Name: התאמת Organoids במערכת העיכול עבור זיהום פתוגן ורצף תא יחיד תחת בטיחות ביולוגית רמה 3 (BSL-3) תנאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: חקור זיהום אורגנואידים ממערכת העיכול האנושית בנגיפים ברמה ביולוגית 3 תוך שימוש ברצף RNA תא יחיד. שיטה זו מאפשרת ניתוח תגובות חיסוניות ברמת התא הבודד ומסייעת לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מייגן סטניפר וסטייב בולנט נתמכו על ידי מענקי מחקר של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG): (מספר הפרויקט 240245660, 278001972, 415089553 272983813 לסטייב בולנט 416072091 למייגן סטניפר), מדינת באדן-וורטמברג והבונדסמיניסטריום פיור בילדונג ופורשונג BMBF 01KI20239B ל- MS ו- 01KI20198A ו - NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) ל- SB. שרטוטים נוצרו ב- BioRender.

<ol><li>Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+Modeling+development+and+the+stem+cell+niche+in+a+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish.</a> Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Tekes, G., Ehmann, R., Boulant, S., Stanifer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+feline+ileum-+and+colon-derived+organoids+and+their+potential+use+to+support+feline+coronavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Development of feline ileum- and colon-derived organoids and their potential use to support feline coronavirus infection.</a> Cells. 9, (2020).</li>
<li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375, 409-424 (2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26, 1077-1083 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li>
<li>de Graaf, M., van Beek, J., Koopmans, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+norovirus+transmission+and+evolution+in+a+changing+world%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Human norovirus transmission and evolution in a changing world.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 421-433 (2016).</li>
<li>Leshem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-world+effectiveness+of+pentavalent+rotavirus+vaccine+among+bedouin+and+jewish+children+in+southern+Israel%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases+%3A+An+Official+Publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+Of+America%22%5BJournal%5D)">Real-world effectiveness of pentavalent rotavirus vaccine among bedouin and jewish children in southern Israel.</a> Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society Of America. 62, Suppl 2 155-160 (2016).</li>
<li>Karst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+commensal+bacteria+on+infection+with+enteric+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The influence of commensal bacteria on infection with enteric viruses.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 197-204 (2016).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353, 1387-1393 (2016).</li>
<li>de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D., Munster, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS+and+MERS%3A+recent+insights+into+emerging+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 523-534 (2016).</li>
<li>Scaldaferri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrilling+journey+of+SARS-CoV-2+into+the+intestine%3A+From+pathogenesis+to+future+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">The thrilling journey of SARS-CoV-2 into the intestine: From pathogenesis to future clinical implications.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 26, 1306-1314 (2020).</li>
<li>Kipkorir, V., Cheruiyot, I., Ngure, B., Misiani, M., Munguti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+SARS-CoV-2+RNA+detection+in+anal%2Frectal+swabs+and+stool+specimens+in+COVID-19+patients+after+negative+conversion+in+nasopharyngeal+RT-PCR+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Prolonged SARS-CoV-2 RNA detection in anal/rectal swabs and stool specimens in COVID-19 patients after negative conversion in nasopharyngeal RT-PCR test.</a> Journal of Medical Virology. 92, 2328-2331 (2020).</li>
<li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369, 50-54 (2020).</li>
<li>Stanifer, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+type+III+interferon+in+controlling+SARS-CoV-2+Infection+in+human+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Critical role of type III interferon in controlling SARS-CoV-2 Infection in human intestinal epithelial cells.</a> Cell Reports. 32, 107863(2020).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+immune+response+of+intestinal+cell+types+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+reveal+SARS-CoV-2+interference+with+intrinsic+immune+response+in+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut.</a> Molecular Systems Biology. 17, 10232(2021).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental & Molecular Medicine. 50, 1-14 (2018).</li>
<li>García-Rodríguez, I., Sridhar, A., Pajkrt, D., Wolthers, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Put+some+guts+into+it%3A+Intestinal+organoid+models+to+study+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Put some guts into it: Intestinal organoid models to study viral infection.</a> Viruses. 12, 1288(2020).</li>
<li>Stanifer, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+TLR3+leads+to+a+polarized+immune+response+in+human+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of TLR3 leads to a polarized immune response in human intestinal epithelial cells.</a> Nature Microbiology. 5, 181-191 (2020).</li>
<li>Lees, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+and+modify+epithelial+cell+protection+against+salmonella+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52483(2015).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human Intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li>
<li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+model+for+infectious+diseases%3A+Culture+of+human+and+murine+stomach+organoids+and+microinjection+of+Helicobacter+Pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organoids as model for infectious diseases: Culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter Pylori.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53359(2015).</li>
<li>Hernandez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-lambda+and+interleukin+22+act+synergistically+for+the+induction+of+interferon-stimulated+genes+and+control+of+rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interferon-lambda and interleukin 22 act synergistically for the induction of interferon-stimulated genes and control of rotavirus infection.</a> Nature Immunology. 16, 698-707 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

