Name: מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: חקור מכניקה תת-תאית ישירה בזברה דגוני באמצעות מלכודת אופטית. שיטה זו מאפשרת מדידת כוחות בגרעין התא מבלי להפריע לממברנה או לציטוסקלטון הקורטיקלי, ומסייעת להבנת תהליכי פולריזציה והתמיינות תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ח"כ מכיר בתמיכה כספית של משרד הכלכלה והתחרותיות הספרדי באמצעות התוכנית הלאומית (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), תוכנית Severo Ochoa למרכזי מצוינות במו"פ (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), מ Fundació Privada Cellex, Fundació Mir-Puig, ומ Generalitat de Catalunya באמצעות CERCA ותוכנית המחקר (2017 SGR 1012), בנוסף למימון באמצעות ERC (MechanoSystems) ו- HFSP (CDA00023/2018). V.R. מכיר בתמיכת משרד המדע והחדשנות הספרדי לשותפות EMBL, סנטרו דה אקסלנסיה סוורו אוצ'ואה, תוכנית נאסיונאל של MINECO (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) וג'נרליטט דה קטלוניה (CERCA). V.V. מודה בתמיכתה של תוכנית הדוקטורט ICFOstepstone הממומנת על ידי תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי תחת הסכם המענקים מארי Skłodowska-Curie 665884. אנו מודים לארנו פארה על הקריאה הביקורתית של כתב היד; מריה מרסל לעזרה עם הדמיה והרכבה של העובר 24 hpf; סנדרה חימנס-דלגאדו לתמיכה עם מיקרונג'ים של דגי זברה.

