ידידותית למשתמש, תפוקה גבוהה ותוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת נתונים עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית של חלקיק יחיד
July 29th, 2021
מיקרוסקופיה הקפאה-אלקטרונית של חלקיק יחיד דורשת חבילת תוכנה מתאימה וצנרת ידידותית למשתמש לרכישת נתונים אוטומטית בתפוקה גבוהה. כאן, אנו מציגים את היישום של חבילת תוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת תמונות, Latitude-S, וצינור מעשי לאיסוף נתונים של ביומולקולים משוקלים בתנאים במינון נמוך.
תוכנה אוטומטית לרכישת נתונים נחוצה ביותר לאיסוף כמות עצומה של נתוני קריו לאפיון מבני של מקרומולכו ללא. חבילת תוכנה אוטומטית לרכישת נתונים שימשה כאן כדי לאפיין את המבנה של מקרומולקולות ביולוגיות שונות, הקשורות ישירות לביולוגיה של פתוגן. לדוגמה, מיקובקטריום, HIV ו- SASCO 2.
ראשית, הפעל את תוכנת רכישת נתונים אוטומטית של Latitude-S על-ידי לחיצה על DigitalMicrograph מתפריט ההתחלה. לאחר מכן, בחר את מנהל הטכניקות ולאחר מכן את סמל Latitude-S עבור איסוף נתונים אוטומטי של חלקיק יחיד. כדי ליצור הפעלה המבוססת על הגדרות ההפעלה הקודמות, סמן את תיבת הסימון בהתבסס על הפעלה קודמת בלוח הצבעים ולאחר מכן בחר בלחצן החדש או כדי להמשיך בהפעלה קיימת, לחץ על לחצן המשך.
כדי להתחיל הפעלה חדשה לחלוטין, לחץ על הכרטיסיה החדשה בלוח הצבעים. בחר את התיקיה המכילה את ההפעלה להמשך ובחר את התיקיה לשמירת הנתונים. לאחר מכן, לחץ על סמל ההגדרה ובתיבה סייר במצב מנוהל שמופיעה, הוסף מצב, הגדר את תנאי TEM, תנאי המצלמה ואפשרות תמונה או מלאי.
לאחר מכן, תן שם למצב או פתח את סיכום הגדרת המצב כדי לפתוח את הגדרות השמירה. לאחר מכן, קבע את תצורת מצב האטלס על-ידי לחיצה על לוח המצב אטלס והגדר את הפרמטרים להגדלה, תנאי תאורה וזמן חשיפה למצלמה, ולחץ על הבא כדי לעבור למצב הבא. לאחר מכן קבע את תצורת מצב הרשת על-ידי לחיצה על לוח מצב הרשת, הגדר את הפרמטרים עבור אופטיקה הדמיית מיקרוסקופ, תנאי תאורה וזמן חשיפה למצלמה, ולחץ על הבא.
קבע את תצורת מצב החור על ידי לחיצה על לוח החורים והגדר את אופטיקת ההדמיה, תנאי התאורה, הפרמטרים של binning וזמן החשיפה למצלמה. לאחר לחיצה על הבא, להגדיר את מצב המיקוד הבא על ידי לחיצה על לוח המוקד ולהגדיר את הגדרות המיקרוסקופ עבור אופטיקה הדמיה, תנאי תאורה, binning וזמן חשיפה למצלמה. לאחר מכן התמקדו באזור הפחמן האמורפי ליד החור ולחצו על הבא כדי לעבור למצב הבא.
קבע את תצורת מצב הנתונים על-ידי לחיצה על לוח הנתונים והגדר את הפרמטרים עבור הגדרות מיקרוסקופ ולאחר מכן לחץ על הבא. לחץ על לוח התצורה של המוקד המציין את טווח ערכי ההשבתה ואת גודל השלב בכרטיסיה הנתונה ולחץ על הלחצן הבא כדי לעבור לשלב הבא. התמקד בתכונות הנדרשות ברשת ולחץ על לחצן הלכידה.