פתוגנים אנטריים לרוב ליזום מחזור החיים שלהם על ידי הדבקת תאי אפיתל מעיים מהצד האפיקלי שלהם מול לומן של המעיים. בעוד organoids מוכרים היטב להיות מודל טוב כדי לשחזר את המורכבות התאית ואת הארגון של אפיתל המעי, הארגון שלהם כמו מבנים תלת ממדיים, סגור להפוך את הממברנה האפית שלהם נגיש לפתוגן. פרוטוקול זה תיאר שיטות להדבקת organoids מעיים מהצד האפילי שלהם, הצד הבסולטרי שלהם, או שניהם עם פתוגנים BLS-3. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות כדי ללמוד כל פתוגן אנטרי תחת בלימת BSL-2 או BLS-3 או כל מודל organoid אחר על ידי ביצוע כמה צעדים קריטיים המודגשים להלן. השיטה המתוארת לעיל היא לבידוד והכנת טיפות חד-תאיות בהתאם לתקנות בגרמניה. כתב ויתור, פרוטוקול זה אינו מתאר את אמצעי הטיפול בבטיחות ביולוגית (הליכי הפעלה סטנדרטיים) שיש לנקוט בעת עבודה בתנאי BSL-3. כמו כן, חשוב לעמוד על כך שהתקנות עשויות להשתנות במדינות אחרות וכי יש לפנות לרשויות המקומיות כדי לוודא שכל התקנות המקומיות יכובדו.
אחד הצעדים הקריטיים בזריעת אורגנוידים בשני ממדים לזיהום אפיקלי הוא שליטה כי תאים יבדילו באופן דומה לעומת כאשר גדל כמו organoids תלת ממדי קלאסי. בהתאם לפתוגן המעית, טרופיזם יכול להיות מוגבל לתאים נדירים מאוד או לתאים שצריכים להיות מובחנים מאוד. במקרה זה, באמצעות organoid דו מימדי שלא הבדיל לחלוטין עלול לגרום לתקלה שגויה כי פתוגן אנטרי זה לא יכול להדביק organoids מעיים. מומלץ, אם אפשר, לבצע זיהומים באמצעות שלוש התצורות של פרוטוקול זה: אורגנויד 2D לזיהום apical בלבד (סעיף 2), סדוק פתוח 3D organoids עבור זיהום apical ו basolateral (סעיף 3), ואורגנוידים 3D מלא עבור זיהום בזולטר בלבד (סעיף 3). גישה זו תסייע להבחין בנתיב הכניסה של הפתוגן (apical לעומת basolateral) וגם תשלוט כי רמה דומה של בידול הושגה. חלופה לזיהום אפיקלי 2D היא microinjection, אשר ישתמש אורגנויד 3D אבל לספק את הפתוגן ישירות לתוך הצד apical (ראה Bartfeld ואח'27 לפרטים). שיטה זו דורשת מזרק מיומן כדי להבטיח כי הפתוגן ממוקם כראוי, ואת organoids להישאר שלם. Microinjection משמש בדרך כלל בלימת BSL-2 וייתכן שאינו מתאים לבלימת BSL-3.
שיקול חשוב נוסף בעת ביצוע ניסויי זיהום באורגנוידים זרעים 2D הוא צפיפות התא הסופית. כפי שהוזכר בשלב 2.3, 100-150 organoids יהיה זרע באר אחת של צלחת 48-well או באר אחת של שקופית תא זכוכית 8-טוב. בהתאם לקו האורגנויד ועל האדם המטפל באורגנוידים, גודל האורגנוידים האלה יכול להיות שונה באופן משמעותי. זה יכול לגרום לצפיפות תאים שונה מאוד בצלחת 48-well או 8-טוב זכוכית-בתחתית שקופית. בהתאם לנגיף המעית, וירוסים מסוימים מעדיפים תאים דלילים יותר, בעוד שאחרים יוכלו גם להדביק תאים מתמשכים. המקור המולקולרי של הבדלים כאלה בהדבקה עבור מפגשי תאים שונים אינו ברור; לכן, ניסויי פיילוט שמטרתם למצוא את צפיפות התא הטובה ביותר עבור הפתוגן המעינטי של בחירה צריך להתבצע לפני ביצוע אפיון במורד הזרם.
לעתים קרובות מיון FACS מתבצע לפני ביצוע אמולסיה טיפה של תא יחיד. שלב זה משמש לעתים קרובות כדי להפריד בין מתים לתאים חיים ותאים בודדים מכפילים. בעת עבודה עם פתוגנים BSL-3, זה דורש כי המתקן מצויד עם ממיין FACS מתאים, וזה לא לעתים קרובות המקרה. יתר על כן, לא כל התאים באורגנויד יש את אותו גודל, וזה לעתים קרובות קשה להפלות בין כפול או תא גדול יותר, ובכך גורם לסיכון של בחירה שלילית נגד סוג תא מסוים. כמו כן, עדיין יש דיון בתחום אם הזמן הדרוש למיון בין 5,000-10,000 עבור כל מדגם יכול לגרום לשינוי משמעותי בפרופיל התמליל של התאים הבודדים. בעוד שיטות קיבוע תאים התואמות רצף תא יחיד (למשל, מתנול ו RNAassist) תוארו, זה נצפתה כי זה מוביל לירידה באיכות הרצף18. לבסוף, יש חשד כי מיון תאים באמצעות סמני מוות תאים יכול גם להוביל להטיה. בהתחשב בהתפשטות הכיוונית וההבחנה של התאים דרך ציר הקריפטה-וילי, התאים המובחנים ביותר, אשר הולכים להי לשפך ולשחרר, ממוקמים בקצה הווילי. תאים אלה הם לעתים קרובות חיובי עבור סמנים שונים של מסלולי מוות תאים (למשל., אפופטוזיס, נמק, נמק); עם זאת, כאשר מסתכלים על זיהום rotavirus של מעי העכבר, קצה villi הוא האזור הנגוע ביותר28. לכן, סינון תאים שעשויים להיראות חיוביים עבור סמני מוות יגרום לבחירה שלילית של התאים הנגועים שעשויים לייצג את הזיהום הפיזיולוגי. נכון לעכשיו, אין פתרון טוב למיון ותיקון organoids לפני רצף תא יחיד. שימוש בתאים חיים, לא ממוינים מומלץ כמו מחקרים נוספים נדרשים כדי למצוא פרוטוקולים חלופיים מתאימים.
רצף של תא בודד חולל מהפכה באופן שבו ניתן להעריך תגובות תאיות. טכניקה זו מאפשרת זיהוי של תגובות ספציפיות שושלת התא הן בתנאים בסיסיים ותחת זיהומים פתוגן. שיטה זו פתחה דלתות בתחומים רבים שהוגבלו בעבר על-ידי קריאות בצובר. בעוד שיטה זו היא חזקה מאוד, יש לה מגבלותיה. מגבלה מרכזית היא ניתוח ביואינפורמטי נרחב הנדרש במורד הזרם של הרצף. זה מפתח במיוחד בעת ניתוח רקמות והקצאת סוגי תאים שבהם אין כרגע ביאור. לאחר ביואינפורמטיקה מיומנת נדרשת לתמוך בכל המחקרים של תא יחיד.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לזרוע ולטפל organoids מעיים אנושיים, להדביק אותם עם פתוגנים אנטריים, ולבצע scRNAseq. התאמת גישה זו לאיברים אחרים אפשרית כעת, שכן פותחו מערכות מודל אורגנויד עבור רוב האיברים. אורגנוידים ריאות וכבד מאורגנים באופן דומה לעומת organoids מעיים, וככזה, באמצעות גישה אנלוגית יכול להיות מוחלף לאורגנואידים אלה. השליטה הקריטית תהיה לאמת כי כאשר גדל בשני ממדים או סדוק פתוח, organoids אלה להשיג הבחנה דומה כמו עמיתיהם האורגנויד 3D. התכונות והגנים הספציפיים המגדירים מצב מובחן הם ספציפיים לכל מודל איברים. מודלים organoid אחרים כגון organoids כליות וכלי דם, מבנים צפופים גדולים, יצטרך שיטות נוספות כדי לנתק מבנים אלה באופן סדרתי לתאים בודדים.

