Name: סינתזה ואפיון של חלקיקי פולי (בטא אמינואסטרים) טעונים mRNA למטרות חיסון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: למד סינתזה של חלקיקי ננו פולימריים לשחרור mRNA באמצעות פולי(בטא אמינואסטרים). השיטה מאפשרת הכלה יעילה של חומצות גרעין בצעד אחד פשוט ליישומי חיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה כספית מ- MINECO /FEDER (מענקים SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 ו- COV20/01100) מוכרת. CGF הודתה מלגת IQS הדוקטורט שלה.

<ol><li>Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+existing+live+vaccines+prevent+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Can existing live vaccines prevent COVID-19.</a> Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).</li>
<li>Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+mRNA+vaccines+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances in mRNA vaccines for infectious diseases.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).</li>
<li>Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+did+we+get+a+COVID-19+vaccine+in+less+than+1+year%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year.</a> Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).</li>
<li>Folegatti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+the+ChAdOx1+nCoV-19+vaccine+against+SARS-CoV-2%3A+a+preliminary+report+of+a+phase+1%2F2%2C+single-blind%2C+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial.</a> The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).</li>
<li>Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA%3A+The+new+revolution+in+nucleic+acid+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines.</a> Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).</li>
<li>Ulmer, J. B., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+innovations+in+mRNA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent innovations in mRNA vaccines.</a> Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).</li>
<li>Kranz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNA+delivery+to+dendritic+cells+exploits+antiviral+defence+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy.</a> Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).</li>
<li>Milane, L., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+approval+of+nanotechnology-based+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines%3A+impact+on+translational+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery+and+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine.</a> Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3(2020).</li>
<li>Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+polymer+library+approach+yields+insight+into+nonviral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).</li>
<li>Guerrero-Cázares, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+show+high+efficacy+and+specificity+at+DNA+delivery+to+human+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo.</a> ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).</li>
<li>Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreducible+cationic+polymer-based+nanoparticles+for+efficient+and+environmentally+triggered+cytoplasmic+siRNA+delivery+to+primary+human+brain+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells.</a> ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).</li>
<li>Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligopeptide-terminated+poly%28%CE%B2-amino+ester%29s+for+highly+efficient+gene+delivery+and+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).</li>
<li>Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+tunability+as+a+powerful+strategy+to+control+electrostatic+interaction+for+high+efficiency+silencing%2C+using+tailored+oligopeptide-+modified+poly+%28beta-amino+ester%29s+%28PBAEs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs).</a> Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).</li>
<li>Fornaguera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+delivery+system+for+targeting+antigen-presenting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033(2018).</li>
<li>Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. Á, Cascante, A., Borrós, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+optimized+freeze-drying+protocol+for+OM-PBAE+nucleic+acid+polyplexes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes.</a> International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).</li>
<li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+to+characterize+and+purify+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles.</a> International Journal of Polymer Science. , (2018).</li>
<li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+polymeric+nanoparticle+dispersions+for+biomedical+applications%3A+size%2C+surface+charge+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability.</a> Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).</li>
<li>Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).</li>
<li>Fan, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-assisted+nanoparticles+for+delivery+of+mRNA+cancer+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine.</a> Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).</li>
<li>Le Moignic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+mRNA+trimannosylated+lipopolyplexes+as+therapeutic+cancer+vaccines+targeting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells.</a> Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).</li>
<li>Banerji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+vaccines+to+prevent+COVID-19+disease+and+reported+allergic+reactions%3A+Current+evidence+and+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%3A+In+Practice%22%5BJournal%5D)">mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).</li>
<li>Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+delivery+of+RNA+therapeutics%3A+from+concept+to+clinical+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality.</a> Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).</li>
<li>Dosta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+anti-microRNA-712+to+inflamed+endothelial+cells+using+poly%28%CE%B2-amino+ester%29+nanoparticles+conjugated+with+VCAM-1+targeting+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide.</a> Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).</li>
<li>Segovia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+doped+with+nanoparticles+for+local+sustained+release+of+siRNA+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף או כל ניגודי אינטרסים.