לאחר מכן מקם את סימן הצלב האדום על אותה תכונה בכל תמונה של מצבים שונים. התחל עם מצבי מיקוד, נתונים וחורים, מכיוון שתחום הראייה גדול יותר מהמדינות אטלס ורשת. לאחר מכן, הגדל את מצבי אטלס ורשת כדי למקם את סימן הצלב האדום באותה תכונה.
כדי לחשב את המיקומים וההיסט בין כל אחד מחמישה מצבים שונים ולשקף את המיקום וההיסט לחלון הפלט, לחץ על לחצן חשב. לחץ על לוח לכידה ובחר את גודל האטלס כדי לכסות את הרשת כולה או חלק מהרשת בהתבסס על הדרישה. כדי ללכוד את האטלס, נווט על האטלס ובחר את ריבוע הרשת בהתבסס על עובי הקרח.
לאחר בחירת ריבועי הרשת הרצויים, לחץ על לחצן לוח הזמנים וצפה באריחים בריבוע הרשת מתמלאים כאשר כל ריבוע רשת נלכד. לאחר לחיצה על לחצן לוח הזמנים, בחר חור מייצג בריבוע הרשת על-ידי הוספת מיקום החור. לאחר רכישת תמונת החור, הגדר את הנתונים ואת מיקומי המוקד ושמור את הפריסה כתבנית.
לחץ על חיפוש אוטומטי, הזן את גודל החור, ולחץ על כפתור למצוא בתוכנית כדי למצוא באופן אוטומטי את החורים המבוססים על הקוטר. הגדר את העוצמה כדי להסיר את החורים מכיכר הרשת וזיהום הקרח. ולאחר הוספת כלי הסימון הנבחרים והצהובים באמצעות חיפוש אוטומטי, לחץ על לחצן לוח הזמנים במשימות קו רוחב.
לפי ההקרנה הידנית הראשונית של מיקרוגרפים מתוקנים בתנועה באמצעות תוכנת cisTEM, רוב הנתונים נמצאו בטווח האותות הרצוי. בנוסף, תמונות שנאספו בטווחי נטרול, נבדקו גם באופן ידני על ידי cisTEM. חלקיקי ספייק נבחרו באופן ידני כדי לחשב את ממוצעי המחלקה הדו-ממד להדמיה מבנית, מה שהציע בחום, אך אפיון מבני ברזולוציה גבוהה היה אפשרי באמצעות ערכת הנתונים המתאימה.
הסיווג 3D ציין כי חלבון ספייק יש 1RBD באישור פתוח למעלה וכל RBD אחרים באישור סגירה למטה. האישורים הפתוחים של 1RBD של חלבון ספייק שוחזרו באמצעות סימטריה C1. מפת חלבון ספייק מיוצגת בתצוגה הצדדית העליונה והתחתון.
ומפת ה-EM מצוידת במבנה אטומי להדמיה טובה יותר של שרשראות הצד. אישורי הסגירה של RBD היו מעודנים עם סימטריה C3 ודגם מזוקק תלת-ממדי ספייק ומפת EM, מצויד במבנה אטומי כפי שמוצג. ואישור ביניים של חלבון ספייק שזוהה כתחמת המשנה S2 הצביע על שרשראות הצד של שאריות חומצות אמינו בודדות.
התוצאות הראו כי Latitude-S יכול לאסוף נתוני CRYO EM ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולים ביולוגיים. תוכנה אוטומטית זו לאיסוף נתונים יכולה לשמש לכל מערכת מיקרוסקופ אלקטרונים אחרת לאיסוף נתונים באופן אוטומטי.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה דן ביישום של Latitude-S, תוכנת רכישת נתונים אוטומטית למיקרוסקופיית אלקטרונים בקירור. הוא מדגיש את החשיבות של צינור ידידותית למשתמש לאספקת נתונים בכמויות גדולות של ביו-מולקולות.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרוסקופיית אלקטרונים בקירור
- ביולוגיה מבנית
- רכישת נתונים אוטומטית
רקע
- מיקרוסקופיית אלקטרונים בקירור של חלקיק יחיד חיונית לאופיון מבני.
