כמות מוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים על ידי אלקטרופורזה נימית אלקטרוספריי ספקטרומטריית מסה יינון
13 באוגוסט 2021
מתואר הליך לאלקטרופורזה נימית אלקטרופורזה ספקטרומטריית מסת יינון עבור הכמות המוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים מתמציות תאי יונקים.
זה מספק תוצאות באיכות גבוהה עבור מטבוליזם פוספט אינוזיטול בכל האורגניזמים שבדקנו עד כה. הוא גם יספק תובנה לגבי מסלול ביו-סינטטי תאי חדש שאנו מודעים לו כיום. ניתוח של מטבוליזם פוספט אינוזיטול על ידי CE-ESI-MS הוא מהיר יותר, רגיש מאוד, ומסוגל לספק מידע מבנה עבור מכלולים פוספט אינוזיטול.
כדי להתחיל, להקים ספקטרומטריית מסה יינון אלקטרופורזה נימית או מערכת CE-ESI-MS המורכבת ממערכת CE מסחרית, וספקטרומטר מסה טנדם משולש מרובע, מצויד במקור ESI של זרם סילון אג'ילנט. לאחר מכן, חבר את מפצל זרימת הנדן 1:100 ואת שקע משאבת הכרומטוגרפיה הנוזלית האיזוקרטית, וודא כי בקבוקון הכניסה של מערכת CE נמצא באותו גובה כמו קצה המרסס של מנתח המסה. לאחר מכן, השתמש בגרסת תחנת העבודה של MassHunter או בתוכנת MS דומה, כדי לשלוט במערכת כולה ובאיסוף וניתוח נתונים.
לאחר הכנת חיץ הריצה CE ונוזל נדן, התקן את נוזל הנדן על ידי טיהור בחמישה מיליליטר לדקה במשך חמש דקות. לאחר מכן הגדר את קצב הזרימה למיליליטר אחד לדקה ואת לחץ המשאבה ל -180 בר. ודא שהצינורות הממוחזרים מתחברים בחזרה לבקבוק נוזל הנדן כדי לעשות שימוש חוזר בממס.
לאחר מכן, באמצעות חותך עמוד נימי עם להב יהלום מסתובב, לחתוך כראוי את שני הקצוות של נימי CE-MS עם חלון גילוי UV. לאחר מכן להסיר שניים עד שלושה סנטימטרים של ציפוי polyimide על שני הקצוות עם מצית, ולנקות את המשטח נימי עם Isopropanol. כדי להתקין את הנימי, התאם את הנימים לקלטת CE-MS.
לאחר מכן לחץ על כפתור שינוי קלטת והתקן את הקלטת במכשיר CE. כדי להפעיל את הנימי, תחילה לשטוף את הנימי עם נתרן הידרוקסיד טוחן אחד, לאחר מכן מים במשך 10 דקות, ולאחר מכן CE פועל חיץ במשך 15 דקות. לאחר מכן, הכנס את הנימי לתוך מרסס CE-MS.
באמצעות זכוכית מגדלת ובורג הכוונון במרסס, כוונן במדויק את שקע הנימים, כדי להבטיח שהקצה הנימי יבלוט כ-0.1 מילימטרים מקצה המרסס. בדוק את היציבות של מרסס ESI במצב סריקה מלאה. התנודתיות של אלקטרופרוגרמות היון הכולל צריכה להיות בתוך 5% לאחר מכן, בצע הרצת בדיקה עם תקני פוספט אינוזיטול.
לאחר הכנת תערובת התקנים הפנימית, מערבבים 10 מיקרוליטרים של המדגם עם 0.5 מיקרוליטר של תערובת התקנים הפנימית ובקבוקון מדגם CE. בעת שימוש במערכת החידוש, לחץ על כפתור שינוי בקבוק. שים את 250 מיליליטר מוכן של CE פועל חיץ לתוך בקבוק אלקטרוליטים.
