Name: מתאים לסינתזת חלבונים ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: חקור שיטת אינדוקציה אוטומטית ללא תאים לסינתזת חלבונים מ-Escherichia coli בפחות מ-24 שעות. שיטה זו מפשטת את הפרוטוקול, מקטינה פיקוח ומאפשרת ייצור תמציות תאים בנפח גבוה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד"ר ג'ניפר ונדרקלן ולאנדראה לובשר על התמיכה הטכנית. המחברים רוצים להודות גם לניקול גרגוריו, מקס לוין, אליסה מולין, ביונגצ'ול סו, אוגוסט ברוקוול, אליזבת (ליזי) וויבודה, לוגן ברינגטון וג'יליאן קסמן על דיונים מועילים. המחברים מכירים גם בתמיכת מימון מקרן ביל ולינדה פרוסט, המרכז ליישומים במענק המחקר היישומי של שברון ביוטכנולוגיה, Cal Poly Research, Scholarly והקרן הלאומית למדע (NSF-1708919).

1. צמיחה במדיה
<ol><li>הכן 960 מ"ל של מדיית CFAI כמתואר בטבלה 1 והתאם את ה- pH ל- 7.2 באמצעות KOH.</li>
	<li>העבר את מדיית התרבות לבקבוקון מבולבל של 2.5 ל' ואוטוקלב למשך 30 דקות ב-121 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכינו תמיסת סוכר של 40 מ"ל כמתואר בטבלה 1. מסננים-מעקרים את התמיסה למיכל זכוכית אוטוקלבי נפרד. הערה: ניתן לאחסן את תמיסת הסוכר באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.</li>
	<li>אפשרו למדיה להתקרר לחלוטין אל מתחת ל-40 מעלות צלזיוס לאחר האוטוקלבינג.</li>
	<li>לפני חיסון המדיה של CFAI, להוסיף את תמיסת הסוכר ישירות למדיה CFAI.</li>
	<li>כדי לחסן את התקשורת, החליקו לולאה של מושבות מצלחת E. coli BL21 Star (DE3) שהייתה מפוספסת בעבר והכנסו ישירות לתקשורת. סובבו את הלולאה לתוך המדיה אך הימנעו מלגעת בצידי המיכל. ודאו שצלחת הפסים טרייה, עם תאים בני קיימא.</li>
	<li>מניחים את הבקבוקון עם המדיה המחוסנת באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס תוך כדי רעד ב-200 סל"ד. אפשרו לתרבות לצמוח בן לילה. אם התאים מחוסנים בערב, התרבית תגיע לצפיפות אופטית משוערת, הנמדדת ב-600 ננומטר (OD600), מתוך 10 בבוקר שלאחר מכן. ניתן להתאים את זמני החיסון והקציר לפי הצורך.</li>
</ol>2. קציר תאים
<ol><li>הכינו מראש את מאגר S30 ושמרו עליו קר. הכן את מאגר S30 לפי טבלה 2, ל- pH סופי של 8.2. הערה: ניתן להכין את מאגר S30 ימים לפני קצירת התאים. אם זה נעשה, להכין ללא dithiothreitol ולאחסן ב 4 °C (66 °F). הוסיפו את dithiothreitol רגע לפני השימוש.</li>
	<li>מנקודה זו והלאה, שמור את כל הפתרונות והחומרים על הקרח. העבר 1 ליטר של מדיה לתוך בקבוק צנטריפוגה 1 L וצנטריפוגה ב 5,000 x גרם בין 4-10 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. דקאנט וסילוק הסופרנאטנט. באמצעות מרית סטרילית, מעבירים את הכדור לצינור חרוטי מצונן מראש ומשקלו בעבר 50 מ"ל.</li>
	<li>יש לשטוף פעם אחת עם 30-40 מ"ל של חיץ S30 קר על ידי שימוש חוזר בכדור באמצעות מערבולות ב-30 שניות מתפרצות עם תקופות מנוחה על קרח. הערה: בשל נפח גבוה יותר של גלולה, פיצול גלולת התא לשני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל יכול להיות מועיל לשלב הכביסה. אחסון תאים באליקוטים קטנים יותר מספק גם גמישות לעיבוד במורד הזרם.</li>