חקר הטרופיזם הספציפי לסוג התא ותגובה חיסונית ספציפית לסוג התא לווירוסים המעיתים האנושיים היה מאתגר מבחינה היסטורית בשל היעדר מודלים תאיים אנושיים ראשוניים. מגבלה זו הושמדה כעת חלקית עם התפתחות האורגנוידים1. במקרה של מערכת העיכול, מודלים organoid קיבה ומעיים פותחו עבור בני אדם וכמה מינים אחרים (למשל., מורין, שור, חתול, עטלף)2,3,4,5,6. אורגנוידים במעיים משחזרים את הארכיטקטורה המבנית של אפיתל המעי האנושי ומכילים מבנים דמויי קריפטה וווילי, שושלות מעיים פונקציונליות ואף שימשו לזיהוי שושלות תאים שלא היו ידועות קודם לכן. שתי גישות שונות ניתן להשתמש כדי לגדל organoids מעיים. ראשית, תאי גזע מעיים המכילים קריפטות מבודדים כריתות רקמות או ביופסיות וגדלים בתנאי תרבית ספציפיים (למשל, Wnt3A, R-spondin, Noggin ו- EGF) כדי להתרחב, ולאחר מכן להבדיל את תאי הגזע לרוב שושלות תאי המעי (למשל. שיטה זו מאפשרת בידוד של organoids מכל חלקי מערכת העיכול(למשל,הבטן, התריסריון, jejunum, איליאום, ומעי הגס). השיטה השנייה מסתמכת על תאי גזע פלוריפוטנטים או עובריים הנגרמים על ידי האדם, אשר מובחנים לאחר מכן בתהליך צעד לתוך תאי אפיתל מעיים8. אורגנוידים אלה מבוססי תאי גזע מושרים מתוארים לעתים קרובות כעובריים יותר בטבע בהשוואה לאורגנואידים שמקורם במטופל. בעוד כל המודלים האורגנוידים האלה היו קריטיים לפריקת רמזים התפתחותיים הדרושים כדי ליצור את מערכת העיכול, השימוש שלהם במחקר מחלות זיהומיות עדיין בחיתוליו.
וירוס אנטרי הוא מונח רחב המכסה את כל הווירוסים, אשר להדביק דרך מערכת העיכול, כגוןpicornaviruses (למשל, EV-71), reoviruses (למשל, rotavirus), ו caliciviruses (למשל, norovirus)9. וירוסים אנטריים יוזמים את מחזור החיים הזיהומי שלהם באמצעות בליעה של מזון ומים מזוהמים, מה שמשאיר אנשים במדינות מתפתחות בסיכון גבוה עקב פריקה של פסולת לא מטופלת לסביבה וחוסר טיפול רפואי לאחר תחילת זיהום10. בהתאם לסוג של פתוגן, הזיהום יכול להוביל דלקת גסטרואנטריטיס, הקאות, ו/או שלשול מימי עקב דליפה של רירית המעי. noroviruses אנושי הם פתוגן אנטרי נפוץ מאוד זיהומיות מאוד, שמובילים מעל 600 מיליון זיהומים ו 15 מיליון אשפוזים ברחבי העולם11. Organoids היו המפתח למחקר norovirus כפי שהם תומכים זיהום ושכפול של norovirus אנושי, אשר בעבר לא היה מסוגל להיות תרבותי במודלים סטנדרטיים של תרבות התא12.
בשני העשורים האחרונים, נגיפי קורונה התגלו כפתוגנים אנושיים מרכזיים13. משפחה זו כוללת את MERS פתוגניים מאוד, SARS-CoV-1, ו SARS-CoV-2, אשר דורשים בלימות רמת בטיחות קפדנית בעת ביצוע מחקר על וירוסים אלה. מעניין, בעוד כל שלושת הפתוגנים האלה מוכרים בעיקר בשל הסימפטומים הנשימתיים המושרים שלהם ומצוקה, כעת ברור כי וירוסים אלה אינם מדביקים רק את דרכי הנשימה אלא גם איברים אחרים. פתולוגיה חשובה המושרה בחולים נגועים SARS-CoV-2 מלבד המצוקה הנשימתית היא נוכחות של תסמינים במערכת העיכול14. חלק קטן מהחולים הנגועים SARS-CoV-2 מציג תסמינים כאלה, החל משלשול קל מאוד עד חמור. בנוסף, גנומים SARS-CoV-2 ניתן לזהות ביופסיות צואה ומערכת העיכול של חולים נגועים15. חשוב לציין את נוכחותם של תסמינים במערכת העיכול אינו מוגבל SARS-CoV-2 כפי שהם נצפו גם בחולים נגועים MERS ו SARS-CoV-1. כדי להבין כיצד SARS-CoV-2 גורם למצוקה במערכת העיכול ולזהות במדויק את הטרופיזם של SARS-CoV-2 במערכת העיכול, אורגנוידים במעיים אנושיים היו כלי מרכזי וכעת מנוצלים כדי לפענח תגובות ספציפיות לסוג התא לפתוגן זה16,17.
פרופיל תמלול של אוכלוסיית תאים (ריצוף RNA בתפזורת) היה נוהג מקובל בעת הערכת זיהומים פתוגן של שני קווי תאים מונצחים, כמו גם עם organoids. בעוד זה מאפשר לנו לקבוע שינויים גלובליים בתגובה פתוגנים (למשל, upregulation של ציטוקינים), בתפזורת RNAseq אינו מאפשר לנו לקבוע מדוע תאים ספציפיים באוכלוסייה נוטים יותר לזיהום מאחרים. רצף RNA חד-תאי (scRNAseq) הפך לכלי רב עוצמה כדי לפענח תוכניות תמלול ספציפיות לשושלת תאים וניתן להשתמש בו כדי לקבוע כיצד תוכניות אלה תומכות או מדחיקות זיהום וירוס18,19. התיאור הראשון של scRNAseq היה בשנת 2009 ושימש להערכת פרופילי התמלול של התאים השונים שנמצאו בפיצוץ עכבר20. טכנולוגיות אלה הורחבו כעת וניתן ליישם אותן באמצעות מספר פלטפורמות שונות. גרסאות מוקדמות של טכנולוגיה זו יישמו ממיין תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי להפריד תאים בודדים לרצף, אשר הוגבל לעתים קרובות לוחות 96- או 384-well, ובכך לתת 300 תאים בודדים לנתח לכל מדגם21. שיטות אלה קודמו כעת על ידי פלטפורמות ריצוף תא יחיד, המשתמשות במכשיר מיקרופלואידי כדי לתמצת תאים בודדים לתוך טיפות בודדות עם ברקוד המכיל חרוזים. טכנולוגיה זו מאפשרת ללכוד עד 10,000 תאים לפי תנאי דגימה.