למחברים אין מה לחשוף.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה ייחודית לחקור את התכונות המכניות של גרעין התא בתוך התאים החיים. בשונה מטכניקות ספקטרוסקופיות כוח אחרות, השמנה אופטית לא פולשנית אפשרה לנו לנתק את תרומת קרום התא ואת הציטוסקלטון מהנוקשות הגרעינית של התא. חשוב לציין, מיקרו-מניפולציה אופטית תואמת למיקרוסקופיה רב-מודולרית, שתאפשר לנסיין לחקור תהליכים שונים המעורבים במכנוביולוגיה גרעינית של התא. כתוצאה מייצגת, השתמשנו בהכתמת DNA-Hoechst כדי למדוד את עיוות הגרעין על כניסה שבוצעה על ידי כוחות בסדר גודל של כמה מאות picoNewton.
יישומים פוטנציאליים של השיטה שלנו מעבר לדוגמאות המתוארות בפרוטוקול זה האפשרות לחלץ מידע מכני כמותי ממדידות בתוך תאים חיים ללא הפרעות חיצוניות מאפשרת שפע של הזדמנויות חסרות תקדים שרק מתחילות להיחקר. לכן, הפרוטוקול המוצג של פלטפורמת המיקרו-מניפולציה האופטית שלנו יכול להיות מורחב לניסויים מורכבים יותר עם צדדיות רבה. דפלקטורים אקוסטו-אופטיים (AOD) יכולים ליצור השמנות אופטיות מרובות למדידות כוח סינכרוניות במיקומי תאים שונים, כמו גם ניתן להשתמש בהם למיקרו-התחממות פעילה בטווח תדרים רחב51,61. כפי שהוזכר, תגובת הכוח עם הכניסה יכולה להתגבר על כוח ההשמנה המרבי, מה שמוביל לבריחה של החרוז מהמלכודת האופטית. במקרה זה, ניתן להגדיר משוב כוח עם AOD על מנת להדק את הכוח האופטי. בסך הכל, גישות מיקרו-המיקרו-הסביבתיות מרובות, כגון הרפיה בלחץ המתוארת בפרוטוקול זה, אך גם מיקרו-התחממות פעילה או תאימות לזחילה, ניתן להשיג באופן ניסיוני עם פלטפורמה זו ולנתח ביסודיות על ידי חבילות תוכנה חדשניות61,62,62,63,64,65 . יתר על כן, היישום של כוחות אינו מוגבל לגרעין אבל יכול להתבצע באופן עקרוני כדי למדוד מבנים תאיים מגוונים וברקמות מורכבות כפי שהוכח ללכידת תאי דם אדומים זורמים בתוך כלי דם שלמים66,67 או לכידה ועיוות כלורופלסטים ומיטוכונדריה68 . כיול תנופת האור אינו תלוי בצורתו ובגודלו של העצם הנלכד, ולכן מאפשר מדידות כוח ישירות על כל גשושית כוח בעלת צורה שרירותית38,39. השימוש במיקרוספירות מוזרקות אפשר לנו להפעיל כוחות גבוהים על הגרעין עם כוח לייזר נמוך יחסית בהשוואה למניפולציה ישירה של מבנים תאיים69,70,71. עם זאת, בהינתן הפרש אינדקס שבירה גבוה מספיק, אין צורך בבדיקת כוח מיושמת חיצונית וניתן לתמרן אברונים תאיים ישירות ללא חרוזים מוזרקים (תצפיות שלא פורסמו והפניה70).
שינויים פוטנציאליים בשיטה שלנו להרחבת היישומים ניתן להזריק גדלים שונים של חיידקים בהתאם לניסוי, אך יש לבצע את הבקרות היחסיות. לדוגמה, כדי ללמוד תאים בשלבים מאוחרים יותר חרוזים קטנים יותר ניתן להזריק. פעולה זו תפחית את הכוח המרבי שניתן להפעיל על ידי המלכודת האופטית (כגון מוצג בהפניה55). חרוזים גדולים יותר ניתן להזריק כדי להפעיל כוחות גבוהים יותר, אבל אלה עשויים להשפיע על התפתחות העובר בהתאם לגודלם או שלב העניין שלהם. בניסויים שבהם הזרקת חיידקים אינה אופציה, אברונים שונים המציגים הבדלי מדדי שבירה בהשוואה לזה של הציטופלסמה עדיין יכולים להיות מניפולציה אופטית, מה שמוליד כוחות אופטיים הניתנים למדידה משינויי תנופה אור42. כפי שהוזכר לעיל, שיטות אלה שימשו על ידי Bambardekar ואח 'כדי לעוות צמתים תא-תא בעובר Drosophila70. כמו כן, לגרעין התא יש אינדקס שבירה נמוך יותר מאשר ל- medium44 שמסביב, המאפשר כניסה ללא חרוזים (תצפיות שלא פורסמו והפניה72) למרות שעוצמת השמנה נמוכה יותר. לפיכך, לא ניתן ללכוד את הגרעין בקלות ונמלט מהמלכודת.
מרווח PDMS מצופה ספין מפוברק בשיטה נוחה ומהירה, אך עשוי להיות מחוץ להישג ידם של מעבדות ללא גישה למתקן מיקרו/ננו-פבריקציה או למעבדות הנדסה. לכן, spacer ניתן להרכיב בקלות מ קלטת מעבדה או parafilm (שלב 4). הפרוטוקול יכול גם להיות מותאם על ידי ייצור ערוצים microfluidic להפוך את המסירה של תאים בודדים לתוך בארות מדידה מוגדרות מראש או לתוך תא עם גובה מוגדר כדי להעריך את אפקט הכליאה בתוך אותה דגימה. עם זאת, יש לתכנן התקנים מיקרופלואידיים כאלה כך שיתאימו את הרווח בין מטרת המיקרוסקופ לעדשת האיסוף של חיישן הכוח האופטי, של כ -2 מ"מ (ראה שלב 3). שים לב כי חיישן הכוח האופטי חייב להיות ממוקם בגובה המתאים, כך שאין סטיות אופטיות מן defocusing להשפיע על מדידת מומנטום פוטון.
שינויים אחרים עשויים לכלול שינוי של כתבים ביולוגיים. מצאנו כי פלואורסצנטיות Hoechst מדממת באופן ספקטרלי לתוך ערוץ GFP ולכן אנו מעדיפים את השילוב עם histone מתויג mCherry כסמן גרעיני למדידה בו זמנית בשני ערוצים פלואורסצנטיים. לחלופין, ניתן לעקוב בקלות אחר עיוות גרעיני באמצעות תווית המיועדת לקרום הגרעיני הפנימי כגון Lap2b-GFP (איור 2).
הכניסה לגרעין התא הייתה בסדר גודל של 2-3 מיקרון, אשר אנו יכולים למדוד במדויק על ידי ניתוח תמונה של עקיפה מוגבלת ספינינג-דיסק מיקרוסקופיה קונפוקלית. במקרה של גרעינים נוקשים יותר או כוחות קטנים יותר, הכניסה תהיה בקושי ניתנת למדידה באמצעות גישה זו. עם זאת, ניתן לכייל גם את הפינצטה האופטית המכוילת בכוח המוחלטת למדידות מיקום של החרוז הלכוד במקום באמצעות אינטרפרומטריה BFP עם דיוק ננומטר51. באמצעות גישה זו, ניתן לתרגם את אות המתח ואת חיישן הכוח האופטי למיקום של הגשושית הלכודה באמצעות β פרמטר [nm/V], בעוד הפרמטר invariant α [pN/V] מניב ערכי כוח באמצעות כיול תנופת האור הנ"ל41 (ראה להלן לפרטים).
פתרון בעיות מצאנו כי האתגרים הבאים יכולים להתרחש במהלך הניסוי:
