Name: חיסון חופשי של מוחות עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: למד שיטת חיסון חופשי של מוחות עכבר לחקר נוירואנטומיה ותבניות ביטוי חלבונים. פרוטוקול זה מספק תוצאות היסטולוגיות איכותיות ומהימנות למחקר עצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

החוקרים נתמכו על ידי מענקים מה- NIH (K01DK119471 ל- CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480, ו- R01DK120858 ל- YX), USDA / CRIS (51000-064-01S ל- YX) ומלגת פוסט-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי (#829565) ל- LT.

C57BL / 6J עכברים משני המינים (8-16 שבועות של גיל) שימשו במחקר הנוכחי. טיפול בכל בעלי החיים וכל ההליכים אושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מכללת ביילור.
1. זלוף
הערה: שלבים 1.1 - 1.6 מבוצעים במכסה אדים.
<ol><li>הרדמה<ol>
<li>יוצקים 5 מ"ל של איזופלוראן (ראה שולחן החומרים) על מגבת נייר המונחת בתחתית חיטוי. הציגו את העכבר על המחסום התבצר בתוך התבשר והמתינו עד לסימני נשימה. הערה: ללא נשימה, העכבר עדיין יש פעימות לב לתקופה קצרה של זמן, וזה יהיה perfused לפני היעלמות פעימות הלב.</li>
		<li>לפני שתמשיך, אשר שאין רפלקס לצבוט בוהן.</li>
		<li>תקן את העכבר ללוח קצף על ידי נהיגה סיכה דרך כל רגל. ודא כי לוח הקצף ממוקם במגש כדי לאסוף נוזל נוזל.</li>
	</ol></li>
	<li>חשיפת הלב<ol>
<li>בצע תותח שטחי אורך לאורך קו האמצע מעל בית החזה והבטן, ולאחר מכן להזיז את העור הצידה כדי לחשוף את דופן השריר של בית החזה והבטן. לאחר מכן, לעשות נתק בשכבת השריר כדי לחשוף את הכבד ואת המעי. לבסוף, לחתוך את כלוב הצלעות עם מספריים כדי לפתוח את בית החזה ולחשוף את הלב והריאות. השתמש במלקחיים hemostatic כדי למשוך את בית החזה הצידה כדי להרחיב את אזור העבודה.</li>
	</ol></li>
	<li>איסוף דם סופני (אופציונלי)<ol>
<li>הכנס מזרק של 1 מ"ל (ראה טבלת החומרים) בזהירות לתוך האטריום הימני של הלב עד שהקצה מוטבע לחלוטין. החזק את המזרק יציב ולשאוב דם לאט עד הנפח הרצוי הוא הגיע. הערה: הדאג לא לחדור מעבר לאטריום הנכון; אוסף של 300-400 μL של דם הוא בר השגה לכל עכבר מבוגר. תוספים כגון מאיץ קריש או נוגד קרישה עשוי לשמש, בהתאם למטרה של איסוף דם.</li>
	</ol></li>
	<li>מיקום צינורית זלוף<ol>
<li>למתחילים, לחתוך חור קטן (<1 מ"מ) בחדר השמאלי של הלב עם מספריים ולהכניס צינורית קהה (18 G מחט לעכברים צעירים ו 21 G מחט לעכברים זקנים) דרך החדר השמאלי לתוך aorta עולה. לחלופין, עבור ניסויים מנוסים, לחדור את חדר הלב השמאלי עם צינורית קהה ישירות ולהכניס אותו לתוך ביבי העורקים עולה בזהירות.</li>
		<li>מניחים סיכות סביב השילוב של הצינורית וצינורות מצמידים על לוח הקצף כדי למנוע תנועה במהלך זלוף. לחלופין, השתמש במלקחיים hemostatic כדי לתקן את הצינורית במקום. המשך לחתוך את האטריום הנכון כדי לאפשר את זרימת הדם מהמחזור. הערה: צינורית זלוף צינורות מצמידים מחוברים משאבת זלוף.</li>
	</ol></li>
	<li>זלוף עם תמיסת מלח<ol>
<li>הפעל את מתג לחץ המלח, ולפרוט את העכבר באופן transcardially עם 40-60 מ"ל של מלוחים (0.9% NaCl: 25 °C , pH 7.4). שימו לב לזרימה מהאטריום הימני ולצבע הכבד מקרוב. הערה: משאבת זלוף אוטומטית (ראה טבלת החומרים) משמשת לשטיפת הדם תוך 1-2 דקות. כמו טווח הלחץ של המשאבה הוא 1-300 מ"מ כ"ג, ניתן להתאים את המהירות בהתאם. אם תמיסת מלח דולפת מהאף ו/או שהריאה מנופחת, יש להפחית את הלחץ ולהתאים את הצינורית. ברגע שהזרימה כבר לא מכילה דם, המוח מוצף מספיק עם תמיסת מלח. בינתיים, הכבד נטול דם והופך לצבע חום-אפור.</li>
	</ol></li>
	<li>זלוף עם פורמלין<ol>
<li>כבה את מתג לחץ המלח והפעל את מתג הלחץ הפורמלין כדי לחדיר את העכבר עם 40 מ"ל של 10% פורמלין חוצץ נייטרלי (10% NBF: 25 °C ,pH 6.8-7.2, ראה טבלת החומרים). התבונן בגפיים של החיה לראיות לרעידות. הערה: תנועת זנב ניתן לראות גם לאחר עירוי של 10% NBF. זהירות: מכיוון ש- NBF מסוכן, מוצע כי החוקרים ילבשו ציוד מגן אישי (למשל, מכונת הנשמה מתאימה, מגן פנים) לאורך כל ההליך.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד מוחי9<ol>
<li>השתמש במספריים כדי להסיר את הראש. לעשות התנגשות קו אמצעי לאורך ההסתבכות כדי לחשוף את הגולגולת. לקצץ את העור ואת ההתקשרות שריר עם מספריים.</li>