שילוב טכנולוגיית organoids עם scRNAseq מאפשר לנו לחקור כיצד פתוגנים אנטריים משפיעים על מערכת העיכול באופן ספציפי לסוג התא. עם זאת, יש לקחת מספר שיקולים טכניים וביו-בטיחותיים. בראש ובראשונה, שיטות תרבות האורגנוידים הקלאסיים (אורגנוידים תלת-ממדיים), המוטמעים במטריצה חוץ-תאית (ECM)) חושפות את הצד הבסולטרי של תאי האפיתל לחלק החיצוני של האורגנויד. כמו פתוגנים אנטריים ליזום את הזיהום שלהם באמצעות בליעה של מזון / מים מזוהמים, הזיהום לרוב יוזם מהצד האפילי של התאים, אשר אינו נגיש אלה organoids מעיים 3D. לכן, organoids צריך להיות מוכן כדי להפוך את הצד apical נגיש עבור זיהום פתוגן או באמצעות זריעה 2D, ובכך לחשוף ישירות את הצד האפירי של התאים, או באמצעות microinjection22,23. שנית, כדי לבצע scRNAseq של דגימות ביולוגיות נגועות, חשוב לשקול את האופי הזיהומי שלהם. בעוד שיטות לתיקון תאים ולהפעלת פתוגנים לפני בידוד תא יחיד עבור RNAseq הבאים הוצעו, שיטות אלה מובילות לעתים קרובות לירידה באיכותהרצף 18. הפרוטוקול שלהלן יתאר מספר גישות להדבקת אורגנוידים במעיים בווירוסים אנטריים בהתחשב בצד הזיהום (זיהום apical לעומת basolateral) (איור 1). בנוסף, הפרוטוקול יכלול זרימת עבודה לניתוק ולבודד תאים בודדים מאורגנואידים נגועים בווירוסים פתוגניים מאוד עבור scRNAseq. הפרוטוקול ידגיש את השלבים העיקריים שיש ליישם בעת עבודה בתנאי בלימה ברמת בטיחות ביולוגית-3 (BSL-3) כדי למנוע ייצור אירוסולים וזיהום פוטנציאלי.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; עכבר רקומביננטי נוגין</td><td>Peprotech</td><td>Cat # 250-38</td><td></td></tr> <tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # G9145</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat #25300054</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות שאינה מטופלת בתרבית תאים</td><td>קורנינג</td><td>חתול # 3738</td><td></td></tr><tr><td>שקופית תא תחתון זכוכית 8 בארות</td><td>iBIDI</td><td>עגלת #80827</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>Cat#2939</td><td></td></tr><tr><td>מתקדם DMEM/F12</td><td>תרמו פישר</td><td>מדעי חתול # 12634010</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>תרמו פישר חתול מדעי</td>#<td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>בקר כרום & ערכת אביזרי GEM הבאה</td><td>10X גנומיקה</td><td>Cat#1000202</td><td>משמש להכנת תמיסת תא בודד והכנת חרוזי ג'ל באמולסיה (GEM)</td></tr> <tr><td>כרום הבא GEM שבב G ערכת תא יחיד</td><td>10X גנומיקה</td><td>Cat #1000127</td><td>משמש להכנת תמיסת תא בודד והכנת חרוזי ג'ל בתחליב (GEM)</td></tr> <tr><td>כרום הבא GEM תא יחיד 3&prime; ערכה v3.1</td><td>10X גנומיקה</td><td>Cat#1000268</td><td>משמש להכנת תמיסת תא בודד והכנת חרוזי ג'ל בתחליב (GEM)</td></tr> <tr><td>קולגן מהשליה האנושית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>חתול#C5533-5MG</td><td></td></tr><tr><td>CYP34A קדימה</td><td>Eurofins</td><td>GATGGCTCTCATCCCAGACTT</td><td>פריימרים המשמשים לבדיקת התמיינות</td></tr><tr><td>CYP3A4 הפוך</td><td>Eurofins</td><td>AGTCCATGTGAATGGGTTCTCC</td><td>פריימרים המשמשים לבדיקת בידול</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#11320074</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Car#E9884</td><td></td></tr><tr><td>קריאה מהירה 102 שקופיות ספירת</td><td>Biosigma</td><td>Cat# BVS100</td><td></td></tr><tr><td>סרום בובין עוברי (FBS)</td><td>חתול גדי</td><td>#FBS-12A</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>תרמו פישר חתול</td># <td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat3 15630080</td><td></td></tr><tr><td>תאי L-WRN</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td>קו תאים זה משמש לייצור המדיה הממוזגת המכילה Wnt 3A, R-Spondin ו-Noggin. את הפרוטוקול לייצור המדיה המותנית ניתן למצוא באתר הייצור.</td></tr><tr><td>מטריג'ל. GFR, LDEV חינם</td><td>Corning</td><td>Cat # 354230</td><td></td></tr><tr><td>MUC-2 קדימה</td><td>Eurofins</td><td>TGTAGGCATCGCTCTTCTC</td><td>פריימרים המשמשים לבדיקת התמיינות</td></tr><tr><td>MUC-2 הפוכה</td><td>Eurofins</td><td>GACACCATCTACCTCACCCG</td><td>פריימרים המשמשים לבדיקת התמיינות</td></tr><tr><td>N-אצטיל-ציסטאין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>OLMF4 קדימה</td><td>Eurofins</td><td>ACCTTTCCCGTGGACAGAGT</td><td>פריימרים המשמשים לבדיקת התמיינות</td></tr><tr><td>OLMF4</td><td>Eurofins</td> הפוך <td>TGGACATATTCCCTCACTGGA</td><td>פריימרים המשמשים לבדיקת התמיינות</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Thermo Fischer</td><td>Scientific Cat#15140122</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי FGF בסיסי</td><td>Peprotech</td><td>Cat#100-18B</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IGF-1</td><td>BioLegend</td><td>Cat#590904</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי EGF</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>SI קדימה</td><td>Eurofins</td><td>AATCCTTTTGGCATCCAGATT</td><td>פריימרים המשמשים לבדיקת התמיינות</td></tr><tr><td>SI הפוך</td><td>Eurofins</td><td>GCAGCCAAGAATCCCAAT</td><td>פריימרים המשמשים לבדיקת התמיינות</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>קיימן כימיקלים</td><td>חתול#10005583</td><td></td></tr></tbody></table>

