מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

פרוטוקול זה מנתח את התכונות המכניות האינדיבידואליות של גרעין התא שהופכות אותו למד מכני לקיטוב תאים, בידול ונדידה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה למדוד תכונות מכניות ולהחיל כוחות על תאים תת-תאיים ללא הפרעה חיצונית של הממברנה או ציטוסקלטון קליפת המוח. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות לתפעל חרוזים בתוך תאים אחרים של אורגניזם אחר על מנת ללמוד מכניקה גרעינית בשורות תאים שונים או מודלים בעלי חיים.

יישור חיישן הכוח הישיר הוא קריטי כדי ללכוד את כל האור יוצר ומשאיר את המלכודות האופטיות. זה יבטיח מדידות מומנטום אור מדויקות במדיום ויסקולסטי של תא. התחל את ההכנה של תא יחיד על ידי הצבת העוברים שלב הכדור ארבע שעות לאחר ההפריה בצלחת זכוכית המכילה מדיה E3 באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק.

לאחר מכן בחר את העוברים כי הם חיוביים לחרוזים ולבטא את החלבון פלואורסצנטי במקרה של הזרקת mRNA. השתמש מלקחיים כדי decurionate באופן ידני את העוברים ולהעביר כ 10 עד 15 עוברים decurionated למיכל תגובה 1.5 מיליליטר בעזרת פיפטה פסטר זכוכית. הסר את מדיית E3 מהצינור והוסף 500 מיקרוליטרים של מדיום תרבית רקמות בלתי תלויה פחמן דו חמצני שחומם מראש.

לנער בעדינות את הצינור הימנעות היווצרות בועות ולהבטיח כי התוכן של הצינור להיות עכור כמו התאים להתנתק ללא נתחים גדולים גלויים על ידי העין. ואז צנטריפוגה הצינור ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant ולאסוף את הכדור כדי להמשיך עם כתמי תאים.

כדי לתייג את הגרעין, resuspend התאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של תמיסת כתמי צבע ה-DNA שהוכנה זה עתה הוכשט לצינור. לדגור על התאים המוכתמים במשך שבע דקות בחושך. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים כפי שתואר קודם לכן resuspend את הכדור ב 50 מיקרוליטרים של DMEM עבור דגימות בהשעיה או 20 מיקרוליטרים של DMEM עבור תאים בכליאה.

להכנת ההשמנה האופטית או תא OT לניסויים עם התאים בהשעיה, לחתוך חתיכת נייר דבק דו צדדי עם כ 10 מילימטר על 10 מילימטר חור מרובע במרכז. מקלפים את אחת משכבות ההגנה של הסרט ומניחים את הצד החשוף של הסרט במרכז צלחת תחתונה מזכוכית מספר 1.5 H. לחץ על הקלטת בעדינות כדי לקבל את כל פני השטח של הקלטת לדבוק זכוכית תוך הימנעות בועות אוויר לקלף את שכבת המגן הנותרת של הקלטת.

דגירה על פני השטח עם 100 מיקרוליטרים של Concanavalin A ב 0.5 מיליגרם למיליליטר במשך 30 דקות. לאחר מכן להסיר את הירידה של Concanavalin A ולשטוף את פני השטח עם DMEM. הוסף 30 מיקרוליטרים של הפתרון המכיל את התאים על פני השטח של החלל.

לאחר מכן סגור את התא בעדינות רבה עם זכוכית כיסוי 22 על 22 מילימטר. יש להשתמש באזמל או במלקחיים במידת הצורך. לאחר מכן, המשך לאתחול פינצטה אופטית על ידי הפעלת הלייזר בהספק גבוה במידה ניכרת למשך 30 דקות לפחות לפני הניסוי כדי לייעל את יציבות כוח היציאה.

בסיום, הפעל את מודול האלקטרוניקה של מניפולציית מיקרו אופטי ויחידות מדידת כוח. לפני יישור חיישן הכוח האופטי, לשים טיפת מים על המטרה 60X 1.2 טבילת מים ולהניח את התא המכיל את התאים על הבמה. התמקד על פני השטח התחתונים של התא שבו דגימות התא יוצבו.

לאחר הוספת טיפה של שמן טבילה על גבי שקופית זכוכית הכיסוי המכסה את המדגם, להוריד את העדשה איסוף של יחידת חיישן הכוח עד שהוא מגע עם טיפת השמן. בעקבות ההליך הסטנדרטי ליישור חיישן הכוח האופטי, עיין בתמונת המישור לדוגמה במצלמת העזר שתשמש למיקום ה- OTs, ולאחר מכן הנמך את חיישן הכוח האופטי עד לעצירת השדה שלו מופיעה מחוברת למישור הדגימה. כדי לבדוק אם קיימות בועות אוויר עם עדשת ברטרנד, שימו לב לנתיב ההדמיה דרך מצלמת העזר.