		<li>לעשות לחתוך ברכס מסלולית, ולאחר מכן למקם את הקצה החד של מספריים קשתית לתוך מגנום foramen. לקדם את המספריים לאורך פני השטח הפנימיים של הגולגולת, שמירה על לחץ כלפי מעלה כדי למנוע נזק למוח. מוציאים את העצמות הקודקודיות/חזיתיות ומתקנים בזהירות. לבסוף, הסר את המוח מהגולגולת הפתוחה בעדינות.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר קיבוע<ol>
<li>מניחים את המוח בצינור 15 מ"ל מלא ב-10 מ"ל של 5% NBF ו-15% סוכרוז עבור קיבעון לילה ב-4 °C (7%). הערה: כדי להכין 10 מ"ל של 5% NBF ו 15% סוכרוז, לשלב 5 מ"ל של 10% NBF ו 5 מ"ל של 30% סוכרוז (w / v, מומס לתוך תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), ראה את טבלת החומרים). ודא שנפח המאגר הקיבווני גדול לפחות פי 10 מהדגימה עצמה. בתחילה, המוח יצוף במאגר וישקע לתחתית לאחר קיבעון בן לילה.</li>
	</ol></li>
	<li>התייבשות<ol>
<li>העבר את דגימת המוח לצינור 15 מ"ל מלא 10 מ"ל של 30% סוכרוז להתייבשות ב 4 °C (70 °F) עד שהוא שוקע.</li>
	</ol></li>
</ol>2. קריוזקציה (קטעים קורונל)
<ol><li>הכנה<ol>
<li>מניחים קרח יבש על גבי צלחת התאמת הגובה של מיקרוטומיה מחליקה, וממתינים עד לקבלת כפור לבן. בזהירות להתפשט 5 מ"ל של 30% סוכרוז על גבי הצלחת כדי ליצור שכבה של בסיס מוצק לאחר פתרון סוכרוז קפוא לחלוטין. מקם את כל דגימות המוח (עד 5 דגימות מוח בקבוצה אחת) אופקית בשורה מעל סוכרוז, ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ"ל של 30% סוכרוז לתחתית כל מוח. הערה: המוח ידבק מיד לבסיס סוכרוז הקפוא ויקפא בהדרגה מלמטה למעלה. מניחים סוכרוז נוסף סביב החלק הרכוב של המוח כדי ליצור בסיס חזק יותר לחיתוך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חתך לקטעים<ol>
<li>לאחר 5-10 דקות של הקפאה, כאשר המוח הפך קשה ולבן, לקצץ את המוח עד השכבה הרצויה / אזור הוא הגיע. הערה: התאימו את כמות הקרח היבש על הצלחת כדי לשלוט בטמפרטורה. הטמפרטורה נמוכה מדי כאשר גבישי קרח מופיעים על פני השטח של המוח. הטמפרטורה גבוהה מדי כאשר המוח הופך רך והוא כבר לא לבן.</li>
		<li>עבור ממצב חיתוך למצב הזנה ולרקמת המוח של המקטע לעובי של 25 מיקרומטר. הכן צלחת 48 באר מלאה PBS 1x, ולסמן חמש בארות למוח עכבר אחד. השתמש במברשת צבע כדי לאסוף כל מקטע מעכבר אחד ולהניח אותו בבאר אחת. לאסוף את החלק הבא של אותו עכבר ולמקם אותו לתוך הבאר השנייה .</li>
		<li>חזור על הפעולה 2.2.2 עד לבאר החמישית , הצבת קטעים 6-10 בבאר 1-5 וכן הלאה. חזור על אותו הליך עבור שאר המוחות בו זמנית. חזור על הפעולה עד שכל המקטעים מעכבר אחד נאספים לתוך 5 בארות בסדר אנטומי. הערה: בעקבות הליך זה, מקטעי המוח מכל עכבר הם aliquoted לתוך 5 סדרות, אשר ניתן להשתמש עד 5 מחקרים היסתולוגיים שונים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אחסון<ol>
<li>השתמש במכחול כדי להעביר את המקטעים מכל באר למיקרו-Tube בגודל 1.5 מ"ל מלא במאגר קריו-הגנה (20% גליצל, 30% אתילן גליקול ו-50% PBS), ולאחסן את הדגימות ב-20 °C (20 °F). הערה: קטעים אלה המאוחסנים בצינורות קטנים (1.5 מ"ל) יכולים לחסוך מקום פיזי במקפיא, ואת שלמות החלקים ניתן לשמר במשך מספר חודשים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. כתמי WFA צפים בחינם וחיסון נגד AVP
<ol><li>מניחים מסננת תאים לתוך באר של צלחת תרבית תאים 6-well מלא PBS, ולהשתמש במכחול כדי להעביר סדרה אחת של מקטעי מוח לתוך מסננת התא. לשטוף את החלקים PBS על ידי העברת מסננת התא אחר מלא PBS. יש לשטוף במשך 6 x 10 דקות על שייקר עבור חלקים המאוחסנים במאגר קריו-הגנה ו-3x10 דקות למקטעים חתוכים טריים. הערה: כל הליכי הכביסה מבוצעים בצלחת תרבית תאים של 6 טוב עם מסננת תאים בתוך כל באר (ראה את טבלת החומרים). כל מסננת מחזיקה את חלקי המוח של עניין מכל עכבר. כדי להציל ריאגנטים, כל הליכי הדגירה המתוארים להלן מבוצעים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. בין הליכי כביסה ודגרה, השתמש במכחול כדי להעביר את מקטעי המוח בין כל מסננת תאים לכל צינור. לכביסה עם PBS, 12 מ"ל מתאימים לכל באר.</li>
	<li>הכן 1 מ"ל של פתרון WFA (1:1,000) עם תווית ביוטין ב- PBT (2.5 מ"ל של טריטון X-100 מומס ב-1,000 מ"ל של PBS) חוצץ בצינור 1.5 מ"ל. מעבירים מקטעי מוח מסננת התא לצינור ודגר בטמפרטורת החדר על משטח נדנדה ~ 50 סל"ד לילה.</li>