לא נוצרת מלכודת יציבה והמיקרוספירה בורחת בקלות כל לכלוך על מטרת המיקרוסקופ או צווארון תיקון לא מיושר עלול להוביל לכישלון של מלכודת יציבה. אם לא נמצא פתרון מיידי, מדוד את פונקציית התפשטות הנקודות של העדשה האובייקטיבית. אם דגימת העניין נמצאת עמוק בתוך רקמה צפופה אופטית, מוקד הלייזר עלול לחוות סטיות אופטיות חמורות המובילות ללכידה לא יציבה (אפקט זה הוא בדרך כלל זניח בתאים מבודדים אך הופך בולט יותר ברקמות עבות יותר). עבור קשיחות גבוהה, כוח השיקום של הגרעין יכול לחרוג מכוח המילוט של המלכודת, כך שהמיקרוספירה הולכת לאיבוד ושגרת הכניסה נכשלת. בתחילה, קצה הממברנה הגרעינית הפרוקסימלי למלכודת האופטית כמעט ולא נכנס פנימה (איור S2A). כאשר זה קורה, לייזר ההשמנה אינו מושפע עוד מכוח ומתנועה בראונית, מה שמוביל לירידה בכוח לאפס ולירידה ברעש האות (איור S2B). במקרה שזה קורה, כוח לייזר יכול להיות מוגבר יש מלכודת חזקה יותר, משרעת של המסלול הטרפזי דוחף את החרוז לתוך הגרעין ניתן להפחית, או המיקום הראשוני של המיקרואורגניזם הלכוד ניתן להגדיר רחוק יותר את הגרעין.
התא נע במהלך הגירוי אם התאים אינם מחוברים מספיק, השמנת ההשמנה ההדרגתית האופטית תזיז את התאים בעת ביצוע שגרת הכניסה התאית, כך שהכוחות והמכניקה הבסיסית של הגרעין הם אובייקטים. כדי למנוע תזוזה של התא כולו, אנו ממליצים להגדיל את הריכוז של מולקולות הידבקות תאים על פני השטח, למשל, ConA.
פיצוי מומנטום ראשוני אם שגרת פיצוי מומנטום ראשונית אינה זמינה בפלטפורמת ה- OTs (שלב 6.5), יש לתקן אות בסיסי מלאכותי ובלתי תלוי בכוח. זה נראה כשיפוע בעקומת הכוח גם ללא חרוז לכוד (איור S1E). כדי לבצע את התיקון, אותו מסלול צריך להתבצע ללא חרוז, מחוץ לתא בדיוק באותה תנוחה. לשם כך, הרחק את התא מההשמנה באמצעות פקד הבמה. כהפניה, היסט הכוח משתנה 5 pN על פני FOV ב 200 mW במערכת שלנו; לפיכך, הוא הופך להיות זניח עבור מסלולים קצרים. לחלופין, ניתן להשתמש בשלב סריקת פיזו כדי להזיז את התאים על המדגם, משאיר את מיקום הלייזר קבוע.
שלבים קריטיים של הפרוטוקול המוצג יש להזריק מיקרוספירות בשלב הימני של תא אחד כדי להבטיח חלוקה מקסימלית על העובר. חרוזים לא צריכים להיות פלואורסצנטיים כך שאין דליפת אור לתוך ערוצי פלורסנט המשמשים להדמיה. לדוגמה, אפילו חרוזים אדומים-פלואורסצנטיים טיפוסיים נראים בבירור בערוץ הכחול המשמש להדמיית גרעין התא לאחר הכתמת Hoechst בשל הבהירות שלהם (עירור: 405 ננומטר; פליטה: 445 ננומטר). התקשרות יציבה של התא למצע היא קריטית כדי למנוע תזוזה לרוחב במהלך שגרת הכניסה. אם התא נע במהלך השגרה, לא מעריכים את הכוחות. במקרה שהדבר יקרה לעתים קרובות, מטב את פרוטוקול הקובץ המצורף. עבור תאי תרבית רקמות, חלבוני הידבקות תאים אחרים, כגון פיברונקטין, קולגן או פולי-L-ליזין מובילים לחיבור משביע רצון (תצפיות שלא פורסמו). במהלך הכליאה, תאים נתונים ללחץ מכני פתאומי וחמור. זה יכול לגרום נזק לתאים ולעתים קרובות הנסיין ייתקל תאים מפוצצים אם ההליך לא מתבצע בזהירות. כמו כן, אם גובה הכליאה קטן מדי, כל התאים יסבלו משבירת עוטף גרעינית או נזק בלתי הפיך. כדי למתן את אלה, הנמך את כיסוי הכיסוי העליון לאט יותר ו/או הגדל את המרווח בין כיסוי הכיסוי.
מגבלות הטכניקה והצעות להתגבר עליהם מגבלה ברורה של הטכניקה היא חדירת אור הלייזר לחלקים עמוקים של הרקמה, מה שמוביל לסטיות וללכידה לא יציבה. לכן, גבול נמוך יותר של עומק החדירה תלוי בבהירות המדגם, תיקון הסטייה שניתן להשתמש בו73 וכוח הלייזר המיושם. יש לקחת בחשבון כי כוח לייזר גבוה יותר מוביל עירור תרמי של המדגם בקרבת המיקרוספירה. עם זאת, חימום המדגם שמקורו בנקודה לייזר באורך גל 1064 ננומטר ממוזער כדי למנוע מתח הקשור לחום מתקבל על הדעת על הדגימות הביולוגיות שלנו74.
מגבלה נוספת היא הכוח המרבי שניתן למדוד. למרות שגילוי ישיר של תנופת אור מאפשר מדידות כוח הרבה מעבר למשטר התגובה הליניארית של המלכודת האופטית40,41, הכוח המיושם המרבי הוא בסדר גודל של כמה מאות picoNewtons. זה מוגבל על ידי כוח לייזר ואת סף הנזק כתוצאה מכך של חומר ביולוגי רך ואת ההבדלים אינדקס שבירה, אשר בדרך כלל אינם גדולים יותר מ 0.1 או 0.344. מספר שיטות הוצעו כדי להגדיל את מגבלת זיהוי הכוח, למשל, באמצעות אור מובנה75, מיקרוספרות מצופות אנטי רפלקטיבי76, חלקיקי אינדקס שבירה גבוהה77 או נקודות קוונטיות מסוממות מאוד78.
OTs יכול לשמש מדידות מיקום בקנה מידה ננומטרי באמצעות אינטרפרומטריה BFP, כך המיקום של החרוז בתוך המלכודת הוא Δx = β Sx, שבו Sx הוא אות המתח של החיישן, וניתן לכייל β [μm/V] תוך כדי תנועה בעקבות פרוטוקולים שונים35,54. עבור חיישן כוח אופטי, ניתן להוכיח כי גורם ההמרה invariant מתח לכוח α [pN /V] מתייחס ישירות β ואת נוקשות המלכודת, k [pN / μm], באמצעות α = kβ 37) בניסויים עם עקירות חרוזים כי הם קטנים מדי כדי להיות מזוהה מן הדמיה אופטית, אסטרטגיה זו יכולה לשמש כדי להשלים מדידות כוח עם זיהוי מיקום קטן. דוגמה לכך היא יישום השגרה הניסיונית המוצגת כאן על גרעינים נוקשים מאוד, אשר כוחות בכוחות לייזר סבירים (200-500 mW) אינם מספיקים כדי לגרום לערכי כניסה גדולים מספיק. במקרה זה, יש להביא את החרוז במגע עם הגרעין ויש לכייל את נוקשות הלכידה לפני המדידה (שלב 8.6). הכניסה d של הגרעין כפונקציה של כוח ניתן לקבוע בעקיפין כמו:
d = xtrap - F/k
כאשר xtrap הוא מיקום המלכודת. בשונה מגורם אור-מומנטום invariant α [pN/V], גורם β [μm/V] צריך להיות מכויל לפני כל ניסוי שכן הוא תלוי משתנים מקומיים רבים הקובעים את דינמיקת ההשמנה, כגון גודל החלקיקים, גודל ספוט מלכודת אופטית, ומדדי שבירה יחסית.