	<li>צנטריפוגה את החייאת התא ב 5000 x g בין 4-10 °C למשך 10 דקות.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט ונגבו כל עודף מהקירות הפנימיים של הצינור החרוטי 50 מ"ל באמצעות רקמה נקייה, הימנעו מלגעת בכדור עצמו. שוקלים ומהבהבים להקפיא את הכדור בחנקן נוזלי. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. הערה: ייתכן שכדורים לא ידרשו הקפאת הבזק אם המשתמש מתכנן להמשיך בפרוטוקול הכנת החילוץ.</li>
</ol>3. חילוץ הכנה
<ol><li>שלבו את הכדור הקפוא עם 1 מ"ל של חיץ S30 עבור כל גרם אחד של גלולת התא ואפשרו להפשיר על הקרח למשך כ-30-60 דקות. כדור מופשר באמצעות מערבולת בהתפרצויות של 30 שניות עם תקופות מנוחה על הקרח. מערבולת עד שלא נותרו גושים נראים לעין של תאים. הערה: ניתן לבצע שימוש חוזר בגושים קטנים יותר על ידי ערבוב באמצעות פיפטה.</li>
	<li>העברת אליקוטים של 1.4 מ"ל של החייאת תאים לצינורות מיקרופוג' של 1.5 מ"ל לצורך תסיסת תאים. Sonicate כל צינור עם תדר של 20 kHz ו 50% משרעת עבור שלושה התפרצויות של 45 s עם 59 s של מנוחה בכל מחזור מוקף באמבט קרח. הפוך את הצינור בין המחזורים ומיד הוסף 4.5 μL של 1 M dithiothreitol לאחר מחזור הסוניקה האחרון. הערה: בשל החום המשתחרר מסוניקציה, חשוב מאוד לוודא שכל האליקוטים נשמרים על קרח כאשר הם לא נסתמים. אמבט הקרח צריך להיות כל הזמן מחודש או גדול מספיק כדי להישאר קריר לאורך כל תהליך sonication.</li>
	<li>צנטריפוגה כל צינור ב 18,000 x g ו 4 ° C במשך 10 דקות. שלפו את הסופרנאטנט ואת האליקוט לתוך צינורות מיקרופוג' של 1.5 מ"ל ב-600 μL aliquots. פלאש להקפיא aliquots ולאחסן ב -80 °C (80 °F) עד לשימוש נוסף. יש להקפיד על פיפטה רק על הסופרנאטנט.</li>
</ol>4. סינתזת חלבונים ללא תאים
<ol><li>להפשיר תמצית אחת מהשלב הקודם לביצוע 15 μL של תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בצינורות מיקרופוגה של 1.5 מ"ל ב-quadruplicate.</li>
	<li>הכינו כל תגובה על ידי שילוב של 240 ננוגרם של דנ"א (ריכוז סופי של 16 מיקרוגרם/מ"ל), 2.20 מיקרול"ל של תמיסה A, 2.10 μL של תמיסה B, 5.0 μL של תמצית, ונפח משתנה של מים ברמה מולקולרית כדי למלא את התגובה ל-15 μL. ניתן לשנות את קנה המידה של תגובה זו לנפחים גבוהים יותר. ראה טבלה 3 לקבלת יחסים.<ol>
<li>הכן את פתרון א' ו-ב' לפי לוח 4. ניתן להכין כל תמיסה בקבוצות של 100 μL עד 1 מ"ל, לדחוס אותה ולאחסן אותה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. הערה: כמות הדנ"א יכולה להשתנות בהתאם לחלבון המעניין. במקרה זה, הפלסמיד שבו נעשה שימוש, pJL1-sfGFP, עבר אופטימיזציה לביצועים של 16 מיקרוגרם/מ"ל, או 597 מיקרומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תנו לתגובות לרוץ לפחות 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>5. כימות של חלבון כתב, חלבון פלואורסצנטי ירוק סופר-תיקייה (sfGFP)
<ol><li>באמצעות צלחת פוליסטירן שחורה בעלת חצי שטח של 96 בארות, שלב 2 μL של כל תוצר תגובת סינתזת חלבונים ללא תאים עם 48 μL של 0.05 M HEPES buffer ב- pH 7.2. שלושה עד ארבעה שכפולים של כל צינור תגובה מומלצים.</li>
	<li>לכמת את עוצמת הפלואורסצנציה של ה-sfGFP עם אורך גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 528 ננומטר.</li>
	<li>להמרה של יחידות פלואורסצנטיות יחסיות לתפוקה נפחית (מיקרוגרם/מ"ל) של sfGFP, קבעו עקום סטנדרטי באמצעות pJL1-sfGFP מטוהר.</li>
</ol>