	<li>לשטוף את מקטעי המוח עם PBS במשך 3 x 10 דקות כמתואר ב 3.1.</li>
	<li>הכן 1 מ"ל של פתרון סטרפטאבידין-Dylight 488 (1:500) ב- PBT בצינור 1.5 מ"ל. העבר מקטעי מוח לתוך הצינור ודגר בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות על פלטפורמת נדנדה ב ~ 50 סל"ד. הערה: לכסות את הצלחת בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור מצעד זה קדימה.</li>
	<li>יש לשטוף את מקטעי המוח ב-PBS למשך 3 x 10 דקות. לדגור על מקטעי המוח בחסימת חיץ (3% סרום חמור רגיל מדולל PBT) במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר. הערה: הבחירה של חסימת סרום נקבעת על ידי המינים שמהם נוצר הנוגדן המשני. למשל, אם הנוגדן המשני הוא מעז, יש להשתמש בסרום עזים רגיל.</li>
	<li>לדגור על מקטעי המוח בנוגדן העיקרי (ארנב נגד AVP, 1:500) בטמפרטורת החדר על פלטפורמת נדנדה ב ~ 50 סל"ד לילה. הערה: הכן נוגדנים ראשוניים ומשניים במאגר חסימה. הריכוז, משך הדגירה וטמפרטורת הדגירה צריכים להיות ממוטבים במחקרי פיילוט.</li>
	<li>יש לשטוף את מקטעי המוח ב-PBS למשך 3 x 10 דקות. לדגור את מקטעי המוח בנוגדן משני (קמח אלכסה 594 חמור נגד ארנב IgG (H + L), 1:500) בטמפרטורת החדר עבור 2 שעות על פלטפורמת נדנדה ב ~ 50 סל"ד. יש לשטוף את מקטעי המוח ב-PBS למשך 3 x 10 דקות.</li>
</ol>4. הרכבה
<ol><li>מלא שתי מנות פטרי (קוטר של 150 מ"מ) עם 100 מ"ל של 1x PBS כל אחד. מעבירים את כל מקטעי המוח מסננת אחת למנה הראשונה, ומיישרים את מקטעי המוח בסדר נוירואנטומי מ-caudal ל-rostral. הערה: כדי להימנע מערבוב קטעים מבעלי חיים שונים, הר סדרה אחת של מקטעי מוח מבעל חיים אחד בכל פעם.</li>
	<li>לאחר שכל חלקי המוח מיושרים במנה הראשונה, הטביעו שקופית אחת לתוך המנה השנייה עם קצה אחד מוטה מעט עם מעמד (ראו איור 1 ואיור 2). השתמש במברשת צבע עדינה כדי למקם בעדינות מקטע מוח ממש מתחת לממשק חיץ האוויר על השקופית המוטה. חזור על אותו הליך עם קטע מוח אחר והרכב אותו זה לצד זה עם החלק הראשון.</li>
	<li>השתמש pipette העברה לאט ובעדינות להסיר את המאגר כדי להוריד את רמתו עד ששני חלקי המוח הם לגמרי מעל ממשק חיץ האוויר. הערה: יש להקפיד למזער את ההפרעה של משטח המאגר, או שמקטעי המוח עלולים לצוף. כאשר יבש, שורה זו של מקטעי המוח תדבוק בשקופית בחוזקה. במידת הצורך, להתאים בעדינות את החלקים בשקופית כדי להבטיח שאין קמטים או קפלים ברקמה כאשר החלקים עדיין רטובים.</li>
	<li>חזור על תהליך זה עד להגעה לתחתית השקופית. המשך לחזור על הפעולה עד שכל המקטעים ייטענו על השקופיות.</li>
</ol>5. כיסויים
<ol><li>לאחר שכל החלקים התייבשו (1-24 שעות בטמפרטורת החדר), מניחים 80-100 מיקרול של מדיום הרכבה נגד דהייה עם DAPI (ראה טבלת החומרים) בשקופית, והחלו בעדינות כיסוי זכוכית כדי לכסות את הדגימות. הערה: יש למרוח את כיסוי הזכוכית בזהירות ובאיטיות כדי למנוע בועות.</li>
	<li>מקם את השקופיות בתיבת שקופית מיקרוסקופ (ראה את טבלת החומרים) ולאחסן אותם ב 4 °C (7 °F). הערה: תמונה כל הסעיפים בתוך 1-3 ימים כדי למנוע דהייה של פלואורסצנטיות ופיתוח של autofluorescence.</li>
</ol>6. הדמיה
<ol><li>הפעלת הסורק והמחשב (ראה טבלת חומרים). מקם את השקופיות במחזיק השקופיות עם התקן הטעינה והכנס את המחזיק לסורק. הערה: הסורק מאפשר סריקה של ערוצים מרובים (למשל, 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI), ערוצים ירוקים ואדומים) בו-זמנית. הסורק סורק שקופיות רק בהגדלה של פי 20, וניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מסורתי (ראה טבלת חומרים) כאשר יש צורך בהגדלה גבוהה יותר (למשל, פי 40).</li>
	<li>פתח את התוכנה עבור הסורק (עיין בטבלת החומרים). בחר את מיקום האחסון המתאים ואת פרופיל הסריקה.</li>
	<li>התחל את סריקת התצוגה המקדימה על-ידי לחיצה על לחצן התחל סריקה מקדימה . לאחר סריקת התצוגה המקדימה, פתח את אשף זיהוי הרקמות והקף את אזורי העניין להדמיה.</li>
	<li>לחץ על לחצן התחל סריקה לאחר בחירת האזורים להדמיה. המתן עד שהמכונה תסיים את הסריקה. בדוק את קובץ התוצאה וייצוא התמונות. הערה: אם הפרופיל אינו מתאים לשקופית, התאם על-ידי מיקוד מחדש ושינוי זמן החשיפה או עוצמת האור כדי להתאים את הפרופיל לרקמות. עיין בהוראות עבור הסורק לקבלת פרטים טכניים נוספים (טבלת חומרים).</li>
</ol>