מורפוגנזה של רקמות הוא תהליך מורכב שבו אותות ביוכימיים וכוחות פיזיים מתואמים באופן מרחבי. בעובר המתפתח, שיפועים של גורמי איתות ביוכימיים מכתיבים את מפרט הגורל ומבטיחים דפוסי רקמות נכונים 1,2. יחד עם זאת, כוחות פנימיים וחיצוניים ממלאים תפקיד בבניית הארכיטקטורה של העובר3,4. ההשפעה של מכניקת קליפת המוח התאית בהקשר זה נחקרה בהרחבה 5,6. החיבור ההדוק בין תהליכים מכניים-כימיים במהלך מורפוגנזה מסתמך על המאפיינים של תאים בודדים לחוש ולהגיב לכוחות מכניים במיקרו-סביבה של הרקמה שלהם. תאים, ובכך לפענח אותות מכניים באמצעות נוכחות של אלמנטים תת-תאיים ומולקולריים רגישים לכוח המעבירים מידע מכני למסלולי איתות ספציפיים השולטים בהתנהגות התאים, בגורל התא ובמכניקת התאים.
סימן ההיכר של תהליכים התפתחותיים הוא שתאים מתארגנים כקבוצות לבניית מבנים רב-תאיים. ככזה, תאים בודדים לעתים רחוקות לסדר מחדש ולנוע לבד אבל קשורים סוציוטופה הדוקה שבו הם מראים התנהגות קולקטיבית כגון הגירה על-תאית7, (un)שיבוש מעברים8,9 או דחיסת blastocyst10. כוחות מכניים הנוצרים בתוך ובין התאים משמשים כרמזים חשובים להנחיית דינמיקת תאים קולקטיבית7,11. אבל גם כאשר תאים נעים לבד, כגון תאים אבהיים שסוחטים את דרכם בין יריעות רקמות או נישות רקמות צרות, הם חווים כוחות מכניים אניסוטרופיים נרחבים בעת ניווט בסביבה תלת ממדית. ללחצים מכניים אלה על תאים יש השלכות עמוקות על התנהגות התאים12,13. מספר מנגנונים נחקרו המתכנסים על הגרעין כאלמנט mechanotransduction העיקרי14,15, כאלמנט מכני פסיבי או פעיל במהלך הנדידה בתוך סביבת רקמה תלת-ממדית צפופה15,16.
לאחרונה הצענו מנגנון שמצייד תאים למדידת עיוותי צורה באמצעות הגרעין כמכנו-מד תאי אלסטי12. הגרעין, בהיותו האברונית הגדולה ביותר בתא, עובר עיוותים גדולים כאשר תאים מקוטבים, נודדים או משנים את צורתם תחת מתיחה מכנית, כליאה או מתח אוסמוטי16,17,18,19. מצאנו כי מעטפה גרעינית למתוח יחד עם המיקום התאי של הגרעין מספק תאים עם מידע על סדר הגודל וסוג של עיוות התא (כגון דחיסת תאים לעומת נפיחות תאים). מתיחה של הגרעין קשורה להתפתחות של הממברנה הגרעינית הפנימית (INM), אשר מקדם cPLA2 תלוי סידן (פוספוליפאז A2) פעילות ליפאז ב- INM ואחריו שחרור של חומצה ארכידונית (AA) והפעלה מהירה של מיוזין II בקליפת התא. זה מוביל להתכווצות תאים מוגברת ונדידת תאים אמבואואידית מעל סף של התכווצות קליפת המוח6. התגובה המכנית לעיוות התא מתרחשת תוך פחות מדקה והיא הפיכה עם שחרור הכליאה, דבר המצביע על כך שהגרעין פועל כמד מאמץ עבור פרופריוספציה תאית המסדירה את התנהגות התא האדפטיבית בתנאי לחץ מכניים. מסלול מכני זה מוצג כפעיל בתאי גזע של אבות המופקים מעוברי דגי זברה, הן בתאים פלוריפוטנטיים והן בתאים מחויבים לשושלת שושלת12 והוא נשמר במינים שונים ובקווי תאים20.
בנוסף למאפיינים הגרעיניים כמכנוזנסור תאים, ארכיטקטורה גרעינית ומכניקה מוסדרות באופן מהותי במהלך הפיתוח ובתגובה למפרט גורל התא21, ומכאן כוונון רגישות המכנית התאית22,23. התוצאה עשויה להיות שינוי בציות הגרעיני המאפשר שינויים מורפולוגיים ומעברים מקדם-כבידה למצב נודד ולהיפך8.
מספר טכניקות למדידת מכניקת גרעין התא יושמו, כגון מיקרוסקופיה של כוח אטומי24,25, שאיפה מיקרופיפט26,27, טכנולוגיה מיקרופלואידית28 ומיקרונידלס29. עם זאת, רבות מהטכניקות הללו פולשניות במובן זה שיש לעוות את התא כולו, מה שמגביל את מדידת המאפיינים המכניים ואת התגובות התלויות בכוח של הגרעין עצמו. כדי לעקוף את העיוות בו זמנית של פני השטח של התא וקליפת המוח המכנית שלו30, גרעינים מבודדים נחקרו בהקשרים שונים31,32. עם זאת, לא ניתן לשלול כי בידוד גרעיני קשור לשינוי במאפייני הגרעין המכני וברגולציה שלהם (התייחסות24 ותצפיות שלא פורסמו).
פינצטה אופטית (OTs) היא טכנולוגיה רב-תכליתית שאפשרה שפע של ניסויים במכנוביולוגיה של תאים והיוו אינסטרומנטלי בהבנתנו כיצד מכונות מולקולריות ממירות כימיקלים לאנרגיה מכנית33,34. פינצטה אופטית משתמשת בקרן לייזר ממוקדת היטב כדי להפעיל כוחות אופטיים על חלקיקים דיאלקטריים בעלי אינדקס שבירה גבוה יותר מהמדיום הסובב. כוחות כאלה יכולים להיות בסדר גודל של מאות פיקו-ניוטון ולגרום לכליאה יעילה של החלקיק בתוך מוקד מלכודת הלייזר, המאפשר מניפולציה של החלקיק הלכוד בשלושה ממדים. לשימוש באור יש יתרון חשוב בכך שניתן לבצע את המדידה באופן לא פולשני בתוך תאים חיים. מניפולציות אופטיות מוגבלות עוד יותר למיקוד המלכודת של קרן הלייזר. לפיכך, המניפולציה יכולה להתבצע מבלי לעורר את הממברנות התאיות שמסביב ואינה מטרידה את קליפת המוח האקטין או תהליכים mechanosensitive בקרום הפלזמה, כגון הפעלה תלוית כוח של תעלות יונים.
הקושי של גישת הפינצטה האופטית הוא לקבוע במדויק את הכוחות המוחלים על המיקרוספירה באמצעות גישות קלאסיות המסתמכות על כיול כוח עקיף המבוסס על משפט השווי-חלקיקים או על שימוש בכוחות סטוקס-גרירה מוגדרים כדי למדוד כוח בריחה תלוי כוח לייזר35. בעוד ששיטות אלה פשוטות ליישום בניסוי במבחנה, בדרך כלל לא ניתן לתרגם אותן לסביבה תאית. מספר אסטרטגיות הוכנסו לשטח המסתמכות על כיול כוח ישיר, הנגזר מהעקרונות הראשונים של שימור המומנטום36,37. שלא כמו גישות ספקטרוסקופיות כוח אחרות, מדידות כוח מושרות מחילופי אור מקומיים עם החלקיק הלכוד בעל הצורה השרירותית 38,39. במערך הניסיוני שלנו, שינויים בתנופת האור הנובעים מכוחות אופטיים נמדדים ישירות ללא צורך בכיול מלכודת מיקום40,41,42,42,43. לכן, המדידות הופכות לאפשריות בסביבה צמיגה כגון פנים התא או אפילו בתוך רקמה, וכוחות ניתן לכמת בקלות עד לרמת pN.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים בדיקה לתפעל באופן מכני אברונים או מבנים תאיים ולהעריך כמותית את המאפיינים המכניים שלהם על ידי הגדרת פינצטה אופטית. הגדרה זו משולבת במיקרוסקופ פלואורסצנטי של דיסק מסתובב המאפשר הדמיה מקבילה של התנהגות תאית או דינמיקה תאית. הבדיקה מאפשרת אפיון של המאפיינים המכניים של תאים תאיים ספציפיים, כגון הגרעין, ובו זמנית ללמוד את mechanoresponse אפשרי והפעלה של מסלולי איתות מולקולרי כתוצאה מהעיוות עצמו. יתר על כן, השמנה אופטית של מיקרואורגניזמים מוזרקים בתוך התאים מאפשרת עלייה בכוח הכניסה הודות לאינדקס שבירה גבוה בהרבה של חרוז הפוליסטירן (n = 1.59) בהשוואה לשבירה הפנימית 44 של הגרעין (n ~ 1.35) לעומת ציטופלסמה (n ~ 1.38). ניתן להתאים בקלות את האסטרטגיה המוצגת לחקר מבנים ואברונים תאיים אחרים, כמו גם לגישות אחרות הכרוכות במיקרו-ולוגיה פעילה, שימוש במלכודות אופטיות מרובות כדי לחקור את אותם מבנים תת-תאיים שונים בו זמנית, ומדידות המתמקדות במכנוביולוגיה של תאים בעובר החי.