<ol><li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li>
<li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li>
<li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+supplement+mixtures%3A+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li>
<li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li>
<li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li>
<li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%3A+Protocols+for+a+robust%2C+flexible%2C+and+accessible+platform+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882(2019).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22System+for+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable%2C+on-demand+biomolecular+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li>
<li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li>
<li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li>
<li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li>
<li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li>
<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663(2015).</li>
<li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li>
<li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li>
<li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li>
<li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li>
<li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li>
<li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlining+the+preparation+of+%22endotoxin-free%22+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li>
<li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li>
<li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li>
<li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li>
<li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system%3A+Practical+laboratory+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li>
<li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing%2C+stressed+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li>
<li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li>
<li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+A+highly+productive%2C+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li>
<li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li>
<li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים כספיים מתחרים.

פיקוח על חוקרים נחוץ באופן מסורתי לשתי פעולות מפתח במהלך גדילת התאים: אינדוקציה של T7 RNAP ותאי קצירת תאים ב-OD600 ספציפי. CFAI מייתר את שתי הדרישות הללו כדי להפחית את הזמן וההכשרה הטכנית הנדרשת לחוקר על מנת להכין תמציות תאים באיכות גבוהה. אינדוקציה אוטומטית של T7 RNAP מושגת על ידי החלפת גלוקוז בלקטוז כסוכר העיקרי בתקשורת, מה שמייתר את הצורך הקודם לעקוב באופן פעיל אחר הצמיחה ולאחר מכן לגרום עם IPTG בנקודה מדויקת במהלך צמיחת התא. הצורך לנטר באופן פעיל תרביות תאים כדי לקצור ב-OD600 מסוים מתבטל גם הוא,...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62866">From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2,&#160;Javin P. Oza1,2 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University 
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University 
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62866">From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow

השימוש בסינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) ליישומי ביוטכנולוגיה גדל משמעותית בשנים האחרונות 1,2,3. ניתן לייחס התפתחות זו בחלקה למאמצים מוגברים בהבנת התהליכים המתרחשים ב- CFPS ובתפקידו של כל רכיב 4,5. בנוסף, עלויות מופחתות המיוחסות לתפאורות ממוטבות ולמקורות אנרגיה חלופיים הפכו את הטכנולוגיה נטולת התאים לקלה יותר ליישום עבור משתמשים חדשים 6,7,8,9. על מנת ליישם את גורמי השעתוק והתרגום הדרושים לסינתזת חלבונים, תמצית התא משמשת לעתים קרובות להנעת תגובות ללא תאים10. מדריכי משתמשים שפורסמו לאחרונה סיפקו פרוטוקולים פשוטים להפקת תמצית פונקציונלית, מה שמקל על היישום עבור משתמשים חדשים ומנוסים כאחד 1,11,12,13,14. תמצית תאים מתקבלת בדרך כלל באמצעות תזה של תרבית תאים, אשר ניתן לגדל באמצעות אורגניזמים שונים בהתאם לשימוש הספציפי הרצוי 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) הפך במהירות לאחד האורגניזמים המארחים הנפוצים ביותר לייצור תמציות פונקציונליות17. זן BL21 Star (DE3) מועדף מכיוון שהוא מסיר את הפרוטאזות מהממברנה החיצונית (OmpT פרוטאז) והציטופלסמה (Lon protease), ומספק סביבה אופטימלית לביטוי החלבון הרקומביננטי. בנוסף, ה-DE3 מכיל את ה-λDE3 שנושא את הגן עבור T7 RNA פולימראז (T7 RNAP) תחת שליטתו של מקדם ה-lacUV5; רכיב הכוכב מכיל גן RNaseE שעבר מוטציה המונע ביקוע של mRNA 4,14,18,19. תחת מקדם lacUV5, אינדוקציה של איזופרופיל-תיוגלאקטופירנוזיד (IPTG) מאפשרת ביטוי של T7 RNAP20,21. זנים אלה משמשים לגידול וקציר תאים, אשר נותנים חומר גלם להכנת תמצית. ניתן לבצע ליזיס של תאים במגוון שיטות, כולל הכאת חרוזים, עיתונות צרפתית, הומוגניזציה, סוניקציה וקוויטציה של חנקן 1,11,12,22.
תהליך תרביות החיידקים והקציר עקבי ברוב הפלטפורמות בעת שימוש ב-E. coli, אך דורש מספר ימים ופיקוח אינטנסיבי של החוקריםעל 1,11,13. תהליך זה מתחיל בדרך כלל בתרבית זרעי לילה במרק LB, אשר עם צמיחת הלילה מחוסנת לתרבית גדולה יותר של 2xYTPG (שמרים, טריפטון, מאגר פוספטים, גלוקוז) למחרת. הצמיחה של תרבית גדולה יותר זו מנוטרת עד שהיא מגיעה לשלב הלוג המוקדם עד אמצע, בצפיפות אופטית (OD) של 2.514,20. נדרשת מדידה מתמדת מכיוון שמרכיבי התעתיק והתרגום הוכחו בעבר כפעילים מאוד בשלב הלוג המוקדם עד אמצע23,24. בעוד שתהליך זה יכול ליצור תמצית הניתנת לשחזור, המעבדה שלנו פיתחה לאחרונה שיטה חדשה באמצעות מדיה אוטו-אינדוקציה ללא תאים (CFAI), אשר מפחיתה את הפיקוח על החוקרים, מגדילה את התפוקה הכוללת של תמצית עבור ליטר נתון של תרבית תאים, ומשפרת את הגישה להכנת תמצית מבוססת E. coli עבור משתמשים מנוסים וחדשים כאחד (איור 1 ). כאן אנו מספקים את המדריך שלב אחר שלב ליישום זרימת העבודה של CFAI, כדי לעבור מלוח תאים מפוספס לתגובת CFPS שהושלמה תוך 24 שעות.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרופוגה</td><td>Phoenix</td><td>MPC-425Q</td><td></td></tr><tr><td>1L צינור צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>A99028</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-E צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C3144-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ציטציה 5 תאים הדמיה רב מצבית קורא</td><td>ביוטק</td><td>BTCYT5F</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>פישר</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>D-לקטוז</td><td>אלפא Aesar</td><td>J66376</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פולינית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F7878-100 מ"ג</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td></td><td>פישר BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7126-100G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td>366754</td><td></td></tr><tr><td>K(GLU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>K(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-ארגינין</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-אספרגין</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>A0884-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-חומצה אספרטית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7219-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C7352-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-חומצה גלוטמית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G3126-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-היסטדין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-איזולאוצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I2752-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-לאוצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L5501-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-מתיונין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M9625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-פנילאלנין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P2126-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-פרולין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0380-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-סרין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S4500-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-תראונין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-טריפטופן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T0254-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-טירוזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T3754-100G</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>ThermoFisher</td><td>12795027</td><td></td></tr><tr><td>L-Valine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500-25G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Glu)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661-250G</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופוגה 20</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30134</td><td></td></tr><tr><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' מים בדרגה מולקולרית</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12313</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8535-15VL</td><td></td></tr><tr><td>ניו ברונסוויק Innova 42/42R אינקובטור</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0000</td><td></td></tr><tr><td>NH4(GLU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09689-250G</td><td></td></tr><tr><td>NTPs</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אוקסלית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0963-100G</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>860077-250 מ"ג</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט אקרוס דו-בסיסי</td><td>, אורגניים</td><td>A0382124</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט אקרוס מונו-בסיסי</td><td>, אורגניים</td><td>A0379904</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>K210007</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D13208-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>73049-73-7</td><td></td></tr><tr><td>Tunair 2.5L בקבוק שייק מבולבל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z710822</td><td></td></tr><tr><td>מעבד</td> <td>אולטרסאונדQSonica</td><td>Q125-230V/50HZ</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>1/2/8013</td><td></td></tr></tbody></table>