<ol><li>Must, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Disease+burden+associated+with+overweight+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The Disease burden associated with overweight and obesity.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).</li>
<li>Apovian, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%3A+definition%2C+comorbidities%2C+causes%2C+and+burden%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Managed+Care%22%5BJournal%5D)">Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden.</a> The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).</li>
<li>Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+metabolic+syndrome%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Animal models of metabolic syndrome: a review.</a> Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+the+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse models of the metabolic syndrome.</a> Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).</li>
<li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Basics of immunohistochemistry.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li>
<li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMepham%2C+BL+%22Lymphoproliferative+Diseases%22">Lymphoproliferative Diseases</a>. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPH2+in+the+dorsal+raphe+nuclei+regulates+energy+balance+in+a+sex-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner.</a> Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+vitamin+D+receptor+expression+in+the+brain+using+a+novel+VDR%28Cre%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).</li>
<li>Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+embedding%2C+and+sectioning+of+tissues%2C+embryos%2C+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).</li>
<li>Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological-based+stainings+using+free-floating+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Histological-based stainings using free-floating tissue sections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622(2020).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+potassium+current+in+AgRP%2FNPY+neurons+regulates+feeding+behavior+and+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism.</a> Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+serotonin+2C+receptors+in+dopamine+neurons+inhibits+binge-like+eating+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biololgical+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice.</a> Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