לאחר מכן לחץ על צינורות נקיים שמירה על מחט חידוש בבקבוקון מים. הגדר את הפרמטרים ESI ו- MS. לאחר מכן מטב את פרמטרי המקור באמצעות אופטימיזציה של מקור עם תערובת של תקני פוליפוספט אינוזיטול, והגדרות ניטור תגובה מרובות באמצעות MassHunter Optimizer עם כל התקנים.
לאחר מכן, בצע ריצה עבור תמציות פוספט אינוזיטול ולבדוק את התוצאות. קבעו רצף כשיש דוגמאות נוספות. לאחר המדידה, הנח שה-MS נמצא במצב המתנה ואל תכבה את משאבת הכרומטוגרפיה הנוזלית.
החלף את מרסס CE-ESI-MS במרסס LC-ESI-MS כאשר אין אספקת נוזל נדן. לניתוח נתונים, פתח את תוכנת הניתוח הכמותי וצור אצווה עבור כל הדוגמאות. לאחר מכן, צור שיטה חדשה מנתוני ניטור התגובה המרובים שנרכשו, והגדר את פחמן-13 אינוזיטול פוספטים כתקנים פנימיים.
לאחר מכן, בדוק את תרכובת ניטור התגובות המרובות, זמן השמירה, התקנים הפנימיים, הריכוז והגדרת המזהה. העבר את האימות והיציאה כדי להחיל את השיטה על האצווה הנוכחית. שמור את השיטה.
לאחר מכן בדוק אם כל שיא באצווה משולב כראוי. אחרת, שלב את השיא באופן ידני. ייצא את התוצאות לגיליון אלקטרוני, וכמת את הפירופוספטים של אינוזיטול, על ידי השוואת תגובת שיא האנוליטים לתגובת השיא המתאימה של האיזוטופ היציב שכותרתו תקנים פנימיים עם ריכוזים ידועים.
לבסוף, עם הריכוז הנמדד בפוספט אינוזיטול, תמיסת התמצית ונפחה, לחשב את הכמויות המוחלטות ולנרמל עוד יותר את הסכום על ידי ספירת תאים או תוכן חלבון. חשב את הריכוז התאי בהתבסס על ספירת תאים ונפח תא ממוצע של תאי HCT116. אלקטרופרוגרמות יונים מופקות של תקני אינוזיטול פירופוספט בריכוז של שני מיקרומולים מוצגים כאן.
מטבוליזם של אינוזיטול pyrophosphates ביונקים עם מבנים פשוטים שלהם מוכנס. מוצגת כאן ריצה של CE-ESI-MS של תאי HCT116 מיוניברסיטי קולג' לונדון או UCL. CE-MS שימש לכימות שונות ברמות IP8 בין תאי HCT116 מ-UCL לאלה של NIH.
תאי HCT116 מ-UCL מכילים רמות גבוהות פי שבעה של IP8 מאלו של NIH. הצטברות משמעותית של 1, 5-IP8 בתאי HCT116 UCL מקבילה לעלייה ניכרת ב- 1-IP7. ניתוח CE-ESI-MS של תאי HCT116 שטופלו בנתרן פלואוריד מ-NIH הדגים עלייה של 5-IP7, יחד עם ירידה ב-IP6 ומראה של 5-PPIP4.
למרות רמות של 1-IP7 ירד במידה מסוימת, זה לא נעדר לחלוטין בתאים מטופלים נתרן פלואוריד, אבל בעיקר תחת הגבול של זיהוי. חשוב ליצור כיתה יציבה CE-ESI-MS. אנו ממליצים לבדוק את יכולת החזרה והרגישות של המערכת לפני המדידות.