מתאים לסינתזת חלבונים ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) גדלה כפלטפורמה ביוטכנולוגית הלוכדת מכונות שעתוק ותרגום במבחנה. התפתחויות רבות הפכו את פלטפורמת CFPS לנגישה יותר למשתמשים חדשים והרחיבו את מגוון היישומים. עבור מערכות CFPS מבוססות ליסאט, ניתן להפיק תמציות תאים ממגוון אורגניזמים, ולרתום את הביוכימיה הייחודית של אותו פונדקאי כדי להגביר את סינתזת החלבונים. במהלך 20 השנים האחרונות, Escherichia coli (E. coli) הפך לאחד האורגניזמים הנפוצים ביותר לתמיכה ב- CFPS בשל יכולתו הכלכלית והרבגוניות שלו. למרות ההתקדמות העיקרית הרבה, זרימת העבודה להכנת תמצית תאי E. coli נותרה צוואר בקבוק מרכזי עבור משתמשים חדשים כדי ליישם CFPS עבור היישומים שלהם. זרימת העבודה של הכנת החילוץ היא עתירת זמן ודורשת מומחיות טכנית כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור. כדי להתגבר על מחסומים אלה, דיווחנו בעבר על פיתוח של זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית (CFAI) הפועלת 24 שעות ביממה ללא תאים, המפחיתה את קלט המשתמש ואת המומחיות הטכנית הנדרשת. זרימת העבודה של CFAI ממזערת את העבודה ואת המיומנות הטכנית הנדרשת ליצירת תמציות תאים תוך הגדלת הכמויות הכוללות של תמציות תאים המתקבלות. כאן אנו מתארים את זרימת העבודה הזו באופן שלב אחר שלב כדי לשפר את הגישה ולתמוך ביישום הרחב של CFPS מבוסס E. coli .

בעת הכנת מדיה CFAI, גלוקוז הוחלף לעלייה בלקטוז וגליצרול כמצע האנרגיה העיקרי בתקשורת. בנוסף, קיבולת האגירה של המדיה CFAI הוגדלה גם כן. רכיבים ספציפיים אלה מופיעים בטבלה 1.
לאחר מכן התאים גודלו הן ל-OD600 מתוך 10 והן ל-2.5 הסטנדרטי במדיית CFAI כדי להראות עקביות עם איכות החילוץ למרות כמויות החילוץ המשתנות. המדיה של 2.5 OD600 CFAI גדלה לאחר שהתחסנה מתרבות זרעים בציר LB ב-37 °C (74 °F), 200 סל"ד, בעוד שתרבות OD600 10 חוסנה ישירות מצלחת.</str...

עבודה זו מתארת את הכנת תמצית התאים מ-Escherichia coli (E. coli) ולאחר מכן תגובות של סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) תוך פחות מ-24 שעות. הסבר על פרוטוקול אוטו-אינדוקציה ללא תאים (CFAI) מפרט שיפורים שנעשו כדי להפחית את הפיקוח על החוקרים ולהגדיל את כמויות תמצית התאים המתקבלות.

