התאמת Organoids במערכת העיכול עבור זיהום פתוגן ורצף תא יחיד תחת בטיחות ביולוגית רמה 3 (BSL-3) תנאים

פרוטוקול זה מאפשר לנו להבין כיצד סוגי תאים בודדים נוכחים בתגובת האפיתל במעיים האנושיים לזיהום ויראלי. אנו מציגים כאן שלוש דרכים עצמאיות לזרוע אורגנוידים במעיים אנושיים כדי לטפל באופן שבו מסלול הזיהום יכול להשפיע על האופן שבו התא מגיב. אנו מדגישים כיצד להכין דגימות עבור רצף RNA תא יחיד בהתחשב בתקנות הבטיחות הביולוגית שיש לכבד בעת עבודה עם פתוגנים קטגוריה 3.

שיטה זו יכולה בקלות להיות מותאמת לפתוגנים אחרים ותרבויות organoid. השיקול החשוב ביותר הוא להבטיח כי המודלים organoid שלך מובחנים לחלוטין עם שיטת זריעה שנבחרה והוא יכול לתמוך זיהום ויראלי. לפני קצירת האורגנוידים הנגועים, הסירו את חרוזי הג'ל של התא הבודד ממינוס 80 מעלות צלזיוס וחממו אותם לטמפרטורת החדר.

בנוסף, יש לתעד את ריאגנט RT, להפחית את סוכן B ואת אנזים RT C לטמפרטורת החדר ולתכנת מחדש את מתג התבנית אוליגו כמתואר בהוראות היצרן. לאחר מכן, כדי לאסוף organoids 3D נגוע BSL-3 פתוגן, להסיר את צלחת תרבית התא מן האינקובטור ולהניח אותו במכסה המנוע תרבות התא. לאחר מכן, בעזרת פיפטה P1000, הסירו את מדיית הבידול מכל באר של צלחת 24-well, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח לכל באר ודגרו בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות.

לאחר מכן, כדי לשבש באופן מלא את פתרון המטריצה החוץ-תאית, פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי resuspend PBS, מטריצה חוץ תאית, אורגנוידים, ולאחר מכן להעביר את organoids resuspended לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר ומניחים את הצינורות על קרח. לאסוף כל מצב זיהום בצינורות חרוטים 15 מיליליטר נפרדים. לאחר החלפת כפפות, לנקות את החלק החיצוני של הצינור ולהסיר את הצינור מן מכסה המנוע תרבות התא.

סובב את הדגימות במשך חמש דקות. הזז את הצינור בחזרה לתוך מכסה המנוע תרבית התא ולהסיר את PBS, הימנעות resuspension של הכדור של organoid מתחתית הצינור. לאחר מכן, resuspend הכדור במיליליטר אחד של אנזים דיסוציאציה.

ואז להחליף כפפות, לנקות את הצינור, ולדגירה את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה, להזיז את הצינור בחזרה לתוך מכסה המנוע תרבית התא כל 10 דקות ו respend organoids על ידי צינור למעלה ולמטה. כדי לקבוע אם האורגנוידים מנותקים לתאים בודדים, הנח 10 מיקרוליטרים של ההשעיה האורגנוידית בשקופית מונה תאי פלסטיק חד פעמית באמצעות פיפטת P10, ולאחר מכן אטמו את יציאת הקלט לדוגמה עם סרט שקוף.

לאחר החלפת כפפות, נקה את החלק החיצוני של מונה התא ושימוש במיקרוסקופ ברייטפילד, ודא כי השעיית תא בודד נוצר. לאחר אישור של השעיית תא יחיד, להפסיק את העיכול על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיה DMEM F12 המכיל 10% FBS ו pipette למעלה ולמטה 10 פעמים. ואז לשנות את הכפפות, לנקות את הצינור ולסובב את המדגם.

לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את המדיה המכילה את האנזים דיסוציאציה, תוך הקפדה לא להפריע לכדור התא בתחתית. לאחר מכן תקיף מחדש את התאים הבודדים באמצעי אחסון מינימלי של PBS המכיל 0.1%BSA. לאחר העברת ההשעיה של התא לתוך צינור FACS דרך מסנן כדי להסיר גושים גדולים, מניחים את הצינור על קרח.