לאחר פרוץ מגפת Covid-19 בשנה שעברה, החשיבות של חיסונים במונחים של בקרת מחלות זיהומיות באה לידי ביטוי כמרכיב קריטי8. מאמצי מדענים ברחבי העולם אפשרו את שחרורם לשוק של חיסונים רבים. בפעם הראשונה בהיסטוריה, חיסוני mRNA הוכיחו את הצלחתם המשוערת בעבר, הודות לעיצוב המהיר שלהם בגלל יכולתם להסתגל לכל אנטיגן חדשני בתוך כמה חודשים5,6,21. mRNA, או חומצה ריבונוקלאית שליח, מתייחס חומצות גרעין המניעים סינתזת חלבון ממידע...

מחלות זיהומיות מהוות איום חמור על מיליוני בני אדם ברחבי העולם, והן עדיין אחד הגורמים המובילים למוות בכמה מדינות מתפתחות. חיסון מניעתי היה אחת ההתערבויות היעילות ביותר של החברה המודרנית כדי למנוע ולשלוט במחלות זיהומיות1,2. אבני דרך קריטיות אלה של המדע ברלוונטיות של המאהה-20 נאמרו על ידי מגיפת Covid-19 העולמית האחרונה שנגרמה על ידי נגיף SARS-CoV-23. מתוך הכרה בחשיבות של חיסונים יעילים לצמצום הפצת המחלה, מאמצי שיתוף פעולה מכל הקהילות הביו-רפואיות הביאו בהצלחה לחיסונים מניעתיים רבים בשוק תוך פחות משנה4.
באופן מסורתי, חיסונים היו מורכבים מווירוסים מוחלשים (חיים, הפחתת ארס) או מומתים (חלקיקי מוות). עם זאת, עבור מחלות מסוימות ללא מרווח לשגיאות בטיחות, חלקיקים ויראליים אינם אפשריים, ו- subunits חלבון משמשים במקום. עם זאת, subunits בדרך כלל לא מאפשר שילוב של יותר אפיטופ אחד / אנטיגן, ואדג'ובנטים נדרשים כדי לשפר את עוצמת החיסון5,6. לכן, הצורך בסוגי חיסונים חדשניים ברור.
כפי שהוכח במהלך המגפה הנוכחית, מועמדים חדשים לחיסון המבוססים על חומצות גרעין יכולים להיות יתרון מבחינת הימנעות מתהליכי פיתוח ארוכים ומתן רב-תכליתיות גבוהה תוך ייצור, במקביל, חיסון חיוני למטופל. זהו המקרה של חיסוני mRNA, שתוכננו בתחילה כחיסונים ניסיוניים לסרטן. הודות ליכולת הטבעית שלהם לייצר תגובות תאי T ספציפיות אנטיגן3,5,6,7. בהיותה mRNA המולקולה המקודדת את החלבון האנטיגני, רק משתנה זהה, ניתן להתאים את החיסון במהירות כדי לחסן וריאנטים אחרים של אותו מיקרואורגניזם, זנים שונים, מיקרואורגניזמים זיהומיים אחרים, או אפילו להפוך לטיפול אימונותרפי לסרטן. בנוסף, הם יתרון במונחים של עלויות ייצור בקנה מידה גדול. עם זאת, ל-mRNA יש משוכה משמעותית המעכבת את הממשל העירום שלהם: יציבותו ויושרו נפגעות בתקשורת הפיזיולוגית, מלאות גרעין. מסיבה זו, השימוש במנשא ננומטרי שמגן עליו וקטורינג mRNA לתאים המציגים אנטיגן נדרש2,8.
בהקשר זה, פולי (אמינו בטא) (pBAE) הם סוג של פולימרים ביו-תואמים ומתכלים שהפגינו יכולת יוצאת דופן ל-mRNA מורכב בחלקיקים ננומטריים, הודות למטענים הקטיים שלהם9,10,11. פולימרים אלה מורכבים קשרים אסתר, מה שהופך את השפלתם קלה על ידי אסטראזות בתנאים פיזיולוגיים. בין המועמדים לספריית pBAE, אלה שתפקדו עם אוליגופפטידים קטיקטיים בסופו הראו יכולת גבוהה יותר ליצור חלקיקים קטנים לחדור ביעילות לתאים באמצעות אנדוציטוזיס ולהדביק את חומר הגן encapsulated. יתר על כן, הודות ליכולת האגירה שלהם, החמצת התא אנדוזום מאפשרת בריחה אנדוזומית12,13. כלומר, סוג מסוים של pBAE, כולל עגבת הידרופובית על עמוד השדרה שלהם (מה שנקרא C6 pBAE) כדי לשפר את היציבות שלהם ואת השילוב הסופי-אוליגופפטידים (60% של פולימר שונה עם תלת ליצין ו 40% של הפולימר עם tri-histidine) כי באופן סלקטיבי טרנסקלציה אנטיגן מציג תאים לאחר ניהול parenteral לייצר את מצגת אנטיגן מקודד mRNA ואחריו חיסון עכברים פורסם לאחרונה14 . בנוסף, הוכח גם כי ניסוחים אלה יכולים לעקוף את אחד השלבים צוואר הבקבוק העיקרי של ניסוחים nanomedicine: האפשרות להקפיא לייבש אותם מבלי לאבד את הפונקציונליות שלהם, המאפשר יציבות לטווח ארוך בסביבות יבשותרכות 15.
בהקשר זה, מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להפוך את ההליך להיווצרות חלקיקי mRNA לזמינים לקהילה המדעית על ידי מתן תיאור הצעדים הקריטיים בפרוטוקול ומאפשר ייצור חיסונים יעילים ליישומים למניעת מחלות זיהומיות וטיפול בגידולים.
הפרוטוקול הבא מתאר את האימון המלא לסנתז אוליגופפטיד שינוי קצה פולי (אמינו בטא) - פולימרים OM-pBAE שישמשו עוד יותר עבור סינתזה ננו-חלקיקים. בפרוטוקול, ניסוח ננו-חלקיקים כלול גם. בנוסף, ניתנים גם צעדים קריטיים להצלחת ההליך והתוצאות הייצוגיות כדי להבטיח שהניסוחים המתקבלים ישיגו את תכונות אפיון בקרת האיכות הנדרשות כדי להגדיר תוצאה חיובית או שלילית. פרוטוקול זה מסוכם באיור 1.