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

שיטת האוטו-אינדוקציה נטולת התאים מפחיתה את הפיקוח על החוקרים ואת הזמן הדרוש להפקת תמציות תאים פונקציונליות. זה מפשט פרוטוקולים קודמים של סינתזת חלבונים במבחנה שגזלו זמן רב יותר ואינטנסיביים יותר. טכניקה זו פחות מסובכת וגם מניבה תשואה גבוהה, מה שיאפשר לקהל גדול יותר ליישם ביטוי חופשי בתאים.שיטה זו מדגישה את החשיבות של חילוף החומרים האנרגטי במהלך גדילת התאים ובתגובות נטולות תאים. התחל על ידי הכנת 960 מיליליטרים של מדיה אוטו-אינדוקציה ללא תאים. לאחר מכן, לעקר את התקשורת בבקבוקון מבולבל של 2.5 ליטר על ידי אוטוקלאבים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, לאחר הכנת 40 מיליליטרים של תמיסת הסוכר, מסנן-לעקר אותו לתוך מיכל זכוכית אוטוקלבי נפרד. לאחר האוטוקלבינג, כאשר המדיה התרבותית התקררה אל מתחת ל-40 מעלות צלזיוס, הוסיפו את תמיסת הסוכר המעוקרת במסנן ישירות לתקשורת. לאחר מכן, חסן את התקשורת על ידי החלקת לולאה מלאה במושבות מתוך לוחית כוכב E.coli BL21 טרייה שנוסתה בעבר והחדרת הלולאה ישירות לתוך המדיה.סובבו את הלולאה לתוך המדיה מבלי לגעת בצידי המיכל. לאחר מכן, הניחו את המדיה המחוסנת למשך הלילה בחממה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד. למחרת, לקצור את התאים על ידי העברת ליטר אחד של המדיה לתוך בקבוק צנטריפוגה של ליטר אחד וצנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G בין ארבע ל 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.לאחר השלכת הסופרנאטנט, השתמשו במרית סטרילית כדי להעביר את הכדור לצינור חרוטי מצונן מראש ושקל בעבר 50 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את הכדור פעם אחת עם 30 עד 40 מיליליטרים של חיץ S30 קר על ידי שימוש חוזר בכדור באמצעות מערבולות בהתפרצויות של 30 שניות עם תקופות מנוחה על קרח. לאחר שהכדור עובר החייאה מוחלטת, צנטריפוגה של החייאת התא, משליכים את הסופרנטנט, ובאמצעות רקמה נקייה, מנגבים כל סופרנטנט עודף מהקירות הפנימיים של צינור 50 מיליליטר מבלי לגעת בכדור.לאחר מכן, שקלו את הכדור לפני שהבזק הקפיא אותו בחנקן נוזלי ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. כדי להכין את תמצית התא, הוסיפו מיליליטר אחד של חיץ S30 לגרם של גלולת התא הקפואה ואפשרו לכדור להפשיר על הקרח למשך 30 עד 60 דקות. לאחר מכן, החזירו את הכדור המופשר באמצעות מערבולות בהתפרצויות של 30 שניות עם תקופות מנוחה על הקרח עד שלא נותרו גושי תאים נראים לעין.