טכניקה זו מאפשרת לספק מטבוליזם של אינוזיטול פוספט, שתלים ורקמות, וגם לספק הזדמנות לחקור מקרוב את אינוזיטול pyrophosphate רלוונטי ביולוגית.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורה של כרומטוגרפיה קפילרית עם יינון בריס and ספקטרומטריית מסות (CE-ESI-MS) לכימות של אינוזיטול פירופוספטים מתמריתי תאי יונקים. השיטה מצטיינת במהירותה, ברגישותה וביכולתה לספק מידע מבני על מבני אינוזיטול פוספט.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ספקטרומטריית מסות
- ביוכימיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- אינוזיטול פירופוספטים ממלאים תפקיד מכריע באיתות תאי.
- הבנת חילוף החומרים שלהם יכולה לספק תובנות לגבי תהליכים ביולוגיים שונים.
- שיטת CE-ESI-MS מציעה שיטה מהירה ורגישה לניתוח.
- שיטות קודמות היו חסרות את היעילות ואת רמת הפירוט המסופקת על ידי CE-ESI-MS.
מטרת המחקר
- ביסוס שיטה מהימנה לכימות של אינוזיטול פירופוספטים.
- ניתוח של מטבוליזם של אינוזיטול פוספט בתאים של יונקים.
- בחינת השוני ברמות של אינוזיטול פירופוספט בין קווי תאים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקמה של מערכת CE-ESI-MS עם תצורות ציוד ספציפיות.
- הכנת תמיסת ריצה (running buffer) ונוזל מעטפת (sheath liquid) ל-CE.
- שטיפה והפעלה של הקפילרה לביצועים אופטימליים.
- רכישת נתונים וניתוחם באמצעות תוכנת MassHunter.
תוצאות עיקריות
- שיטת CE-ESI-MS כימתה בהצלחה את רמות ה-inositol pyrophosphate בתאי HCT116.
- נצפו הבדלים משמעותיים ברמות IP8 בין תאי HCT116 ממקורות שונים.
- נרשמו שינויים במטבוליזם של inositol phosphate בעקבות טיפול בנתרן פלואוריד.
- השיטה הפגינה רמת חזרתיות ורגישות גבוהה.
מסקנות
- CE-ESI-MS הוא כלי בעל ערך לחקר מטבוליזם של אינוזיטול פוספט.
- הטכניקה יכולה להעמיק את הבנתנו לגבי מסלולים ביוסינתטיים תאיים.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול מחקרים רחבים יותר על אינוזיטול פוספטים בהקשרים ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות מדויק של אינוזיטול פירופוספטים (PP-InsPs) מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטיים בתיקוף מטרות על ידי אספקת תוצאות כמותיות של הומיאוסטזיס של פוספט ומטען אנרגיה תאי. שיטת CE-ESI-MS זו תומכת בפיתוח בדיקות עבור מסלולי איתות תוך-תאיים, ומספקת הפרדה בסיסית של רגיואיזומרים ונתוני ריכוז מוחלטים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות לניטור זמני של PP-InsPs תחת תנאים ניסיוניים, ובכך מסייעת בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) בבחירת מודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקושרות PP-InsPs למסלולי איתות מטבוליים ולמסלולים של רגישות לאינסולין.
- ערך תפעולי: מספק כימות רגיש ובעל תפוקה גבוהה של PP-InsPs בריכוזים נמוכים ללא שימוש בסמנים רדיואקטיביים, ובכך מפחית את מורכבות הבדיקה ואת עלותה.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת ריכוזים תאיים מוחלטים של PP-InsPs, כולל איזומרים מינוריים, לצורך הערכת רמת הביטחון במטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק הפרדה בסיסית של רגיו-איזומרים של PP-InsP, המאפשרת זיהוי ספציפי של מינים רלוונטיים ביולוגית בתאי יונקים.
- ערך תפעולי: מציע תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור באמצעות סטנדרטים פנימיים המסומנים באיזוטופים יציבים, מה שמבטיח סטנדרטיזציה של הבדיקה בין הרצות שונות.