לאחר מכן, כדי לקבוע את מספר התאים לכל מיקרוליטר, להוסיף 10 microliters של השעיית התא לתא ספירת תאי פלסטיק חד פעמי. לאחר מכן אטמו את יציאת הקלט לדוגמה עם סרט ברור לפני הסרת הדגימה ממכסה המנוע של תרבית התא. החליפו כפפות, נקו את תא ספירת התאים, ואז ספרו את מספר התאים באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד.

לאחר מכן, בתוך מכסה המנוע תרבית התא, להכין תערובת מאסטר של ריאגנט RT, תבנית מתג אוליגו, הפחתת סוכן B, ו RT אנזים C בצינור 1.5 מיליליטר בהתאם להוראות היצרן בהתאם למספר הדגימות בניסוי. עבור כל דגימה, aliquot 33.4 microliters של תערובת מאסטר לתוך צינור PCR, ולאחר מכן להוסיף את התאים והמים לתערובת הראשית על פי מספר תא היעד. לאחר החלפת כפפות, העבר את בקר התא הבודד למכסה המנוע של תרבית התא והכן את השבב.

לאחר מכן, הוסף את שבב התא הבודד למחזיק השבב ומלא את הנתיבים שאינם בשימוש ב- 50% גליצריל. מוסיפים את התערובת הראשית, החרוזים והחלוקת השמן לנתיבים המכילים דגימות בהתאם להוראות היצרן ומכסה את השבב עם אטם. לאחר טעינת השבב לבקר, הפעל את התוכנית.

עם השלמת התוכנית, להסיר את השבב ואת האטם, ולאחר מכן באמצעות pipette רב ערוצי, להעביר 100 microliters של אמולסיות לנקות צינורות PCR. ודא שלכל אמולסיה יש צבע לבן אחיד המציין שאירע אמולסיה מלאה. לאחר החלפת כפפות וניקוי הצינורות, להעביר את צינורות PCR למכונת PCR ולהתחיל את התוכנית.

בסוף ריצת PCR, רוב הווירוסים עטופים יהיו מומתים. תמונות ברייטפילד הנציגות בימים אחד, שלוש, חמש ושבעה organoids לאחר פיצול מוצגים כאן. בממוצע, האורגנוידים מפוצלים פעם בשבוע כשהמרכזים נעשים חשוכים.

על ידי שינוי תנאי המדיה, הסרת Wnt-3a והפחתת R-ספונדין ונוגין, ניתן לתחום את המורכבות התאית שנמצאת במעי האנושי. בדרך כלל, הבחנה תאית כלפי תאים של Paneth, תאי גביע ואנטרוציטים דורשת ארבעה ימים של מדיית בידול. ניתוח של נתוני ריצוף תאים בודדים מ- SARS-CoV-2 נגוע המעי הגס ואת organoids נגזר אילום הראה כי רק תת-אוכלוסין של תאי אפיתל המעי האנושי תמך בזיהום של SARS-CoV-2 לאחר 12 ו 24 שעות.

ניתוח של תגובות חיסוניות מולדות באורגנוידים נגועים במעי הגס SARS-CoV-2 הראה כי SARS-CoV-2 גרם למפל אות פרו דלקתי בתאים נגועים בעוד שתאי עובר אורח שאינם נגועים הראו תגובה חיסונית אינטרפרון. בנוסף, רצף RNA של תא בודד הראה כי תאים נגועים לא הצליחו לחוש אינטרפרונים עקב חסימה בתיווך וירוס של המסלול. האורגנוידים חייבים להיות מובחנים ובריאים.

זה יכול להיות נשלט על ידי קביעת רמת סמני בידול התא על ידי qPCR לפני זיהום. אם התאים אינם מובחנים היטב, הם לא יתמכו בזיהום ויראלי ויובילו לתוצאות לא מידע. טכניקה זו מאפשרת לנו להדביק את הרירית הן מהצד הזוהר והן מצד הרקמה.

זה מאוד מפתח כפי שהוא מאפשר לנו לפענח מנגנונים המשמשים משטחים ריר לסבול סביבה מלוכלכת בצד אחד סטרילי אחד בצד השני.