<table><tbody><tr><td>#1.5 משקפי כיסוי 22 מ"מ</td><td>טד פלה</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 22x60 מ"מ משקפי כיסוי</td><td>טד פלה</td><td>260152</td><td></td></tr><tr><td>#1.5H כלי תחתית זכוכית</td><td>Willco</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי 10 אום</td><td>Supelco</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית 1 מ"מ</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>30-0020 GC100F-15</td><td></td></tr><tr><td>פוליסטירן 1-um מיקרו-חרוזים</td><td>Sigma</td><td>89904</td><td></td></tr><tr><td>1-um חרוזי פלורסנט אדומים</td><td>ThermoFisher</td><td>F8816</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>מצלמות עזר sCMOS</td><td>Andor</td><td>Sona-4BV11-UNI</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת עזר (איור 3, AUX)</td><td>Blackfly, FLIR</td><td>BFS-U3-200S6M-C</td><td></td></tr><tr><td>Calbryte 520</td><td>AAT Bioquest</td><td>520 AM</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5453000011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D2906</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>סקוטש כפול</td><td>Biesse Adesivi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td>5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 מ"מ MgSO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>GPI-GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2A-mCh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לרכישת תמונות</td><td>Fusion-Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil</td><td>Cargille</td><td>Type B: 16484</td><td></td></tr><tr><td>גוגל</td> <td>הגנת IRThorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>Lap2b-eGFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו מעמיס פיפטה</td><td>Eppendorf</td><td>GELoader</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>MicroManager 2.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromiter slide</td><td>ID5243 GXMGRAT-5 5 מ"מ/100 חלוקות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>סיגמא</td><td>M3616</td><td></td></tr><tr><td>שלב ממונע</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חולץ מחט</td><td>Sutter instrument Co.</td><td>דגם P-97</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת פינצטה אופטית</td><td>Impetux Optics</td><td>Sensocell</td><td></td></tr><tr><td>OTs software (LightAce)</td><td>Impetux Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Curing Agent</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Post processing software (Matlab)</td> <td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAse free water</td><td>Thermofisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>מראה דיכרואית קצרת מעבר (איור 3, IR-F)</td><td>Semrock</td><td>FF01-950/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>ספין-ציפוי</td><td>מערכות ציפוי מיוחדות</td><td>Spincoat G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב</td><td>Andor</td><td>DragonFly 502</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica M80</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תבנית מיקרו-הזרקה משולשת</td><td>כלי מדע אדפטיביים</td><td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>תנור אוניברסלי</td><td>Memmert</td><td>UNB 200</td><td></td></tr><tr><td>מטרת טבילה במים</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