עבור תזה של תאים, העבר 1.4 אליקוטים של מיליליטר של תרחיף התא לתוך צינורות מיקרופוג'ים של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, נקו את תרחיף התא בכל צינור בתדר של 20 קילוהרץ ו-50% משרעת במשך שלושה התפרצויות של 45 שניות עם 59 שניות מנוחה לכל מחזור באמבטיית קרח הפוך את הצינור בין המחזורים, ולאחר מחזור הסוניקציה האחרון, הוסיפו מיד 4.5 מיקרוליטרים של דיתיותריאטול טוחן אחד. לאחר שקול תרחיף התא בכל הצינורות, צנטריפוגה של הצינורות ואספו את הסופרנטנט באליקוטים של 600 מיקרוליטר לתוך צינורות מיקרופוג'ים טריים של 1.5 מיליליטר.פלאש להקפיא ולאחסן את aliquots במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. כדי לבצע 15 מיקרוליטרים של תגובת סינתזת חלבונים נטולי תאים בצינורות מיקרופוג' של 1.5 מיליליטר ב-quadruplicate, להפשיר אליקוט אחד של תמצית התא. לאחר הכנת כל תערובת תגובה של 15 מיקרוליטר, אפשרו לתגובה לפעול במשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.כדי לכמת את חלבון הכתב, שלבו 48 מיקרוליטרים של מאגר HEPES של 50 מילימולרי ב-pH 7.2 עם שני מיקרוליטרים של כל תוצר תגובת סינתזה של חלבון ללא תאים בצלחת פוליסטירן שחורה בעלת 96 בארות. לכמת את עוצמת הפלואורסצנציה של החלבון הפלואורסצנטי הירוק הסופר-פולד, או sfGFP, באמצעות אורך גל עירור של 485 ואורך גל פליטה של 528 ננומטר. לאחר מכן, המר את היחידות הפלואורסצנטיות היחסיות לתפוקה הנפחית של sfGFP על ידי יצירת עקום סטנדרטי באמצעות פלסמיד pJL1 sfGFP מטוהר.מוצגים כאן כדורי מדיה של אוטו-אינדוקציה ללא תאים לאחר קצירת תאים בצפיפויות אופטיות שונות שנמדדו ב-600 ננומטר. המדיה שגדלה לצפיפות אופטית של 10 הפיקה כמות גבוהה יותר של כדורי תאים בתמצית הכוללת מאשר המדיה שגדלה לצפיפות אופטית של 2.5. ניתוח נוסף של ריכוז החלבון הכולל לא הראה הבדל משמעותי בחלבון הכולל בין שתי התמציות.אף על פי שהמדיה גדלה לרמות צפיפות אופטיות שונות, שתי התמציות הדגימו תוצאות דומות בתגובות נטולות תאים המבטאות sfGFP. שמירה על תנאים סטריליים תוך הכנת תמיסת המדיה והסוכר חשובה. ניתן להשתמש בשיטת חילוץ תאים זו של CFAI עבור רוב היישומים של ביטוי חופשי לתאים.אלה נעים בין חינוך לביוטכנולוגיה להנדסת חלבונים, כמו גם אבחון נקודתי. שיטה זו מפחיתה את משך הזמן והמיומנות הטכנית הנדרשת, משפרת את יכולת השכפול ומייצרת כמויות גבוהות יותר של תמצית.

