדינות של חלבונים אלה, ואת צעדי החלפת דטרגנט נוספים כי יהיה צורך27,31,32,33. השימוש בממס אורגני להסרת חומרי ניקוי גורם לצבירה של חלבונים ודנטורינג34. שיטה משופרת בתיווך דטרגנט מבטיחה, עם זאת, יש צורך בזהירות עבור שלב הסרת חומרי ניקוי ואופטימיזציה עשויה להיות נחוצה עבור חלבונים ספציפיים31,35. בנוסף, שיטות המשתמשות electroformation יכול להגביל את הבחירה של חלבון ולא יכול להיות מתאים לכל הרכבי השומנים טעונים במיוחד שומנים טעונים31,36,37. טכניקה נוספת בה נעשה שימוש היא היתוך המושרה בפפטיד של שלשלות חד-צדדיות גדולות (LUVs) המכילות את החלבון הרצוי עם רכבי שטח, אם כי נמצא כי הוא מייגע ויכול להוביל להכנסת מולקולות זרות - הפפטידים הפוסובגניים33,38,39. שלל קרום פלזמה ענק (GPMVs), אשר נגזרים תאים חיים, ניתן להשתמש כדי להתגבר על חלק מבעיות אלה, אולם הם מאפשרים שליטה מינימלית של השומנים וחלבון התוצאה14,40,41. לכן, שילוב של IMPs בשכבה הדו-ליפידית של GUVs באמצעות שיטת הנפיחות האגרוז המותאמת שלנו מציג שיטה אמינה לבחון עוד יותר חלבונים אלה בסביבת הממברנה42,43,44,45.
איתות ותקשורת תאית כוללת משפחה של חלבונים המכונה קולטנים מצמידי חלבון G (GPCRs); GPCRs הם בין המשפחה הגדולה ביותר של חלבונים והם קשורים עם מצב רוח מווסת, תיאבון, לחץ דם, תפקוד לב וכלי דם, נשימה, ושינה בין פונקציות פיזיולוגיות רבות אחרות46. במחקר זה, השתמשנו קולטן סרוטונין אנושי 1A (5-HT1AR) שהוא חבר טיפוסי של משפחת GPCR. 5-HT1AR ניתן למצוא במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית) וכלי הדם; זה משפיע על פונקציות רבות כגון קרדיווסקולרי, העיכול, תפקודים אנדוקריניים, כמו גם השתתפות ברגולציה של mood47. מחסום גדול למחקר GPCR נובע מהמבנה האמפיפילי המורכב שלהם, ו- GUVs מציגים פלטפורמה מבטיחה לחקירה של תכונות שונות של עניין, החל מפונקציונליות חלבון, אינטראקציות בין חלבון שומנים לחלבון ואינטראקציות חלבון-חלבון. גישות שונות נוצלו לחקר אינטראקציות בין חלבון שומנים לשומנים כגון תהודה פלסמון פני השטח (SPR)48,49, ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR)50,51, שכבת-על שומנים חלבונית (אש"ף) 51,52,53,54, ספקטרומטריית מסת מקומית55, קלורימטריה איזותרמית (ITC)56,57, וליפוזום מטען מטען 58,59. המעבדה שלנו השתמשה בגישת ה- GUV הפשוטה כדי לחקור את ההשפעה של אינטראקציות חלבון שומנים על פונקציונליות החלבון על ידי תקציר BODIPY-GTPγS, אשר נקשר עם Giα subunit במצב הפעיל של הקולטן. הכריכה שלהם מרוקנת את הפלורופור ומייצרת אות פלואורסצנטי שניתן לזהות לאורך זמן45. יתר על כן, מחקרים שונים חקרו אינטראקציות חלבון השומנים ואת התפקיד של חלבונים חישה או ייצוב עקמומיות ממברנה60,61, וניצול גישת GUV אפשרי יכול להיות יתרון מרכזי.
פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה לשלב GPCRs לתוך הממברנה של GUVs באמצעות מערכת הידרוג'ל אגרוז שונה17,42. יתר על כן, בהתבסס על העבודה הקודמת שלנו, השיטה שלנו יכולה להיות מתאימה IMPs שיכול לשאת חשיפה לטווח קצר 30-40 °C (50 °F). בקצרה, אנו מפיצים סרט דק של אגרוז בשילוב עם שברי ממברנה המכילים את GPCR של עניין. לאחר ג'לציה של שכבה זו, אנו מפקידים תמיסת שומנים על גבי agarose ולאפשר ממס להתאדות. התייבשות של המערכת בוצעה אז עם חוצץ מימי, וכתוצאה מכך היווצרות של GUVs עם חלבון משולב bilayer השומנים.