- תוכנה אוטומטית נחוצה לאיסוף נתונים יעיל.
- ביו-מולקולות מזוגגות דורשות תנאי הדמיה במינון נמוך.
- ביולוגיה של פתוגנים היא תחום יישום משמעותי.
מטרת המחקר
- להציג חבילת תוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת תמונות.
- לבסס צינור מעשי לאיסוף נתונים.
- להגדיל את יעילות זרימות העבודה של מיקרוסקופיית אלקטרונים בקירור.
שיטות ששימשו
- שימוש בתוכנת Latitude-S לרכישת נתונים אוטומטית.
- תצורת הפעלות על פי הגדרות קודמות.
- טכניקות הדמיה במינון נמוך לביו-מולקולות.
- אופיון של מקרו-מולקולות ביולוגיות שונות.
תוצאות עיקריות
- יישום מוצלח של Latitude-S לרכישת נתונים בכמויות גדולות.
- אופיון יעיל של מבנים הקשורים לפתוגנים כמו מיקובקטריום ו-HIV.
- זרימת עבודה משופרת לאיסוף נתונים אוטומטי.
- הוכחת יכולת התוכנה בתנאים של מינון נמוך.
מסקנות
- Latitude-S משפר באופן משמעותי את היעילות של מיקרוסקופיית אלקטרונים בקירור.
- רכישת נתונים אוטומטית חיונית למחקר בביולוגיה מבנית.
- התוכנה מאפשרת את המחקר של מקרו-מולקולות ביולוגיות חשובות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Automated data acquisition in cryo-EM enables high-throughput structural characterization of pathogen-associated macromolecules, supporting target validation and lead identification in early discovery. The Latitude-S software streamlines workflow efficiency, reducing manual intervention and increasing data reproducibility for structural biology teams. This capability enhances predictive confidence in mechanistic de-risking by providing reliable, quantitative structural data for infectious disease targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution structural visualization of pathogen proteins like SARS-CoV-2 spike.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying conformational states and functional mechanisms of macromolecular targets.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by delivering atomic-resolution data that informs target druggability and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating consistent, high-quality cryo-EM datasets.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through fully automated imaging under controlled low-dose conditions.
- Scalability: Enables screening readiness and platform reuse, as demonstrated by acquisition of ~3,000 movie images in a single 48-hour session.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery through preclinical validation by providing structural insights into pathogen biology.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by identifying conformational states (e.g., 1-RBD up/open and all RBD down/closed) that inform functional assays.
- Risk-Adjusted Advancement: Connects structural data to decision-making for target prioritization in antiviral development programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, where structural data informs hit-to-lead progression and mechanism elucidation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling structural characterization of macromolecular complexes involved in pathogen entry and replication.
- Screening: Describes assay readiness through automated, high-throughput data collection that yields quantitative, reproducible outputs for downstream analysis.
- Analytics: Highlights measurements such as defocus values, image quality metrics, and 3D classification outputs that enable comparison of structural states and conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via structural models that inform functional assays and biomarker alignment for pathogen targets.
- Enterprise Reuse: Frames the software as a reusable capability across multiple targets and projects, reducing redundancy in data acquisition setup.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in structural studies of pathogenic macromolecules.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data acquisition across sessions and users.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early structural insights.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on high-confidence structural data.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in cryo-EM operation, software configuration, and structural data interpretation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including 200 keV cryo-TEM, direct electron detector, and computing resources for image processing.
- Cross-team standardization requirements for session templates, parameter settings, and data naming conventions.
- Adaptation considerations across model systems, including vitrified samples of varying size, symmetry, and stability.
- Practical limitations include dependency on sample quality, ice thickness, and initial manual screening for motion correction and particle picking.