במהלך התפתחותו של אורגניזם רב תאי, תא מופרית יחיד מתחלק ומוליד רקמות מרובות עם פונקציות מגוונות. מורפוגנזה רקמות הולך ביד עם שינויים מולקולריים ומבניים ברמת התא הבודד שתוצאתם וריאציות של תכונות מכניות תת תאיות. כתוצאה מכך, אפילו בתוך אותו תא, אברונים ותאים שונים להתנגד באופן שונה לחצים מכניים; ומסלולי mechanotransduction יכול לווסת באופן פעיל את המאפיינים המכניים שלהם. היכולת של תא להסתגל למיקרו-סביבה של נישה הרקמה ולכן נובעת בחלקה מהיכולת לחוש ולהגיב ללחצים מכניים. לאחרונה הצענו פרדיגמת מינוזנסציה חדשה שבה עיוות ומיקום גרעיניים מאפשרים לתא לאמוד את הסביבה התלת-ממדית הפיזית ומעניקים לתא תחושה של פרופריוספציה כדי לפענח שינויים בצורת התא. במאמר זה אנו מתארים שיטה חדשה למדידת הכוחות ומאפייני החומר המעצבים את גרעין התא בתוך תאים חיים, המודגמים על תאים דבקים ותאים מוגבלים מכנית. המדידות יכולות להתבצע באופן לא פולשני עם מלכודות אופטיות בתוך תאים, והכוחות נגישים ישירות באמצעות זיהוי ללא כיול של תנופת אור. זה מאפשר למדוד את המכניקה של הגרעין באופן עצמאי מן העיוותים פני התא ומאפשר ניתוח של נתיבי mechanotransduction exteroceptive ו interoceptive. חשוב לציין, ניתן לשלב את ניסוי ההשמנה עם מיקרוסקופיה אופטית כדי לחקור את התגובה התאית ואת הדינמיקה התת-תאית באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות של הציטוסקלטון, יוני הסידן או המורפולוגיה הגרעינית. השיטה המוצגת היא פשוטה ליישום, תואמת פתרונות מסחריים למדידות כוח, וניתן להרחיב אותה בקלות כדי לחקור את המכניקה של תאים תת-תאיים אחרים, למשל, מיטוכונדריה, סיבי מתח ואנדוזומים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את התכונות המכניות התאיות של תאי זברה עובריים מבודדים בכליאה תלת מימדית עם מדידת כוח ישירה על ידי מלכודת אופטית.