פרוטוקול זה מספק שיטה מבוססת למחקרים נוירואנטומיים של מוח העכבר, כולל זלוף, חתך רקמות, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה. עם זאת, יש למטב כמה פרטים מרכזיים החיוניים לתוצאות עקביות ואמינות.
איכות הזלוף היא קריטית להכתמת מוצלחות. כתמי תוצאות עשויים להיות מושפעים אם הדם נשאר במוח, בהתחשב בכך שתאי דם (למשל, תאי דם אדומים) יכולים ליצור כתם מלאכותי 'חיובי'10. אנו מסיקים את נוכחותו של כבד חום-אפור כדי להצביע על איכות גבוהה של זלוף, אשר בדרך כלל גורם למוחות ללא דם. משאבת...

השכיחות של השמנת יתר ותחלואה נלווית הגיעה לרמות מגיפה, גרימת נטל חברתי-כלכלי עצום1,2. מודלים עכבר שונים פותחו כדי להבין טוב יותר את התהליכים הביולוגיים האחראים להשמנת יתר3,4. מכיוון שמנגנונים מרכזיים חשובים לוויסות הומאוסטזיס אנרגטי במודלים אלה של בעלי חיים, מחקרים נוירואנטומיים של מוחות עכברים הפכו לטכניקה הכרחית בתחום זה. עם זאת, האיכות, האמינות והשחזור של טכניקות היסטולוגיה במוח משתנות במידה ניכרת בין מעבדות ואפילו חוקרים באותה מעבדה מסיבות שונות (למשל, נוגדנים, רקמות, טיפולים, מינים, מטרות מחקר). לכן, יש צורך לקבוע פרוטוקול כללי למחקרים היסתולוגיים של מוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה. בינתיים, מתחילים יכולים ללמוד במהירות, לשלוט ולהתאים פרוטוקול זה כדי לספק את הצרכים האישיים שלהם.
כתמים אימונוהיסטוכימיים היא שיטה מבוססת כי נעשה שימוש נרחב כדי לדמיין סוגי תאים ספציפיים, mRNAs, וחלבונים במגוון רחב של רקמות (למשל, המוח ורקמות היקפיות)5,6. ליתר דיוק, אנטיגן של עניין יכול להיות מתויג על ידי נוגדן ראשוני מסוים נוגדן משני מתאים מקושר אנזים (למשל, אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית) או צבע פלואורסצנטי (פלואורסצין איזוטיוצינט)6. כדוגמה לתועלת של טכניקות אלה, β-אנדורפין [פפטיד אחד מקודד על ידי פרו-אופיומלאנוקורטין (POMC)] ו- c-fos (סמן של פעילות עצבית) הוכתמו בגרעין הארקואט. מחיקה של טריפטופן הידרוקסילאז 2 (אנזים אינטגרלי לסינתזת סרוטונין) בגרעין raphe גבית תורסאלי הוכח להקטין ביטוי c-fos נוירונים POMC בגרעין arcuate7. בנוסף, ההפצה של mRNA קולטן ויטמין D מופה במוח העכבר באמצעות הכלאה במקום (RNAscope)8. מאמר זה מציג שיטה אמינה ויעילה עם זרימת עבודה שלב אחר שלב עבור חיסון צף חופשי, במטרה לשפר את האיכות ואת הרבייה של מחקרים היסטולוגיים של מוח העכבר.

<table><tbody><tr><td>קמח אלקסה 594 חמור נגד ארנב IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 30% סוכרוז</td><td>VWR</td><td>470302</td><td>30 גרם סוכרוז מפוזר ל-100 מ"ל PBS</td></tr><tr><td>&nbsp; פורמלין ניטרלי חוצץ</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td>10%, 25 & מעלות; C, pH 6.8-7.2</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק Sub-Q BD</td><td></td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>48 באר צלחת תרבית תאים</td><td>קורנינג</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 6 באר</td><td>קורנינג</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>אמצעי הרכבה נגד דהייה עם</td><td>DAPI Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>מייבש פלסטיק הניתן לחיטוי</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן AVP</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>H-065-07</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>קורנינג</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>מאגר Cryoprotectant</td><td>העדפת משתמש</td><td>לא ישים</td><td>20% גליצרול, 30% אתילן גליקול ו-50% PBS</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Covetrus</td><td>11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ DFC310FX Leica</td><td>Leica</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>קופסאות שקופיות מיקרוסקופ (50 מקומות)</td> <td>VWR</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>PBT</td><td>העדפת משתמש</td><td>לא ישים</td><td>2.5 מ"ל של טריטון X-100 מומס לתוך 1000 מ"ל של PBS</td></tr><tr><td>זלוף שתי מערכת זלוף אוטומטית</td><td>Leica</td><td>39471005</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) 20x</td><td>VWR</td><td>VWRVE703-1L</td><td>25 & deg; C, pH 7.3-7.5, הרכב 1x: 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 9.8 מ"מ מאגר פוספט</td></tr><tr><td>החלקה מיקרוטום מיקרום HM450</td><td>ThermoFisher</td><td>Microm HM450</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>RICCA כימי</td><td>7220-32</td><td>0.9%, 25 & מעלות; C, pH 7.4</td></tr><tr><td>חלבון סטרפטווידין, DyLight 488</td><td>ThermoFisher</td><td>#21832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>089k01921</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן WFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1516</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Z1 Scanner</td><td>Zeiss</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת סורק</td> <td>תוכנת Zen 3.1</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