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, אלבסטר, AL</td><td>850375C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; מיקרוסקופ הפוך TI-Eclipse</td><td>ניקון, מלוויל, ניו יורק</td><td>ליקוי חמה Ti</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td><td>850355C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>13/16&Prime; ID, 1&Prime; טבעות O סיליקון OD</td><td>חותם סטרלינג & אספקה, נפטון, IN</td><td>5-003-8770</td><td></td></tr><tr><td>16 סיביות Cascade II 512 מצלמת מכשיר מצמד מטען כפול</td><td>אלקטרונים פוטומטריה, הנטינגטון ביץ', קליפורניה</td><td>&nbsp; Cascade II 512</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td><td>850457C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>50 mW לייזרים במצב מוצק ב-488 ננומטר ומסנן פליטה מרוכז ב-525 ננומטר, ו-561 ננומטר עם מסנן פליטה מרוכז ב-595 ננומטר</td><td>קוהרנטי, סנטה קלרה, קליפורניה</td><td>488/561-50-LS</td><td></td></tr><tr><td>5-HT1AR שברי ממברנה</td><td>פרקין אלמר, וולת'אם, MA</td><td>RBHS1AM400UA</td><td></td></tr><tr><td>ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)</td><td>ATTO-TEC, זיגן, גרמניה</td><td>AD 488-155</td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה ספסל עליון</td><td>האריק פלזמה, איתקה, ניו יורק</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MO</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם (CHCl3)</td><td>Millipore Sigma, ברלינגטון, MA</td><td>CX1055</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול (כול)</td><td>סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MO</td><td>C8667-5G</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג 96-באר שטוח שקוף תחתון</td><td>, קורנינג, ניו יורק</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Elmasonic E-Series E15H אולטרסאונד</td><td>אלמה, סינגן, גרמניה</td><td>[כבר לא נמכר באתר הראשי]</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MO</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>מתנול (MeOH)</td><td>Millipore Sigma, ברלינגטון, MA</td><td>MX0485</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Rhodamine</td><td>Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS) (10x PBS)</td><td>קורנינג, קורנינג, ניו יורק</td><td>21-040</td><td></td></tr><tr><td>ראש קונפוקלי CSUX מסתובב דיסק</td><td>יוקוגאווה, טוקיו, יפן</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית סטנדרטיים 25 מ"מ מס' 1</td><td>ChemGlass, Vineland, NJ</td><td>CLS-1760</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MO</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Sykes-Moore chambers</td><td>Bellco, Vineland, NJ</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>טמפרטורת התכה נמוכה במיוחד אגרוז</td><td>סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MO</td><td>A5030</td><td></td></tr><tr><td>VWR Heatblock אנלוגי</td><td>VWR International, רדנור, פנסילבניה</td><td>[כבר לא נמכר באתר הראשי]</td><td></td></tr> <tr><td>VWR Tube Rotator</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>עמודי התפלה של Zeba Spin, 7K MWCO, 0.5 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>89882</td><td></td></tr></tbody></table>

בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון g (gpcrs)

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

חקירות במבחנה איתנה של המבנה והתפקוד של חלבוני ממברנה אינטגרליים היוו אתגר בשל המורכבות של קרום הפלזמה והגורמים הרבים המשפיעים על התנהגות החלבון בתאים חיים. שלטי ענק חד-צדדי (GUVs) הם מערכת מודל מימטיקה וטופילית מאוד במבחנה לחקירת אינטראקציות בין קרום חלבון וחיקור התנהגות חלבונים באופן מדויק ותלוי גירוי. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה זולה ויעילה לייצור GUVs עם קולטן סרוטונין 1A האנושי (5-HT1AR) משולב ביציבות בממברנה. אנו מייצרים ג'וונים בשיטת נפיחות הידרוג'ל מותאמת; על ידי הפקדת סרט שומנים על גבי תערובת של agarose ו 5-HT1AR ולאחר מכן לחות המערכת כולה, שלל ניתן ליצור עם כוון כראוי ופונקציונלי 5-HT1AR משולב לתוך הממברנה. לאחר מכן ניתן להשתמש ב- GUVs אלה כדי לבחון אינטראקציות בין קרום חלבון והתנהגות לוקליזציה באמצעות מיקרוסקופיה. בסופו של דבר, פרוטוקול זה יכול לקדם את הבנתנו את הפונקציונליות של חלבוני ממברנה אינטגרליים, ומספק תובנה פיזיולוגית עמוקה.

ריכוז החלבון נמדד, ומידת התיוג חושבה כיחס הטוחנת בין הצבע לחלבון להיות 1:1. על ידי בחינת ה- GUVs באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, הצלחנו לאשר היווצרות מוצלחת ושילוב חלבונים של שלשלות. השומנים סומנו עם 0.4 מול% ATTO 488-DPPE, והחלבון תויג באופן קוולנטי באמצעות שינוי רודמין NHS-אסתר של אמינים ראשוניים. איור 2a ואיור 2b מציגים ארסית משולבת חלבונים בערוצי ATTO 488 ורודמין, בהתאמה. כל המיקרוגרפים תוקנו בזרם כהה ושפל השדה תוקנו. איור 2c <st...

פרוטוקול זה משתמש נפיחות agarose כטכניקה רבת עוצמה להכללה לשילוב חלבונים ממברנה אינטגרלית (IMPs) לתוך שלפוחיות שומנים חד-צדדיות ענקיות (GUVs), כפי שתואר כאן עבור שחזור של חלבון קולטן סרוטונין האדם 1A (5-HT1AR), אחד מסוגי קולטני חלבון G חשובים מבחינה פרמקולוגית.

בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון G (GPCRs)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

חקר חלבוני ממברנה אינטגרליים בסביבתם הטבעית היה אתגר בשל המורכבות של קרום הפלזמה. שלל שומנים חד-צדדי ענק, או GUVs, הם אחת הפלטפורמות הבולטות ביותר לחקר תכונות biomembrane והם יכולים להיות מהונדסים לחקות תנאים פיזיולוגיים שונים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לפברק חלבונים משולבים GUVs המבוססת על שילוב ספונטני, לאחר נפיחות הידרוג'ל. שיטות מסורתיות לייצור GUVs אינן ניתנות להכללה עבור שילוב חלבון ממברנה אינטגרלי. שיטות אלה הן לעתים קרובות תפוקה נמוכה, מורכב מתודולוגית אד הוק, לא חל על סוגים רחבים של חלבונים. מצד שני, פרוטוקול זה מייצג שיטה גמישה, חזקה ופשוטה לשלב חלבוני ממברנה אינטגרליים פונקציונליים ב- GUVs.השגנו זאת על ידי הכנת פיגום הידרוג'ל, המכיל את החלבון, והפקדת שכבה דקה של שומנים עליו. בדוגמה המוצגת כאן, שילבנו קולטן G בשילוב חלבון, או GPCR, ב- GUVs.Upon rehydration של המערכת כולה, GUVs ניצנים מפני השטח של ההידרוג'ל עם הממברנה המכילה GPCRs מכוונת כראוי.אפשר לכל הריאגנטים להגיע לטמפרטורת החדר. במהלך תקופה זו, לנקות את כיסוי מחליק על ידי הצבת אותם מתנול sonicating במשך 30 דקות ב 40

construction-model-lipid-membranes-incorporating-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הפרוטוקולים מתארים את הצעדים החיוניים לקבלת איכות עקיפה גבישים של חלבון ממברנה החל הכינון מחדש של החלבון בשלב מעוקב lipidic (LCP), מציאת התנאים הראשוניים עם LCP-FRAP טרום התגבשות מבחני, הגדרת ניסויים התגבשות LCP וקריסטלים קציר .