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

פרוטוקול זה מנתח את התכונות המכניות האינדיבידואליות של גרעין התא שהופכות אותו למד מכני לקיטוב תאים, בידול ונדידה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה למדוד תכונות מכניות ולהחיל כוחות על תאים תת-תאיים ללא הפרעה חיצונית של הממברנה או ציטוסקלטון קליפת המוח. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות לתפעל חרוזים בתוך תאים אחרים של אורגניזם אחר על מנת ללמוד מכניקה גרעינית בשורות תאים שונים או מודלים בעלי חיים.יישור חיישן הכוח הישיר הוא קריטי כדי ללכוד את כל האור יוצר ומשאיר את המלכודות האופטיות. זה יבטיח מדידות מומנטום אור מדויקות במדיום ויסקולסטי של תא. התחל את ההכנה של תא יחיד על ידי הצבת העוברים שלב הכדור ארבע שעות לאחר ההפריה בצלחת זכוכית המכילה מדיה E3 באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק.לאחר מכן בחר את העוברים כי הם חיוביים לחרוזים ולבטא את החלבון פלואורסצנטי במקרה של הזרקת mRNA. השתמש מלקחיים כדי decurionate באופן ידני את העוברים ולהעביר כ 10 עד 15 עוברים decurionated למיכל תגובה 1.5 מיליליטר בעזרת פיפטה פסטר זכוכית. הסר את מדיית E3 מהצינור והוסף 500 מיקרוליטרים של מדיום תרבית רקמות בלתי תלויה פחמן דו חמצני שחומם מראש.לנער בעדינות את הצינור הימנעות היווצרות בועות ולהבטיח כי התוכן של הצינור להיות עכור כמו התאים להתנתק ללא נתחים גדולים גלויים על ידי העין. ואז צנטריפוגה הצינור ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant ולאסוף את הכדור כדי להמשיך עם כתמי תאים.כדי לתייג את הגרעין, resuspend התאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של תמיסת כתמי צבע ה-DNA שהוכנה זה עתה הוכשט לצינור. לדגור על התאים המוכתמים במשך שבע דקות בחושך. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים כפי שתואר קודם לכן resuspend את הכדור ב 50 מיקרוליטרים של DMEM עבור דגימות בהשעיה או 20 מיקרוליטרים של DMEM עבור תאים בכליאה.להכנת ההשמנה האופטית או תא OT לניסויים עם התאים בהשעיה, לחתוך חתיכת נייר דבק דו צדדי עם כ 10 מילימטר על 10 מילימטר חור מרובע במרכז. מקלפים את אחת משכבות ההגנה של הסרט ומניחים את הצד החשוף של הסרט במרכז צלחת תחתונה מזכוכית מספר 1.5 H. לחץ על הקלטת בעדינות כדי לקבל את כל פני השטח של הקלטת לדבוק זכוכית תוך הימנעות בועות אוויר לקלף את שכבת המגן הנותרת של הקלטת.דגירה על פני השטח עם 100 מיקרוליטרים של Concanavalin A ב 0.5 מיליגרם למיליליטר במשך 30 דקות. לאחר מכן להסיר את הירידה של Concanavalin A ולשטוף את פני השטח עם DMEM. הוסף 30 מיקרוליטרים של הפתרון המכיל את התאים על פני השטח של החלל.לאחר מכן סגור את התא בעדינות רבה עם זכוכית כיסוי 22 על 22 מילימטר. יש להשתמש באזמל או במלקחיים במידת הצורך. לאחר מכן, המשך לאתחול פינצטה אופטית על ידי הפעלת הלייזר בהספק גבוה במידה ניכרת למשך 30 דקות לפחות לפני הניסוי כדי לייעל את יציבות כוח היציאה.בסיום, הפעל את מודול האלקטרוניקה של מניפולציית מיקרו אופטי ויחידות מדידת כוח. לפני יישור חיישן הכוח האופטי, לשים טיפת מים על המטרה 60X 1.2 טבילת מים ולהניח את התא המכיל את התאים על הבמה. התמקד על פני השטח התחתונים של התא שבו דגימות התא יוצבו.לאחר הוספת טיפה של שמן טבילה על גבי שקופית זכוכית הכיסוי המכסה את המדגם, להוריד את העדשה איסוף של יחידת חיישן הכוח עד שהוא מגע עם טיפת השמן. בעקבות ההליך הסטנדרטי ליישור חיישן הכוח האופטי, עיין בתמונת המישור לדוגמה במצלמת העזר שתשמש למיקום ה- OTs, ולאחר מכן הנמך את חיישן הכוח האופטי עד לעצירת השדה שלו מופיעה מחוברת למישור הדגימה. כדי לבדוק אם קיימות בועות אוויר עם עדשת ברטרנד, שימו לב לנתיב ההדמיה דרך מצלמת העזר.אם ניתן לראות לכלוך או בועות אוויר, נקו את העדשה והתא ברקמת עדשה נטולת אבק לפני החזרה על ההליך כמתואר, והוסיפו שמן טבילה נוסף. באמצעות הברגים לרוחב המונחים על המחזיק של חיישן הכוח האופטי, מרכז את עצירת השדה לשדה הראייה. ליתר דיוק, פתח את תחנת השדה כמעט כדי לכבוש את שדה הראייה הנראה במצלמת העזר.לאחר הצבת המדגם במיקרוסקופ ויישור חיישן הכוח האופטי, השתמש בלוח חצי הגל המסתובב כדי להגדיר את כוח המלכודת הראשוני ל-200 מילי-וואט אם הנוקשות של הגרעין או המבנה הבין-תאי הנחקר אינם ידועים. לאחר שתסיים, השתמש בבקר התוכנה של שלב המיקרוסקופ כדי לחפש תא עם חרוז אחד או שניים באמצעות מיקרוסקופיה משודרת של ברייטפילד. בגיליון המספרי, כתוב את ההעתק ואת השעה של כל שלב מסלול עוקב.לחלופין, טען את הטבלה S1 מהחומר המשלים. לניסוי מתח/הרפיה, תכנתו את העומסים הטרפזיים שיש ליישם. בתוכנת OT, הפעל את המלכודות האופטיות.ללכידת מיקרוספירה, הגדר את מישורי התמונה מעט מעל החרוזים באמצעות בקר תוכנה של במת מיקרוסקופ. לחץ על microbead פוליסטירן בחלון הדמיה מצלמת עזר מכויל. כליאה מוצלחת של החרוז על ידי המלכודת האופטית תפחית מאוד את תנועת החרוז.לחץ וגרור את החרוז על פני הציטופלסמה ומקם אותו במרחק של כשני מיקרון מהמעטפה הגרעינית. ודא שהמסלול מוגדר כך שכניסת החרוזים תהיה מאונכת לקרום הגרעיני. כאשר ההתקנה מוכנה, עבור אל תוכנת ההדמיה ולחץ על לחצן הרכישה כדי להתחיל ברכישת תמונה.פתח את חלון הקריאה בזמן אמת, לחץ על נתונים ושמור בחלון הקריאה בזמן אמת כדי לשמור. התחל מיקום השמנה וכפה נתוני מדידה. הפעל את המסלול שנטען בעבר על ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על החרוז ובחירת מסלול התחלה.המתן עד לסיום המסלול והמערכת תתייצב לפני שתסיים את ההקלטה של נתוני מדידת כוח המלכודת. הפסק רכישת תמונות והתווה את התוצאות בתוכנה שלאחר העיבוד. בניתוח הייצוגי, מוצג תא גזע מבודד של דגי זברה עם מיקרוספירה אחת קרוב לגרעין.הפצת מיקרוספירה פוליסטירן חמש שעות לאחר ההזרקה בתוך עובר היה במעקב. תמונת ברייטפילד ופלואורסצנטיות מראה שהחרוזים מפוזרים על פני רקמת העובר. הקרנה מקסימלית של מחסנית Z פלואורסצנטית קונפוקלית והקרנה מקסימלית של תת-מחסנית באותו אזור מאשרת כי חלק גדול של תאים עמוקים הכיל חרוז אחד עד שניים.ב 24 שעות לאחר ההפריה, החרוזים חולקו על פני כל הגוף של העובר. המיקרוגרפים של ברייטפילד של תאי ההשעיה בתאים הסגורים עם חרוז אחד או שניים מוזרקים הושגו. יתר על כן, תוויות פלואורסצנטיות מרובות הקלו על חקירת היבטים שונים של התאים, כגון ממברנה פנימית, קרום פלזמה, DNA וקו מהונדס.תמונות מייצגות תיארו גרעינים עם תווית הוכשט חמש שניות לפני / במהלך וחמש שניות לאחר הכניסה עם מיקרוספירה לכודה אופטית. פרופילי עוצמה לאורך קטע הכניסה לשלוש מסגרות ומסלולים שונים של הגבולות הדיסטליים והפרקסימליים של הגרעין במהלך ניסוי כניסה של תאים מושעים ומוגבלים נחקרו. מסלול לכוד וכוח שחווה המיקרוספירה הלכודה אופטית במהלך ניסוי חריץ גרעיני חוזר ונשנה נמדדו.מכניקת הגרעין בתאים בהשעיה ותחת כליאה אישרה כי הכליאה הביאה להרחבת האזור הצפוי ולשינוי לא משמעותי בנוקשות הגרעינית. אם חרוזים מוזרקים לתוך העובר שלב תא אחד, הם ככל הנראה להפיץ באופן שווה בשלבים מאוחרים יותר. זכור כי החרוז חייב להיות לכוד ביציבות.אם החרוז בורח מהמלכודת האופטית, הגדר מחדש את המסלול או להגביר את כוח הלייזר. ניסויים אלה יכולים להתבצע בקלות על מיקרואורגניזמים מרובים בתוך תא אחד ולהרחיב למדידות מיקרו-התחממות פעילות.