התאמת organoids במערכת העיכול עבור זיהום פתוגן ורצף תא יחיד תחת בטיחות ביולוגית רמה 3 (bsl-3) תנאים

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions

אורגנוידים במעיים אנושיים מהווים את המודל התאי הטוב ביותר לחקר זיהומים פתוגן של מערכת העיכול. אורגנוידים אלה יכולים להיגזר מכל חלקי מערכת העיכול (קיבה, ג'ונום, תריסריון, איליאום, המעי הגס, פי הטבעת) ועל פי הבחנה, מכילים את רוב סוגי התאים שנמצאים באופן טבעי בכל סעיף בודד. לדוגמה, אורגנוידים במעיים מכילים אנרוטיטים סופגי חומרים מזינים, תאי הפרשה (גביע, פאנית ואנטרונדוקריני), תאי גזע, כמו גם כל ביניים בידול ספציפיים לשושלת היוחז (למשל, סוגי תאים מוקדמים או לא בוגרים). היתרון הגדול ביותר בשימוש organoids נגזר מערכת העיכול כדי לחקור מחלות זיהומיות היא האפשרות לזהות במדויק איזה סוג התא ממוקד על ידי פתוגן המעית ולטפל אם החלקים השונים של מערכת העיכול וסוגי התאים הספציפיים שלהם מגיבים באופן דומה לאתגרי פתוגן. במהלך השנים האחרונות, מודלים במערכת העיכול, כמו גם organoids מרקמות אחרות, שימשו לחקר טרופיזם ויראלי ואת המנגנונים של פתוגנזה. עם זאת, ניצול כל היתרונות של שימוש organoids בעת שימוש וירוסים פתוגניים מאוד מייצג אתגר טכני ודורש שיקולים בטיחות ביולוגית קפדנית. בנוסף, כמו organoids גדלים לעתים קרובות בשלושה ממדים, הצד basolateral של התאים פונה החלק החיצוני של organoid בעוד הצד האפילי שלהם פונה פנימה (לומן) של organoids. ארגון זה מהווה אתגר עבור פתוגנים אנטריים כמו זיהומים אנטריים רבים ליזום מהצד apical / זוהר של התאים בעקבות בליעה. כתב היד הבא יספק פרוטוקול מקיף להכנת organoids מעיים אנושיים לזיהום עם פתוגנים אנטריים על ידי התחשבות בצד הזיהום (apical לעומת basolateral) לבצע רצף RNA חד-תאי כדי לאפיין אינטראקציות מארח /פתוגן ספציפיים לתא. שיטה זו מפרטת את הכנת האורגנוידים, כמו גם את השיקולים הדרושים לביצוע עבודה זו בתנאי בלימה ברמה ביולוגית 3 (BSL-3).

