Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Ahmed Elbaradei; Lucia Caterina Dalle Ore; Noah Malmstadt

doi:10.3791/62830

בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון G (GPCRs)

JoVE Journal
Bioengineering
Author Produced

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Bioengineering

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון G (GPCRs)

Full Text

3,827 Views

09:45 min

February 5, 2022

DOI: 10.3791/62830-v

Ahmed Elbaradei*¹, Lucia Caterina Dalle Ore*¹, Noah Malmstadt¹

¹Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science,University of Southern California

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

פרוטוקול זה משתמש נפיחות agarose כטכניקה רבת עוצמה להכללה לשילוב חלבונים ממברנה אינטגרלית (IMPs) לתוך שלפוחיות שומנים חד-צדדיות ענקיות (GUVs), כפי שתואר כאן עבור שחזור של חלבון קולטן סרוטונין האדם 1A (_5-HT1AR), אחד מסוגי קולטני חלבון G חשובים מבחינה פרמקולוגית.

Transcript

חקר חלבוני ממברנה אינטגרליים בסביבתם הטבעית היה אתגר בשל המורכבות של קרום הפלזמה. שלל שומנים חד-צדדי ענק, או GUVs, הם אחת הפלטפורמות הבולטות ביותר לחקר תכונות biomembrane והם יכולים להיות מהונדסים לחקות תנאים פיזיולוגיים שונים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לפברק חלבונים משולבים GUVs המבוססת על שילוב ספונטני, לאחר נפיחות הידרוג'ל. שיטות מסורתיות לייצור GUVs אינן ניתנות להכללה עבור שילוב חלבון ממברנה אינטגרלי. שיטות אלה הן לעתים קרובות תפוקה נמוכה, מורכב מתודולוגית אד הוק, לא חל על סוגים רחבים של חלבונים. מצד שני, פרוטוקול זה מייצג שיטה גמישה, חזקה ופשוטה לשלב חלבוני ממברנה אינטגרליים פונקציונליים ב- GUVs.השגנו זאת על ידי הכנת פיגום הידרוג'ל, המכיל את החלבון, והפקדת שכבה דקה של שומנים עליו. בדוגמה המוצגת כאן, שילבנו קולטן G בשילוב חלבון, או GPCR, ב- GUVs.Upon rehydration של המערכת כולה, GUVs ניצנים מפני השטח של ההידרוג'ל עם הממברנה המכילה GPCRs מכוונת כראוי.אפשר לכל הריאגנטים להגיע לטמפרטורת החדר. במהלך תקופה זו, לנקות את כיסוי מחליק על ידי הצבת אותם מתנול sonicating במשך 30 דקות ב 40