<table><tbody><tr><td>1,4-בוטנדיול דיאקרילט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>123048</td><td></td></tr><tr><td>1-הקסילאמין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>219703</td><td></td></tr><tr><td>5-אמינו-1-פנטנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>411744</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>Panreac</td><td>141007</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן CD11b BD</td><td></td><td>550993</td><td></td></tr><tr><td>CD86 נוגדן</td><td>Bioligend</td><td>105007</td><td></td></tr><tr><td>כלור הידרוקסייד</td><td>Panreac</td><td>181023</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם-d</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>151823</td><td></td></tr><tr><td>Cys-his-his-his פפטיד</td><td>Ontores</td><td>מותאם אישית</td><td></td></tr><tr><td>Cys-Lys-Lys-Lys פפטיד</td><td>Ontores</td><td>מותאם אישית</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>מגיב DEPC למים ללא רנאז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D5758</td><td>מגיב זה חשוב לטיפול במי MilliQ כדי להסיר כל RNases של המאגרים</td></tr><tr><td>דיאתיל אטר</td><td>Panreac</td><td>212770</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>mRNA EGFP</td><td>TriLink Technologies</td><td>L-7601</td><td></td></tr><tr><td>mRNA OVA</td><td>TriLink טכנולוגיות</td><td>L-7610</td><td></td></tr><tr><td>RiboGreen kit</td><td>ThermoFisher</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA</td><td>פישר</td><td>11570626</td><td></td> מדעי</tr> <tr><td>ואלפא;- עכבר AlexaFluor488 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>Ab450105</td><td></td></tr> <tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ננו-חלקיקים מנתח מעקב אחר חלקיקים</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoSight NS300</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר רסוננס מגנטי גרעיני</td><td>Varian</td><td>400 MHz</td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Nano ZS</td><td>עבור פוטנציאל זטה ו קביעת גודל הידרודינמי<</td></tr><tr><td>חזק>תוכנה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight תוכנת NTA</td><td>Malvern Panalytical</td><td>MAN0515-02-EN-00</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpress Software</td><td>Agilent</td><td>לא צוין</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ZetaSizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>DTS Application</td><td>לניתוח מטען פני השטח וגדלים הידרודינמיים</td></tr></tbody></table>