הכנת organoids לרצף של תא בודד תוצאות רצף של תא בודד תלויות מאוד בשימוש בתאים באיכות טובה. כדי להבטיח שאורגנואידים באיכות טובה, יש לתחזק אותו כראוי ונצפו על בסיס יומי כדי לקבוע מתי הם מוכנים לפיצול (איור 2). התזמון של פיצול האורגנוידים תלוי בתורם; חלק מהתורמים גדלים מהר יותר וצריכים להתחלק כל 5 ימים, בעוד שאחרים איטיים יותר וצריכים להתחלק כל 10 ימים. בממוצע, האורגנוידים מתחלקים פעם אחת בשבוע כשהמרכזים נעשים כהים(איור 2B). אם אורגנוידים מורשים להיות גדולים מדי ולצבור יותר מדי תאים מתים במרכז, האורגנויד ימות.
Organoids נשמרים במדיה המכילה כמויות גבוהות של Wnt3A. זה תומך בנישה של תאי גזע ומקדם את האורגנוידים להמשיך לגדול ולהתרבות. בתנאי גדילה אלה, האורגנוידים מכילים כמויות גבוהות של תאי גזע ותאים מגבירי מעבר וכמות נמוכה יותר של אוכלוסיות תאים מובחנות כגון enterocytes בוגרים, תאי גבל ותאים אנתרואנדוקריניים. עם זאת, כדי לחקות את המורכבות התאית שנמצאת בתוך המעי האנושי, חשוב לדחוף את בידול התא ולייצר יותר תאים אלה. זה מושג על ידי שינוי תנאי המדיה והסרת Wnt3A, והפחתת R-ספונדין ו Noggin(טבלה 1). בדרך כלל, הבחנה תאית כלפי אנטריציטים, תאי גופע ותאי אנטרונדוקריני דורשת 4 ימים של מדיית בידול(איור 3). זה המפתח כדי להשיג בידול טוב; אחרת, הערכת טרופיזם פתוגן ותגובות ספציפיות לסוג התא יהיה קשה.
אישור של BSL-3 אי-שבוית פתוגן אי-הפעלה מלאה חייבת להיות מאושרת עם הפתוגן של בחירה ומאותמת כי זה בטוח להסיר את cDNA מן BSL-3. עבור SARS-CoV-2, חוסר הפעילות המלאה של הנגיף אומת על ידי לקיחת 100 μL של SARS-CoV-2 ודגורתו במכונת PCR במשך 5 דקות ב 85 °C (85 °F). לאחר מכן נוספה הנגיף בחזרה לתאי Vero נאיביים, והדבקה בנגיף הושוותה לנגיף שאינו מטופל בחום על ידי אימונופלואורסצנטיות ובבדיקות פלאק במהירות של 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר ההדבקה כדי להבטיח שכל החלקיקים כבר לא מדבקים. תוצאות אלה נשלחו לסוכנות הרגולציה המקומית, ועם אישורן בוצע הניסוי בעל התא הבודד ועיבוד cDNA.
תוצאות רצף של תא בודד כדי להעריך כיצד SARS-CoV-2 מדביק את המעי הגס האנושי ואת organoids ileum, רצף תא יחיד בוצע. Organoids הוכנו כמתואר לעיל נגועים בפורמט 2D כדי לאפשר זיהום apical על ידי SARS-CoV-2. תאים נגועים נקצרו בשעה 12 שעות ו 24 שעות לאחר זיהום והם עובדו עבור רצף תא יחיד כמתואר לעיל. ניתוח נתוני הרצף של התא הבודד אפשר לנו לקבוע שרק תת-אכלוס (enterocyte לא בוגר 2) של תאי אפיתל מעיים אנושיים תמך בזיהום של SARS-CoV-2 (איור 4). בנוסף, מאחר שלא כל התאים באוכלוסייה נדבקו, הן תאים נגועים והן תאים לא נגועים של עוברי אורח נותחו(איור 5). תוצאות אלה הראו כי SARS-CoV-2 גרם מפל אות פרו דלקתי בתאים נגועים בעוד תאים עוברי אורח שאינם נגועים הראו תגובה חיסונית בתיווך אינטרפרון. בנוסף, scRNA-Seq הראה כי תאים נגועים לא הצליחו לחוש אינטרפרונים בשל חסימה בתיווך וירוס של המסלול (איור 5). לא ניתן היה להשיג מידע זה בעת שימוש ברצף RNA בצובר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig01.jpg"> איור 1: שרטוט המתאר את שלוש השיטות השונות להכנת אורגנוידים במעיים אנושיים לזיהום בפתוגנים אנטריים. זיהום אפיקלי ניתן להשיג באמצעות זריעת organoids מעיים 2D. זיהום apical ו basolateral יכול להתבצע על ידי שיבוש האורגנויד 3D. לבסוף, זיהום בזולטריאל בלבד יכול להתבצע על ידי הדבקת אורגנוידים מעיים תלת-ממדיים שלמים. ניתן להשתמש בכל אחת משיטות אלה כדי ליצור דוגמאות עבור רצף תאים בודדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig02.jpg"> איור 2: תמונות סכמטיות ותחזוקה של אורגנויד ותמונות ברייטפילד מייצגות. (א)סכמטי לתחזוקה והעברת אורגנוידים במעיים אנושיים. (ב.תמונות ברייטפילד מייצגות של ימים 1, 3, 5 ו- 7 לאחר הפיצול. ביום 7 האורגנוידים הופכים גדולים וחשוכים בשל הצטברות של תאים מתים ומוכנים לפצל. סרגל קנה המידה מציין 25 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig03.jpg"> איור 3: qPCR מייצג של אורגנוידים במעיים אנושיים 4 ימים לאחר המעבר למדיית בידול. אורגנוידים מעיים נשמרו במדיה צמיחה או עבר מדיה בידול במשך 4 ימים. RNA נקצר ו- qPCR בוצע עבור סמנים של תאי גזע (OLFM4), תאי פאנית '(LYZ), תאי גביע (MUC2) ואנטרוציטים (SI). N = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig04.jpg"> איור 4: זיהוי אוכלוסיית התאים שנדבקו בסארס-CoV-2. המעי הגס האנושי ואיליום נגזר אורגנוידים נדבקו SARS-CoV-2. לאחר 12 ו 24 שעות תאים לאחר זיהום נקצרו ונחשפו רצף RNA חד תא כדי לזהות אילו אוכלוסיות תאים תמכו בזיהום SARS-CoV-2. זיהום וירוס נמצא להגדיל עם הזמן בעיקר להדביק enterocyte לא בוגר 2. נתון זה שונה מטריאנה ואח '19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig05.jpg"> איור 5: קביעת תגובה חיסונית מולדת מהותית. אורגנוידים שמקורם במעי הגס האנושי נדבקו בסארס-CoV-2. לאחר 12 ו 24 שעות תאים לאחר זיהום נקצרו ונחשפו רצף RNA תא יחיד כדי לקבוע את התגובה החיסונית המולדת המהותית הן בתאים נגועים ויראלית ולא נגועים עוברי אורח. תאים נגועים SARS-CoV-2 הציגו תגובה פרו דלקתית חזקה בעוד שתאים לא נגועים של עוברי אורח הציגו תגובה בתיווך אינטרפרון. איור שונה מטריאנה ואח'19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">מדיה לצמיחה</td>
		</tr>
<tr>
<td>תרכובת</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ad DMEM/F12</td>
			<td>גלוטמקס (פי 1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+גלוטמקס</td>
			<td>HEPES 1 מ"מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>+HEPES</td>
			<td>עט 10 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>+P/S</td>
			<td>סטרפטופט 10 מיקרוגרם/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-WRN</td>
			<td>50% לפי נפח</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-אצטיל-ציסטאין</td>
			<td>1 מ"מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>50 ננוגרם/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
			<td>500 ננומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>IGF-1</td>
			<td>100 ננוגרם/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF בסיסי</td>
			<td>50 ננוגרם/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>גסטרין</td>
			<td>10 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מדיית בידול</td>
		</tr>
<tr>
<td>תרכובת</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ad DMEM/F12</td>
			<td>גלוטמקס (1x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+גלוטמקס</td>
			<td>HEPES 1 מ"מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>+HEPES</td>
			<td>עט 10 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>+P/S</td>
			<td>סטרפטופט 10 מיקרוגרם/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-אצטיל-ציסטאין</td>
			<td>1 מ"מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-ספונדין</td>
			<td>5% לפי נפח</td>
		</tr>
<tr>
<td>נוגין</td>
			<td>50 ננוגרם/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>50 ננוגרם/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>גסטרין</td>
			<td>10 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
			<td>500 ננומטר</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: הרכב מדיה למדיית צמיחה ובידול.

פרוטוקול זה מתאר כיצד להדביק organoids מעיים אנושיים מהצד apical או basolateral שלהם כדי לאפיין אינטראקציות מארח / פתוגן ברמת תא יחיד באמצעות טכנולוגיית רצף RNA של תא יחיד (scRNAseq).