אם ניתן לראות לכלוך או בועות אוויר, נקו את העדשה והתא ברקמת עדשה נטולת אבק לפני החזרה על ההליך כמתואר, והוסיפו שמן טבילה נוסף. באמצעות הברגים לרוחב המונחים על המחזיק של חיישן הכוח האופטי, מרכז את עצירת השדה לשדה הראייה. ליתר דיוק, פתח את תחנת השדה כמעט כדי לכבוש את שדה הראייה הנראה במצלמת העזר.

לאחר הצבת המדגם במיקרוסקופ ויישור חיישן הכוח האופטי, השתמש בלוח חצי הגל המסתובב כדי להגדיר את כוח המלכודת הראשוני ל-200 מילי-וואט אם הנוקשות של הגרעין או המבנה הבין-תאי הנחקר אינם ידועים. לאחר שתסיים, השתמש בבקר התוכנה של שלב המיקרוסקופ כדי לחפש תא עם חרוז אחד או שניים באמצעות מיקרוסקופיה משודרת של ברייטפילד. בגיליון המספרי, כתוב את ההעתק ואת השעה של כל שלב מסלול עוקב.

לחלופין, טען את הטבלה S1 מהחומר המשלים. לניסוי מתח/הרפיה, תכנתו את העומסים הטרפזיים שיש ליישם. בתוכנת OT, הפעל את המלכודות האופטיות.

ללכידת מיקרוספירה, הגדר את מישורי התמונה מעט מעל החרוזים באמצעות בקר תוכנה של במת מיקרוסקופ. לחץ על microbead פוליסטירן בחלון הדמיה מצלמת עזר מכויל. כליאה מוצלחת של החרוז על ידי המלכודת האופטית תפחית מאוד את תנועת החרוז.

לחץ וגרור את החרוז על פני הציטופלסמה ומקם אותו במרחק של כשני מיקרון מהמעטפה הגרעינית. ודא שהמסלול מוגדר כך שכניסת החרוזים תהיה מאונכת לקרום הגרעיני. כאשר ההתקנה מוכנה, עבור אל תוכנת ההדמיה ולחץ על לחצן הרכישה כדי להתחיל ברכישת תמונה.

פתח את חלון הקריאה בזמן אמת, לחץ על נתונים ושמור בחלון הקריאה בזמן אמת כדי לשמור. התחל מיקום השמנה וכפה נתוני מדידה. הפעל את המסלול שנטען בעבר על ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על החרוז ובחירת מסלול התחלה.

המתן עד לסיום המסלול והמערכת תתייצב לפני שתסיים את ההקלטה של נתוני מדידת כוח המלכודת. הפסק רכישת תמונות והתווה את התוצאות בתוכנה שלאחר העיבוד. בניתוח הייצוגי, מוצג תא גזע מבודד של דגי זברה עם מיקרוספירה אחת קרוב לגרעין.

הפצת מיקרוספירה פוליסטירן חמש שעות לאחר ההזרקה בתוך עובר היה במעקב. תמונת ברייטפילד ופלואורסצנטיות מראה שהחרוזים מפוזרים על פני רקמת העובר. הקרנה מקסימלית של מחסנית Z פלואורסצנטית קונפוקלית והקרנה מקסימלית של תת-מחסנית באותו אזור מאשרת כי חלק גדול של תאים עמוקים הכיל חרוז אחד עד שניים.

ב 24 שעות לאחר ההפריה, החרוזים חולקו על פני כל הגוף של העובר. המיקרוגרפים של ברייטפילד של תאי ההשעיה בתאים הסגורים עם חרוז אחד או שניים מוזרקים הושגו. יתר על כן, תוויות פלואורסצנטיות מרובות הקלו על חקירת היבטים שונים של התאים, כגון ממברנה פנימית, קרום פלזמה, DNA וקו מהונדס.

תמונות מייצגות תיארו גרעינים עם תווית הוכשט חמש שניות לפני / במהלך וחמש שניות לאחר הכניסה עם מיקרוספירה לכודה אופטית. פרופילי עוצמה לאורך קטע הכניסה לשלוש מסגרות ומסלולים שונים של הגבולות הדיסטליים והפרקסימליים של הגרעין במהלך ניסוי כניסה של תאים מושעים ומוגבלים נחקרו. מסלול לכוד וכוח שחווה המיקרוספירה הלכודה אופטית במהלך ניסוי חריץ גרעיני חוזר ונשנה נמדדו.

מכניקת הגרעין בתאים בהשעיה ותחת כליאה אישרה כי הכליאה הביאה להרחבת האזור הצפוי ולשינוי לא משמעותי בנוקשות הגרעינית. אם חרוזים מוזרקים לתוך העובר שלב תא אחד, הם ככל הנראה להפיץ באופן שווה בשלבים מאוחרים יותר. זכור כי החרוז חייב להיות לכוד ביציבות.

אם החרוז בורח מהמלכודת האופטית, הגדר מחדש את המסלול או להגביר את כוח הלייזר. ניסויים אלה יכולים להתבצע בקלות על מיקרואורגניזמים מרובים בתוך תא אחד ולהרחיב למדידות מיקרו-התחממות פעילות.