direct-force-measurements-subcellular-mechanics-confinement-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

במאמר זה נתאר את השימוש פינצטה מגנטיים ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis האנזימטית ברמה של מולקולה בודדת באופן parallelizable ביותר.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה למדידת נוקשות תא. העיקרון הכללי של גישה זו הוא למדוד עיוות קרום בתגובה ללחץ שלילי מוגדר היטב ליישם באמצעות micropipette על פני התא. שיטה זו מספקת כלי רב עצמה כדי לחקור את התכונות של תאי מצע biomechanical-מצורפים.

שאיפת micropipette של תאי מצע מצורפים להערכת נוקשות סלולריות

מדדנו את שחרור המתח באקסון שlesioned באופן חלקי עם מבתר לייזר על ידי מדידת ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית מבוצעת על בדיקה אופטית-לכודה דבקה הממברנה של האקסון. פרוטוקול הניסוי פיתחה מעריך את האקסון ההידבקות למצע התרבות.

מדידה לשחרר מתח בנגע לייזר מושרה אקסון להעריך הידבקות axonal למצע בpiconewton והאלפית השני רזולוציה

אנו מציגים כיוונון של מלקחיים אופטיים מצמידים מיקרוסקופ אור גיליון, ואת יישומו כדי לחקור מכניקה תא בלי חרוזים ב העובר דרוזופילה .

בודק את התא מכניקה עם מלקחיים אופטיים ללא חרוז בתוך העובר דרוזופילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בו זמנית של פורסטר תהודה אנרגיה מבוססת על העברת מתח חיישנים שימדדו עומס חלבון ושחזור פלורסצנטיות לאחר photobleaching למדוד דינמיקה חלבון המאפשר מדידת כוח רגיש דינמיקה חלבונים בתאים חיים.

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

מוצג כאן פרוטוקול מקיף לביצוע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים, שניתן להרחיב בקלות לחקר סוגים אחרים של מנועים תהליכיים. הפרוטוקול מפרט את כל השלבים הדרושים, החל מהקמת מנגנון הניסוי ועד להכנת הדגימה, רכישת הנתונים וניתוחם.

ניתוח תכונות מכנואנזימטיות של מיוסינים תהליכיים באמצעות ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהירה במיוחד

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה ניסיונית מלאה לחקר אינטראקציות חלבון RNA באמצעות פינצטה אופטית. מספר הגדרות ניסיוניות אפשריות מתארות כולל שילוב של פינצטה אופטית עם מיקרוסקופיה קונפוקלית.

פינצטה אופטית לחקר אינטראקציות בין RNA לחלבון בוויסות התרגום

היווצרות של צרורות actomyosin במבחנה ומדידת ייצור כוח אנסמבל מיוזין באמצעות פינצטה אופטית מוצג ונדון.

חקר מכניקת אנסמבל מיוזין בצרורות נימה של אקטין באמצעות פינצטה אופטית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשחזור צרורות מיקרוטובולים במבחנה וכימות ישיר של הכוחות המופעלים בתוכם באמצעות השמנה אופטית סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. בדיקה זו מאפשרת מדידה ברמה ננומטרית של הכוחות והתזוזות הנוצרים על ידי הרכבי חלבונים בתוך רשתות מיקרוטובולים פעילות.

מדידה ישירה של כוחות בתוך צרורות מיקרוטובולים פעילים משוחזרים

ביוכימיה חזותית של מולקולה בודדת הנחקרת באמצעות תאים מיקרופלואידיים מקלה מאוד באמצעות קנה זכוכית, מזרקים אטומים לגז, חיבורים יציבים של צינורות לתאי זרימה, וחיסול בועות על ידי הצבת שסתומי מיתוג בין המזרקים והצינורות. הפרוטוקול מתאר מלכודות אופטיות כפולות המאפשרות הדמיה של עסקאות דנ"א ואינטראקציות בין-מולקולריות.

שימוש בפינצטה אופטית כפולה ומיקרופלואידיקה למחקרי מולקולות בודדות

במאמר זה אנו מתארים מערך פינצטה מגנטית במהירות גבוהה המבצע מדידות ננו-מכניות על ביומולקולות רגישות לכוח בקצב מרבי של 1.2 קילוהרץ. אנו מציגים את היישום שלה על סיכות ראש DNA וקומפלקסים SNARE כמערכות מודל, אבל זה יהיה ישים גם על מולקולות אחרות המעורבות באירועים מכנוביולוגיים.

פינצטה מגנטית במהירות גבוהה למדידות ננומכניות על אלמנטים רגישים לכוח

חקור מכניקה תת-תאית ישירה בזברה דגוני באמצעות מלכודת אופטית. שיטה זו מאפשרת מדידת כוחות בגרעין התא מבלי להפריע לממברנה או לציטוסקלטון הקורטיקלי, ומסייעת להבנת תהליכי פולריזציה והתמיינות תאית.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

גלה סרטונים נוספים