התאמת Organoids במערכת העיכול עבור זיהום פתוגן ורצף תא יחיד תחת בטיחות ביולוגית רמה 3 (BSL-3) תנאים

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו להבין כיצד סוגי תאים בודדים נוכחים בתגובת האפיתל במעיים האנושיים לזיהום ויראלי. אנו מציגים כאן שלוש דרכים עצמאיות לזרוע אורגנוידים במעיים אנושיים כדי לטפל באופן שבו מסלול הזיהום יכול להשפיע על האופן שבו התא מגיב. אנו מדגישים כיצד להכין דגימות עבור רצף RNA תא יחיד בהתחשב בתקנות הבטיחות הביולוגית שיש לכבד בעת עבודה עם פתוגנים קטגוריה 3.שיטה זו יכולה בקלות להיות מותאמת לפתוגנים אחרים ותרבויות organoid. השיקול החשוב ביותר הוא להבטיח כי המודלים organoid שלך מובחנים לחלוטין עם שיטת זריעה שנבחרה והוא יכול לתמוך זיהום ויראלי. לפני קצירת האורגנוידים הנגועים, הסירו את חרוזי הג'ל של התא הבודד ממינוס 80 מעלות צלזיוס וחממו אותם לטמפרטורת החדר.בנוסף, יש לתעד את ריאגנט RT, להפחית את סוכן B ואת אנזים RT C לטמפרטורת החדר ולתכנת מחדש את מתג התבנית אוליגו כמתואר בהוראות היצרן. לאחר מכן, כדי לאסוף organoids 3D נגוע BSL-3 פתוגן, להסיר את צלחת תרבית התא מן האינקובטור ולהניח אותו במכסה המנוע תרבות התא. לאחר מכן, בעזרת פיפטה P1000, הסירו את מדיית הבידול מכל באר של צלחת 24-well, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח לכל באר ודגרו בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות.לאחר מכן, כדי לשבש באופן מלא את פתרון המטריצה החוץ-תאית, פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי resuspend PBS, מטריצה חוץ תאית, אורגנוידים, ולאחר מכן להעביר את organoids resuspended לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר ומניחים את הצינורות על קרח. לאסוף כל מצב זיהום בצינורות חרוטים 15 מיליליטר נפרדים. לאחר החלפת כפפות, לנקות את החלק החיצוני של הצינור ולהסיר את הצינור מן מכסה המנוע תרבות התא.סובב את הדגימות במשך חמש דקות. הזז את הצינור בחזרה לתוך מכסה המנוע תרבית התא ולהסיר את PBS, הימנעות resuspension של הכדור של organoid מתחתית הצינור. לאחר מכן, resuspend הכדור במיליליטר אחד של אנזים דיסוציאציה.ואז להחליף כפפות, לנקות את הצינור, ולדגירה את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה, להזיז את הצינור בחזרה לתוך מכסה המנוע תרבית התא כל 10 דקות ו respend organoids על ידי צינור למעלה ולמטה. כדי לקבוע אם האורגנוידים מנותקים לתאים בודדים, הנח 10 מיקרוליטרים של ההשעיה האורגנוידית בשקופית מונה תאי פלסטיק חד פעמית באמצעות פיפטת P10, ולאחר מכן אטמו את יציאת הקלט לדוגמה עם סרט שקוף.לאחר החלפת כפפות, נקה את החלק החיצוני של מונה התא ושימוש במיקרוסקופ ברייטפילד, ודא כי השעיית תא בודד נוצר. לאחר אישור של השעיית תא יחיד, להפסיק את העיכול על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיה DMEM F12 המכיל 10% FBS ו pipette למעלה ולמטה 10 פעמים. ואז לשנות את הכפפות, לנקות את הצינור ולסובב את המדגם.לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את המדיה המכילה את האנזים דיסוציאציה, תוך הקפדה לא להפריע לכדור התא בתחתית. לאחר מכן תקיף מחדש את התאים הבודדים באמצעי אחסון מינימלי של PBS המכיל 0.1%BSA. לאחר העברת ההשעיה של התא לתוך צינור FACS דרך מסנן כדי להסיר גושים גדולים, מניחים את הצינור על קרח.לאחר מכן, כדי לקבוע את מספר התאים לכל מיקרוליטר, להוסיף 10 microliters של השעיית התא לתא ספירת תאי פלסטיק חד פעמי. לאחר מכן אטמו את יציאת הקלט לדוגמה עם סרט ברור לפני הסרת הדגימה ממכסה המנוע של תרבית התא. החליפו כפפות, נקו את תא ספירת התאים, ואז ספרו את מספר התאים באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד.לאחר מכן, בתוך מכסה המנוע תרבית התא, להכין תערובת מאסטר של ריאגנט RT, תבנית מתג אוליגו, הפחתת סוכן B, ו RT אנזים C בצינור 1.5 מיליליטר בהתאם להוראות היצרן בהתאם למספר הדגימות בניסוי. עבור כל דגימה, aliquot 33.4 microliters של תערובת מאסטר לתוך צינור PCR, ולאחר מכן להוסיף את התאים והמים לתערובת הראשית על פי מספר תא היעד. לאחר החלפת כפפות, העבר את בקר התא הבודד למכסה המנוע של תרבית התא והכן את השבב.לאחר מכן, הוסף את שבב התא הבודד למחזיק השבב ומלא את הנתיבים שאינם בשימוש ב- 50% גליצריל. מוסיפים את התערובת הראשית, החרוזים והחלוקת השמן לנתיבים המכילים דגימות בהתאם להוראות היצרן ומכסה את השבב עם אטם. לאחר טעינת השבב לבקר, הפעל את התוכנית.עם השלמת התוכנית, להסיר את השבב ואת האטם, ולאחר מכן באמצעות pipette רב ערוצי, להעביר 100 microliters של אמולסיות לנקות צינורות PCR. ודא שלכל אמולסיה יש צבע לבן אחיד המציין שאירע אמולסיה מלאה. לאחר החלפת כפפות וניקוי הצינורות, להעביר את צינורות PCR למכונת PCR ולהתחיל את התוכנית.בסוף ריצת PCR, רוב הווירוסים עטופים יהיו מומתים. תמונות ברייטפילד הנציגות בימים אחד, שלוש, חמש ושבעה organoids לאחר פיצול מוצגים כאן. בממוצע, האורגנוידים מפוצלים פעם בשבוע כשהמרכזים נעשים חשוכים.על ידי שינוי תנאי המדיה, הסרת Wnt-3a והפחתת R-ספונדין ונוגין, ניתן לתחום את המורכבות התאית שנמצאת במעי האנושי. בדרך כלל, הבחנה תאית כלפי תאים של Paneth, תאי גביע ואנטרוציטים דורשת ארבעה ימים של מדיית בידול. ניתוח של נתוני ריצוף תאים בודדים מ- SARS-CoV-2 נגוע המעי הגס ואת organoids נגזר אילום הראה כי רק תת-אוכלוסין של תאי אפיתל המעי האנושי תמך בזיהום של SARS-CoV-2 לאחר 12 ו 24 שעות.ניתוח של תגובות חיסוניות מולדות באורגנוידים נגועים במעי הגס SARS-CoV-2 הראה כי SARS-CoV-2 גרם למפל אות פרו דלקתי בתאים נגועים בעוד שתאי עובר אורח שאינם נגועים הראו תגובה חיסונית אינטרפרון. בנוסף, רצף RNA של תא בודד הראה כי תאים נגועים לא הצליחו לחוש אינטרפרונים עקב חסימה בתיווך וירוס של המסלול. האורגנוידים חייבים להיות מובחנים ובריאים.זה יכול להיות נשלט על ידי קביעת רמת סמני בידול התא על ידי qPCR לפני זיהום. אם התאים אינם מובחנים היטב, הם לא יתמכו בזיהום ויראלי ויובילו לתוצאות לא מידע. טכניקה זו מאפשרת לנו להדביק את הרירית הן מהצד הזוהר והן מצד הרקמה.זה מאוד מפתח כפי שהוא מאפשר לנו לפענח מנגנונים המשמשים משטחים ריר לסבול סביבה מלוכלכת בצד אחד סטרילי אחד בצד השני.