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Guanosine triphosphate (GTP) מחייב הוא אחד האירועים המוקדמים G-Protein-Coupled קולטן (GPCR) ההפעלה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לאפיין באופן פרמקולוגי אינטראקציות ספציפיות GPCR-ligand על ידי ניטור מחייב של אנלוגי GTP, שכותרתו רדיו, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), in תגובה ליגנד של עניין.

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

וזמינותו הסלולר המתוארת נועד לצורך זיהוי הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4)-סוכנים שמעצבת לעכב או לגרות, תחרותי או allosterically, תאיים Ca2 + שחרור שיזם CXCR4 הפעלה.

קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

דו ח זה מתאר הקרנה של דטרגנטים שונים להכנת GPCR החזותית, הרודופסין ומתחם המורכב שלו עם mini-Go. השיטות הביוכימי המאפיינים את איכות הקומפלקס בשלבים שונים במהלך הטיהור מומחש. פרוטוקול זה ניתן להכליל למערכות חלבון ממברנה אחרים עבור המחקרים העתידיים שלהם במבנה.

הקרנה אסטרטגית ואפיון של הקומפלקס החזותי של החלבון GPCR-mini-G של התגבשות מוצלחת

היתוך מיטוכונדריאלי הוא תגובה הוםוסטטית חשובה הבסיסית לדינמיקה המיטוכונדריאלית. מתואר כאן היא מערכת איסוף חוץ תוך כדי לימוד היתוך מיטוכונדריאלי פנימי-קרום שיכול לפתור רצועה קרום, עגינה, המיתוך, ופתיחת נקבוביות. הרב-תכליתיות של גישה זו בחקר מערכות קרום התא נדון.

פלטפורמת ממברנה לדוגמה לשיכור דינמיקת קרום מיטוכונדריאלי

מחקר זה מציג הליך מפורט לביצוע ניסויים של העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) על קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) באמצעות תיוג ספציפי לאתר באמצעות שילוב חומצות אמינו לא טבעיות (UAA). הפרוטוקול מספק מדריך שלב אחר שלב להכנת דגימות smFRET, ניסויים וניתוח נתונים.

הדמיה של הדינמיקה הקונפורמציונית של קולטני ממברנה באמצעות FRET של מולקולה בודדת

גיוון השומנים בממברנה במבנה ובהרכב הוא תורם חשוב לתהליכים תאיים ויכול להיות סמן למחלות. סימולציות של דינמיקה מולקולרית מאפשרות לנו לחקור ממברנות ואת יחסי הגומלין שלהן עם ביומולקולות ברזולוציה אטומית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבנייה, הפעלה וניתוח של מערכות ממברנות מורכבות.

מידול ממברנות מציאותי באמצעות תערובות שומנים מורכבות במחקרי סימולציה

מוצג פרוטוקול ניסיוני להרכבה, גירוי חשמלי וניתוח דו-שכבתיות מממשק טיפות עם גרמיצידין A. יחסי מבנה-תפקוד בין ליפידים לחלבון נמדדים על ידי מדידת שינויים בשטח הממברנה, בזרם יוני ובהולכה חד-ערוצית, וקישור תגובות אלו לשינויים דמויי פלסטיות בהולכה יונית במודל ממברנה בהשראת סינפסות חשמליות.

אפיון מבנה תפקוד ממברנת ליפידים-חלבון באמצעות דו-שכבות ממשק טיפות

טכניקות biosensor אופטיות יכולות לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה בתאים חיים ומאפשרות אחד כדי לעקוב אחר תגובות תאיות בתאים ובאוכלוסיות של תאים בודדים. פרוטוקול זה יתאר גילוי האפנון של תעלות אשלגן על ידי קולטנים בשילוב ה-G-חלבון בתאים שלמים באמצעות גישה זו.

שימוש בBiosensors האופטי ללא תווית לזיהוי מודולציה של תעלות אשלגן על ידי קולטנים מצמידים G-חלבון

jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית ​​עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקולות הממודרת הן רצויה.

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

למדו שיטת נפיחת אגרוז לשילוב קולטני GPCR בממברנות שומניות גדולות. הטכניקה מדגימה שילוב קולטן הסרוטונין 5-HT1AR תוך שמירה על פעילות תפקודית במערכת מודל.

בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון G (GPCRs)

גלה סרטונים נוספים