חיסון חופשי של מוחות עכבר

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

הכתמת אימונוהיסטוכימית של מוחות עכברים היא טכניקה שגרתית הנפוצה במדעי המוח כדי לחקור מנגנונים מרכזיים שבבקרה את ויסות חילוף החומרים של האנרגיה ותהליכים נוירוביולוגיים אחרים. עם זאת, האיכות, האמינות והשחזור של תוצאות היסטולוגיה במוח עשויות להשתנות בין מעבדות. עבור כל ניסוי מכתים, יש צורך לייעל את ההליכים העיקריים המבוססים על הבדלים בין מינים, רקמות, חלבונים ממוקדים ותנאי העבודה של ריאגנטים. מאמר זה מדגים זרימת עבודה אמינה בפירוט, כולל זלוף תוך-בתחום, חתך מוחי, חיסון צף חופשי, הרכבת רקמות והדמיה, אשר ניתן לעקוב בקלות על ידי חוקרים בתחום זה.
כמו כן נדונים כיצד לשנות נהלים אלה כדי לספק את הצרכים האישיים של החוקרים. כדי להמחיש את האמינות והיעילות של פרוטוקול זה, רשתות פרינורונאליות הוכתמו עם ביוטין תווית ויסטריה florbunda agglutinin (WFA) ו ארגינין וזופרסין (AVP) עם נוגדן אנטי AVP במוח העכבר. לבסוף, הפרטים הקריטיים עבור ההליך כולו טופלו, ואת היתרונות של פרוטוקול זה לעומת אלה של פרוטוקולים אחרים. יחד, מאמר זה מציג פרוטוקול ממוטב לחיסון חופשי של רקמת מוח העכבר. בעקבות פרוטוקול זה מקל על מדענים זוטרים ובכירים כאחד לשפר את האיכות, האמינות והשחזור של מחקרים חיסוניים.

תרשים הזרימה של פרוטוקול זה מומחש בקצרה באיור 1. הליך ההקפאה של מעבדה זו מוצג באיור 2A, שבו 5 דגימות מוח נותחו בו זמנית. ההרכבה של מקטעי המוח מוצגת באיור 2B, ושקופית המותקנת במלואה עם מקטעי מוח מודגמת באיור 2C. באיור 3, תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של מקטע מוח עכבר עם כתמים משותפים של WFA ו-AVP בהגדלה נמוכה וגבוהה יותר ב-Bregma -0.82 מ"מ. אותות AVP נצפו בגרעין הפרונטרי ובגר...

פרוטוקול זה מתאר גישה יעילה וניתנת לשחזור למחקרים היסתולוגיים במוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה.