from-cells-to-cell-free-protein-synthesis-within-24-hours-using-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פרוטוקול של חמישה ימים זה מתאר את כל השלבים, ציוד ותוכנה נוספת דרושה ליצירה והפעלת מערכת ביטוי תא ללא TX-TL מאפס חיידקי Escherichia אנדוגני יעילים מבוססים. עם חומרים כימיים, הפרוטוקול לוקח 8 שעות או פחות להגדרת תגובה, לאסוף, ולעבד נתונים.

פרוטוקולים ליישום חיידקי Escherichia בהתבסס TX-TL סלולרי ללא ביטוי של ביולוגיה סינתטית

במאמר זה וידאו, אנו מתארים את הסינתזה במבחנה של mRNA שונה לזירוז של ביטוי חלבון בתאים.

במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

מתואר מכשיר מיקרו-מיוצר עם תאי תגובה בנפח פמטוליטר הניתנים לאטימה. דוח זה כולל פרוטוקול לאיטום מגיבי סינתזת חלבון נטולי תאים בתוך תאים אלה לצורך הבנת תפקיד הצפיפות והכליאה בביטוי גנים.

מערכים רבים סגר Femtoliter הלשכה לביולוגיה ללא סלולארי

אנו מתארים הליך ליטוגרפית פשוט לאימוביליזציה של מולקולות DNA ג'ין באורך על משטח, אשר יכול לשמש כדי לבצע ניסויים ביטוי הגן ללא תא biochips.

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

פרוטוקול זה מפרט את השלבים, ' עלויות ' הציוד הנדרש לייצר e. coli-המבוסס על תמציות תא וליישם במבחנה תגובות סינתזת חלבון תוך 4 ימים או פחות. למנף את אופי גמיש הפלטפורמה עבור יישומים רחב, נדון תנאי ריאקציה, כי ניתן להתאים אופטימיזציה.

Escherichia coli-המבוסס על סינתזת החלבון ללא תא: פרוטוקולים עבור טכנולוגיית פלטפורמה חזקים, גמישים ונגישים

פרוטוקול זה מתאר את השיטה, חומרים, ציוד ושלבים עבור הכנת מלמטה למעלה של RNA וחלבון הפקת תאים סינתטיים. התא הפנימי מימית של התאים הסינתטיים הכיל S30 ליפוסט חיידקי כדורית בתוך bilayer ליפיד (כלומר, ליפוזומים יציבים), באמצעות העברת תחליב המים בשמן שיטה.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

המחקר מתאר פרוטוקול ליצירת כמויות גדולות (מיקרוגרם-מ"ג) של DNA עבור קמפיינים הקרנת חלבונים מרסיסי גנים סינתטיים ללא שיבוט או שימוש בתאים חיים. התבנית המינימלית מתעכלת באופן אנזימטי ומעגלית ולאחר מכן מוגברת באמצעות הגברה איזותרמית מתגלגלת של מעגל. תגובות חופש התא יכול להתבצע עם המוצר שלא שאושר.

שיטות מהירות ואנזימטיות להגברה של תבניות ליניאריות מינימליות לאבן טיפוס של חלבונים באמצעות מערכות נטולות תאים

חלקים גנטיים מאופיינים היטב נחוצים לתכנון מעגלים גנטיים חדשים. כאן אנו מתארים שיטה חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לאפיון מהיר של חלקים גנטיים. השיטה שלנו מפחיתה עלויות וזמן על ידי שילוב ליזטים נטולי תאים, DNA ליניארי למניעת שיבוט וטיפול בנוזלים אקוסטיים כדי להגדיל את התפוקה ולהפחית את נפחי התגובה.

אפיון מהיר של חלקים גנטיים עם מערכות נטולות תאים

מוצג כאן פרוטוקול להכנה וכיול חיץ של תמציות תאים מזני נוקאאוט אקסונוקלאז V של Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD ו- ΔrecB). זוהי גישה מהירה, קלה וישירה לביטוי במערכות סינתזת חלבונים נטולות תאים באמצעות תבניות דנ"א ליניאריות.

סינתזת חלבונים נטולת תאים מתמציות תאיות חסרות אקסונוקלאז תוך שימוש בתבניות DNA ליניאריות

פרוטוקול זה מתאר את מערכת סינתזת החלבונים ללא תאים (CFPS) המשמשת לבניית תאים סינתטיים. הוא מתאר שלבי מפתח עם תוצאות מייצגות במיקרו-תאים שונים. מטרת הפרוטוקול היא לבסס שיטות עבודה מומלצות למעבדות מגוונות בקהילת התאים הסינתטיים, ולקדם את ההתקדמות בפיתוח תאים סינתטיים.

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים לבניית תאים סינתטיים

חקור שיטת אינדוקציה אוטומטית ללא תאים לסינתזת חלבונים מ-Escherichia coli בפחות מ-24 שעות. שיטה זו מפשטת את הפרוטוקול, מקטינה פיקוח ומאפשרת ייצור תמציות תאים בנפח גבוה.

מתאים לסינתזת חלבונים ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים

גלה סרטונים נוספים