- יכולת הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת השפעות של תרכובות על מטבוליזם של אינוסיטול פוספט במערכות הרלוונטיות למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: מקשרת בין דינמיקת PP-InsP בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות ניטור שינויים זמניים בתאי HCT116 תחת תנאים ניסיוניים, כגון טיפול בנתרן פלוריד.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: חושפת שינויים ברמות IP7/IP8 והופעתו של PPIP4, ובכך תומכת בהתאמה של סמנים ביולוגיים ספציפיים למסלול ובקבלת החלטות על קידום מבוסס ניהול סיכונים.
- מערכת רלוונטית למחלה: ישימה לחקר הומיאוסטזיס של פוספט ומטען אנרגטי תאי במודלים של אונקולוגיה ומחלות מטבוליות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי תרכובות מובילות ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי אספקת נתוני PP-InsP כמותיים בעלי רזולוציה מבנית, המסייעים להבנה מכניסטית ולבדיקת מוכנות המערך.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות כימות של PP-InsPs כשליחים מטבוליים הסוקרים את ההומאוסטזיס של הפוספט ואת הרגישות לאינסולין.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של הבדיקה באמצעות זיהוי רגיש והפרדה בסיסית של PP-InsPs, מה שמאפשר הערכה מהימנה של תרכובות בבדיקות של איתות מטבולי.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (ריכוזים מוחלטים, שינויים זמניים) באמצעות MRM, מה שמאפשר השוואה סטטיסטית בין תנאים וקווי תאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרצף פרה-קליני באמצעות ניטור של מודולציה של PP-InsP במערכות הרלוונטיות למחלה, ובכך תומכת בהתאמת סמנים ביולוגיים ובקבלת החלטות מותאמות סיכון.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת CE-ESI-MS ניתנת לשימוש חוזר למחקרים אורך של מטבוליזם של אינוזיטול פוספט על פני מספר פרויקטים ותחומים טיפוליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות כימות מוחלט של PP-InsPs, והפחתת עמימות מכניסטית באותות של אינוזיטול פוספאט.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ורגישות שהושגו באמצעות CE-ESI-MS עם נורמליזציה של סטנדרט פנימי ופרמטרי מקור אופטימליים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת תהליך (go/no-go) באמצעות קריאות כמותיות של PP-InsP, יעילות הונית על ידי הימנעות משיטות רדיואקטיביות, והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הפחתת סיכונים מוקדמת במסלול.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על נתוני מודולציה של PP-InsP, המאפשר קידום מושכל של תרכובות המשפיעות על הומיאוסטזיס של פוספאט ואותות אנרגיה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באלקטרופורזה נימיה, אופטימיזציה של ספקטרומטריית מסות וכימות מטבוליטים באמצעות סטנדרטים מסומנים באיזוטופים יציבים.
- נדרשת ציוד הכולל מערכת CE מסחרית, MS בעל משולש קוואדרופול עם מקור Agilent Jet Stream ESI, ותוכנת MassHunter לרכישת נתונים וניתוחם.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת תמיסת הריצה של ה-CE, קצבי זרימה של נוזל המעטפת (1 mL/min), ונהלי התקנת נימים כדי להבטיח יציבות של תרסס ה-ESI (תנודתיות של TIC בפחות מ-5%).
- כולל שיקולי התאמה לסוגי דגימות שונים (תאים, רקמות) הדורשים נורמליזציה למספר תאים או לתכולת חלבון ובחירה מתאימה של סטנדרט פנימי.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בבדיקות חזרתיות ורגישות של המערכת לפני המדידות, והפרעות פוטנציאליות מאינוזיטול פוספטים בשפע גבוה במהלך פיתוח השיטה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Setting Up the Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry (CE-ESI-MS) System
1:38
Preparation of Buffer, Capillary, and CE-MS System
3:28
Performing the CE-ESI-MS Runs
5:10
Data Analysis
6:50
Results: Quantitation of Inositol Pyrophosphates from Mammalian Cell Extracts by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry
8:35
Conclusion