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

הכתמת מוחות אימונו-היסטוכימית של מוחות עכברים היא טכניקה נפוצה במחקר מדעי המוח. עם זאת, האיכות, האמינות והשחזור של תוצאות היסטולוגיה במוח עשויות להשתנות בין חוקרים ומעבדות שונות. אנו מציגים מתודולוגיה מבוססת למחקרים היסתולוגיים של מוחות עכברים שהוכחו כניתנים לשחזור, אמינים ויעילים.עוזר להדגים את ההליך יהיה ד"ר Chunmei וואנג, פרופסור עוזר מהמעבדה שלי לאחר אישור המרדים מוצלחת שמונה עד 16 שבועות C57 שחור / 6J עכבר, לתקן את העכבר על לוח קצף ולעשות קיסך שטחי אורך לאורך קו האמצע מעל בית החזה והבטן, ולאחר מכן להזיז את העור הצידה כדי לחשוף את דופן השריר של בית החזה והבטן. לאחר מכן, לעשות נתק בשכבת השריר כדי לחשוף את הכבד ואת המעי. לאחר מכן, באמצעות מספריים, לחתוך את בית החזה כדי לפתוח את בית החזה ולחשוף את הלב והריאות.באמצעות מלקחיים hemostatic, למשוך את בית החזה הצידה כדי להרחיב את אזור העבודה. הבא. כדי למקם צינורית זלוף, לחדור ישירות את חדר הלב השמאלי עם צינורית קהה ולהכניס אותו בזהירות לתוך ביש"ט עולה. מניחים סיכות סביב השילוב של הצינורית וצינורות מצמידים על לוח הקצף כדי לתקן את הצינורית במקום במהלך זלוף, ולהמשיך לחתוך את האטריום הנכון כדי לאפשר את זרימת הדם מהמחזור.עבור זלוף עם תמיסת מלח, להפעיל את מתג לחץ מלוחים ולפרוט את העכבר עירוי עם 40 עד 60 מיליליטר של מלוחים. שימו לב לזרימה מהאטריום הימני ולצבע הכבד מקרוב. לאחר מכן, כדי לטבול עם פורמלין, לכבות את מתג לחץ מלוחים ולהדליק את מתג הלחץ פורמלין כדי לחדיר את העכבר עם 40 מיליליטר של 10% פורמלין ניטרלי חוצץ.התבונן בגפיים של החיה לראיות לרעידות. לבידוד המוח, השתמש במספריים כדי להסיר את הראש ולבצע חתך בקו האמצעי לאורך החתך כדי לחשוף את הגולגולת, ואז לקצץ את העור ואת ההתקשרות עם השריר. לאחר מכן, לעשות לחתוך ברכס מסלולית ומניחים את הקצה החד של מספריים קשתית לתוך מגנום foramen.לקדם את המספריים לאורך פני השטח הפנימיים של הגולגולת, שמירה על לחץ כלפי מעלה כדי למנוע נזק למוח. לאחר מכן, הסר בזהירות את העצמות הקודקודיות והחזיתיות וקרום המוח לפני הסרת המוח מהגולגולת הפתוחה. מניחים קרח יבש על גבי צלחת התאמת הגובה של מיקרוטומיה הזזה ולחכות עד כפור לבן גלוי, ולאחר מכן בזהירות להפיץ חמישה מיליליטר של 30% סוכרוז על גבי הצלחת כדי ליצור שכבת בסיס מוצקה לאחר סוכרוז קפא.לאחר מכן, מקם את כל דגימות המוח אופקית בשורה על גבי בסיס סוכרוז עם 500 מיקרוליטרים של 30%סוכרוז. לאחר חמש עד 10 דקות של הקפאה, כאשר המוח הפך קשה ולבן, לקצץ את המוח עד השכבה או האזור הרצוי הוא הגיע, ולאחר מכן, לעבור ממצב חיתוך למצב ההזנה ורקמת המוח סעיף כדי ליצור קטעים בעובי 25 מיקרומטר. לאחר מכן, הכינו צלחת 48 באר מלאה PBS ולסמן חמש בארות למוח עכבר אחד.באמצעות מברשת צבע, לאסוף קטע אחד ולהניח אותו לתוך באר אחת, ולאחר מכן לאסוף את החלק הבא של אותו עכבר ומניחים אותו לתוך הבאר השנייה. חזור על ההליך עד שהבאר החמישית תגיע להציב את סעיפים 6 עד 10 בבאר הראשונה עד החמישית, וכן הלאה. מניחים מסננת תאים לתוך באר אחת של צלחת תרבית תאים של ששת בארות מלאה PBS, באמצעות מברשת צבע, להעביר סדרה אחת של מקטעי מוח לתוך מסננת התא.לשטוף את החלקים האלה PBS על ידי העברת מסננת התא אחר מלא PBS על שייקר. לאחר מכן, להעביר את מקטעי המוח מן מסננת התא לתוך צינור 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של WFA תווית ביוטין ודגרה על פלטפורמת נדנדה ב 50 סל"ד לילה. למחרת, לשטוף את קטעי המוח עם PBS כפי שהוכח בעבר, ולאחר מכן להעביר את החלקים לתוך צינור המכיל מיליליטר אחד של פתרון סטרפטאבידין-אור יום 488 ודגרה במשך שעתיים על פלטפורמת נדנדה.לאחר שטיפה של חלקי המוח עם PBS שוב, לדגור אותם חוצץ חסימה במשך שעתיים, ואחריו דגירה בנוגדן העיקרי לילה על פלטפורמת נדנדה. למחרת, לאחר שטיפות PBS, לדגור את החלקים בנוגדן משני במשך שעתיים. מלא שתי מנות פטרי עם 100 מיליליטר של PBS ולהעביר את כל חלקי המוח מסננת אחת לתוך המנה הראשונה.יישר את מקטעי המוח בסדר נוירואנטומי מ caudal ל rostral. לאחר מכן, הטביעו שקופית אחת לתוך המנה השנייה כשקצה אחד מוטה מעט במעמד, ובאמצעות מברשת צבע עדינה, הניחו בעדינות מקטע מוח ממש מתחת לממשק חיץ האוויר על המגלשה המוטה. לאחר מכן, באמצעות pipette העברה, לאט ובעדינות להסיר את המאגר כדי להוריד את רמתו עד החלק המוח הוא לחלוטין מעל ממשק חיץ האוויר.המשך לחזור על תהליך זה עד להגעה לתחתית השקופית וכל המקטעים נטענים על השקופית. להדמיה, הפעל את הסורק והמחשב ולאחר מכן מקם את השקופיות במחזיק השקופית עם התקן הטעינה והכנס את המחזיק לסורק. פתח את התוכנה עבור הסורק ובחר את מיקום האחסון ופרופיל הסריקה המתאימים.התחל את סריקת התצוגה המקדימה על-ידי לחיצה על לחצן התחל סריקה מקדימה. לאחר הסריקה, פתח את אשף זיהוי הרקמות והקף את אזורי העניין להדמיה. לאחר בחירת האזורים להדמיה, לחץ על לחצן התחל סריקה והמתן עד שהמכונה תסיים את הסריקה.בדוק את קובץ התוצאה וייצוא התמונות. מוצגות כאן תמונות פלואורסצנטיות מייצגות אימונו-היסטוכימיה של מקטעי מוח עכבר קורונלי ב Bregma-מינוס 0.82 מילימטרים, המציגים את ההפצה של ויסטריה פלוריבונדה אגלוטינין, ארגינין וזופרסין ו- DAPI. ויסטריה floribunda agglutinin אותות נצפים באזור perifornical של ההיפותלמוס הזעיר גרעין הרשתית, ואילו אותות ארגינין וזופרסין נצפים בגרעין paraventricular.כאשר מנסים פרוטוקול זה בפעם הראשונה, אנו מציעים לבצע אותו תחת פיקוחו של חוקר מנוסה. הפרוטוקול יסייע בהפקת תוצאות היסתולוגיות אופטימליות ועקביות בקרב חוקרים ומעבדות שונות, וישמש התייחסות למתחילים הלומדים טכניקה זו.