adapting-gastrointestinal-organoids-for-pathogen-infection-single

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים שיטה להקמת מודל זיהום אורגנואיד קיבה על ידי הזרקה מיקרו של פתוגן קיבה הליקובקטר פילורי לתוך לומן האורגנואידים. מודל זה מסייע בחקר שינויים הנגרמים על ידי זיהום בתאי קיבה.

הקמת מודל זיהום באמצעות מיקרו-הזרקה של אורגנואידים בקיבה עם חיידקים פתוגניים

פרוטוקול זה מסביר תרבות העיקרית Lgr5-positve organoid והביצועים הבאים של התמרה retroviral. זה מאפשר ביטוי יתר או מציאה Cre-מושרה של transgene נמסר ומאפשר מחקרים פונקציונליים להתבצע ברומן בorganotypic המבחנה   מערכת מודל.

פרוטוקול וידאו של זיהום retroviral ביסודי מעיים Organoid תרבות

תרביות שמקורן בתאי גזע טומנות בחובן פוטנציאל אדיר למידול מחלות זיהומיות. כאן מתוארת תרבית של אורגנואידים בקיבה של עכברים ובני אדם שמקורם בתאי גזע בוגרים. האורגנואידים מוזרקים במיקרו עם פתוגן הקיבה הליקובקטר פילורי.

Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי

תא גזע הנגרמת על ידי האדם (היפנוסק)-המעי הנגזר אורגנואידים להציע הזדמנויות מרגש למודל בידור מחלות מבחנה. אנו להדגים את הבידול של hiPSCs לתוך מעיים אורגנואידים (iHOs), גירוי של iHOs אלה עם ציטוקינים, ואת המיקרוהזרקה של סלמונלה typhimurium לתוך לומן ihos, המאפשר לימוד של הפלישה אפיתל על ידי זה פתוגן.

באמצעות תא גזע המושרה האדם Pluriפוטנטי-המעי הנגזר אורגנואידים ללמוד ולשנות את התא אפיתל הגנה מפני סלמונלה ופתוגנים אחרים

כאן אנו מתארים טכניקה כדי לכמת את שלמות המכשול של אורגנואידים מעיים קטנים. העובדה כי השיטה מבוססת על אורגנואידים חיים מאפשר חקירה רציפה של שלמות מכשול שונים חומרים מודולים או שילובים אותם באופן שנפתר בזמן.

חקירת פירוק מחסום המעיים באורגנואידים חיים

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים המאפשרים מידול של אינטראקציות ספציפיות למעיים. מונו-שכבתי מעיים שמקורם באורגנוידים ותרבויות ממשק נוזלי אוויר (ALI) מאפשרות ליצור אפיתליה מובחנת היטב הנגישה הן מצדי הזוהר והן מצד בזולטר, בעוד שאורגנואידים מעיים הפוכים בקוטביות חושפים את הצד האפי שלהם והם נוחים לתפוקה גבוהה.

שיטות תרבות לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיקליות באמצעות מודלים אורגנויד מעיים

מחקר זה מציג פרוטוקול ליצירת חד-שכבות דו-ממדיות של מעי בקר מאורגנואידים, ומציע גישה משופרת לחקר אינטראקציות בין פונדקאי לפתוגן. הוא כולל שיטות להערכת שלמות ותפקוד הממברנה, קידום מודלים במבחנה המחקים את הפיזיולוגיה של מערכת העיכול של הבקר. גישה זו מבטיחה יתרונות ביו-רפואיים וחקלאיים משמעותיים, כולל אסטרטגיות טיפול משופרות.

התקדמות בטכנולוגיית אורגנואיד בקר באמצעות ממשקים חד-שכבתיים של מעי קטן וגדול

מחקר זה מתאר פרוטוקול ליצירת חד-שכבות דו-ממדיות של אורגנואידים חזיריים שמקורם במעי הדק והגס. הצמיחה של חד-שכבות אלו מסומנת על ידי הגדלת ערכי TEER, המעידים על שלמות אפיתל חזקה. בנוסף, חד-שכבות אלה מציגות תגובות הפרשה פיזיולוגיות בניסויי תא אוסינג לאחר יישום פורסקולין.

אורגנואידים דו-ממדיים במעי חזיר המשקפים את התכונות הפיזיולוגיות של המעיים הטבעיים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במעי אפיקליים מתרביות אורגנואידים סטנדרטיות משובצות מטריצה. הוא גם מתאר את השילוב הבא של EdU בתאים המתרבים באופן פעיל ואת הכימות האוטומטי למחצה של תאים חיוביים ל-EdU.

יצירת אורגנואידים במעי אפיקלי החוצה והערכת קצב התפשטות האורגנואידים באמצעות תיוג EdU

המחקר מציג שיטה לחקר זיהום חיידקי במבחנה באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם בתאי גזע ברקמה. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל ולהבחין בין אורגנידים בשני ממדים, להדביק אותם ב-Escherichia coli פולשנית דבקה, ולהעריך קריאות מפתח, כולל פריצת מחסום אפיתליאלי, הדמיית זיהומים ותגובת RNA אפיתליאלית.

תרבית אורגנית דו-ממדית על תמצית פולשת או ממברנת בסיס לחקר אינטראקציות בין מארח לחיידקים

חקור זיהום אורגנואידים ממערכת העיכול האנושית בנגיפים ברמה ביולוגית 3 תוך שימוש ברצף RNA תא יחיד. שיטה זו מאפשרת ניתוח תגובות חיסוניות ברמת התא הבודד ומסייעת לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

התאמת Organoids במערכת העיכול עבור זיהום פתוגן ורצף תא יחיד תחת בטיחות ביולוגית רמה 3 (BSL-3) תנאים

גלה סרטונים נוספים