free-floating-immunostaining-of-mouse-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בקנה מידה גדול immunodetection של חלבונים יעד ברחבי המוח הפרימטים כולו ניתן על ידי העסקת רקמה רומן הטבעה וכן חתך שיטות בשילוב עם השימוש במנגנון יצירתיים מכתים אצווה של ריחוף ללא מקטעים מרובים בכל זמן נתון.

אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים

סרטון זה מדגים את ההליך לצביעה חיסונית של קטע קבוע של רקמת מוח של עכבר עם אסטרוציטים מסומנים פלואורסצנטיים באמצעות נוגדנים ראשוניים ומשניים ולכידת התמונות של האסטרוציטים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

צביעה חיסונית של אסטרוציטים בעלי תווית פלואורסצנטית בקטע רקמת מוח של עכבר

מקור: Schönherr, S., et. al. תיוג אימונולוגי משולב של העתק אופטוגנטי ושבר הקפאה כדי לבחון סידור ספציפי לקלט של קולטני גלוטמט באמיגדלה של העכבר. J. Vis. exp. (2016)סרטון זה מדגים את התיוג החיסוני של העתקים שבורים בהקפאה של רקמת מוח עכבר למיקרוסקופ אלקטרונים. ההעתקים השבורים והמצופים מתעכלים כדי לחשוף קולטנים. נוגדנים משניים ראשוניים ובעלי תווית זהב מתווספים כדי לסמן קולטנים ספציפיים של ממברנה עצבית. ההעתק מותקן על רשת ומוצג תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.

תיוג חיסוני של חלבוני ממברנה עצבית בדגימה שסועה בהקפאה של רקמת מוח של עכבר

מקור: Baleriola, J., et. al., זיהוי mRNAs מקומיים אקסונליים בחלקי מוח באמצעות הכלאה ברזולוציה גבוהה באתר.  J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את זיהוי ה-mRNA בתוך אקסונים כולינרגיים בפרוסות היפוקמפוס קבועות של עכבר באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרה וצביעת נוגדנים. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חושפת את הלוקליזציה המרחבית של mRNAs מתויגים בבדיקה וכולין אצטילטרנספראז בנוירונים כולינרגיים.

צביעה חיסונית של נוירונים בפרוסות מוח של עכבר בעקבות הכלאה פלואורסצנטית באתרה

פרוטוקול רמת מבוא זה מתאר את הריאגנטים, הציוד והטכניקות הנדרשים להשלמת צביעה אימונוהיסטוכימית של מוחות מכרסמים, תוך שימוש בסמנים למיקרוגליה ואלמנטים עצביים כדוגמה.

פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים

כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ', ' מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

הסעה משופרת (משלוח) היא שיטה המאפשרת אספקה אפקטיבית של therapeutics למוח על ידי הפרזיה ישירה של כרכים רקמות גדולות. ההליך מחייב שימוש בקטטרים ובהליך הזרקה ממוטב. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה עבור הודעת הנוגדן למוח העכבר.

מסירת נוגדנים למוח מורנה באמצעות הסעה-משלוח משופר

פרוטוקול זה מתאר את תהליך העבודה צעד אחר צעד עבור אימונוofluoroocoooooooiood של IBA1 ו TMEM119, בנוסף ניתוח של צפיפות microglial, הפצה, מורפולוגיה, כמו גם חדירת תאים מיאלואידית היקפית ברקמת המוח העכבר.

Immunofluorescence צביעת באמצעות IBA1 ו TMEM119 עבור צפיפות Microglial, מורפולוגיה וניתוח הסתננות מיאלואידית תא היקפית במוח העכבר

טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, לב וכבד.

כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

למד שיטת חיסון חופשי של מוחות עכבר לחקר נוירואנטומיה ותבניות ביטוי חלבונים. פרוטוקול זה מספק תוצאות היסטולוגיות איכותיות ומהימנות למחקר עצבים.

חיסון חופשי של מוחות עכבר

גלה סרטונים נוספים