סינתזה ואפיון של חלקיקי פולי (בטא אמינואסטרים) טעונים mrna למטרות חיסון

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes

חיסון היה אחת ההצלחות הגדולות של החברה המודרנית והוא הכרחי בשליטה ומניעת מחלות. חיסונים מסורתיים היו מורכבים מכל או שברים של חומר זיהומיות. עם זאת, האתגרים נותרו, וטכנולוגיות חיסונים חדשות הן חובה. בהקשר זה, השימוש ב- mRNA למטרות חיסון הראה ביצועים משופרים, כפי שהוכח באישור מהיר של שני חיסוני mRNA המונעים זיהום SARS-CoV-2. מעבר להצלחה במניעת זיהומים ויראליים, חיסוני mRNA יכולים לשמש גם ליישומי סרטן טיפוליים.
עם זאת, חוסר היציבות של mRNA ואת הסיווג המהיר שלה מהגוף בשל נוכחות של גרעינים עושה את המסירה העירומה שלה לא אפשרי. בהקשר זה, ננו-רפואה, ובמיוחד חלקיקים פולימריים, הן מערכות מסירה קריטיות של mRNA. לכן, מטרת מאמר זה היא לתאר את הפרוטוקול לגיבוש ובדיקה של מועמד לחיסון mRNA המבוסס על חלקיקים פולימריים קנייניים. הסינתזה והאפיון הכימי של פולי (בטא אמינואסטרים) פולימרים המשמשים, המורכבות שלהם עם mRNA כדי ליצור חלקיקים, ומתודולוגיית lyophilization שלהם יידונו כאן. זהו צעד מכריע להפחתת עלויות האחסון וההפצה. לבסוף, הבדיקות הנדרשות כדי להפגין את יכולתם במבחנה transfect ומודל בוגר תאים דנדריטיים יצוינו. פרוטוקול זה יועיל לקהילה המדעית העובדת על חיסון בשל הרבגוניות הגבוהה שלו המאפשרת לחיסונים אלה למנוע או לרפא מגוון רחב של מחלות.

סינתזה ואפיון פולימרים הליך הסינתזה של OM-pBAE ניתן באיור 2. כפי שמראה איור 2A, הצעד הראשון להשגת ה-OM-pBAE הוא לסנתז את ה-C6-pBAE על ידי הוספת האמינים (1-הקסילאמין ו-5-אמינו-1-פנטנול, יחס 1:1) ל-diacrylate (1,4-בוטנדיול ניאקרילט). תגובה זו מתבצעת ב 90 °C (50 °F) במשך 20 שעות עם ערבוב מתמיד. לאחר מכן, פתרון של אוליגופפטידים מתווסף לפתרון של פולימר C6 המתקבל מהתגובה הקודמת (איור 2B). לבסוף, הסינתזה מתבצעת באמצעות ...

כאן, פרוטוקול פשוט מוצג לייצור חלקיקי mRNA המבוססים על פולי (בטא אמינואסטר) פולימרים, קל להתאמה על ידי שינוי mRNA אנקפסולציה. זרימת העבודה לסינתזה של הפולימרים, הננו-חלקיקים והאפיון החיוני שלהם מתוארים גם הם. כמו כן מתווספת הוכחת תפיסה בנוגע לחיסון.

סינתזה ואפיון של חלקיקי פולי (בטא אמינואסטרים) טעונים mRNA למטרות חיסון

Vaccination has been one of the major successes of modern society and is indispensable in controlling and preventing disease. Traditional vaccines were ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי הוא מדגים, כיצד להכין חלקיקים פולימריים, חומצות גרעין אנקפסולציה בצעד אחד פשוט. היתרונות העיקריים של טכניקה זו, הם צדדיות, כפי שהוא יכול להיות מיושם על חומצות גרעין וסוגי תאים שונים. השימוש בהליכים פשוטים להכנת חלקיקים, כגון צנרת למעלה ולמטה, ואת האפשרות להרחיב את היציבות של חלקיקים ותנאי תוף על ידי ליופיליזציה.מי שידגימו את ההליך יהיו לורה אולמו, קורל גרסיה-פרננדז, מריה סטמפה לופז-פינטו ומריה נבאלון-לופז, דוקטורנטית במעבדה שלנו ומרתה דיאז-קבלרו, פוסט-דוקטורט במעבדה שלנו. להיווצרות פוליפלקסים, הפשירו את הפולימרים שהוכנו בעבר, פפטיד C6, אסטרים פולי בטא אמינו, ומערבולת הפתרון. לאחר צנרת תערובת הפולימר למעלה ולמטה, להכין פתרון 12.5 מילימולר נתרן אצטט.מערבולת הפתרון ולחכות 10 דקות. לאחר מכן, להכין mRNA ב 0.5 מיליגרם למיליליטר מעורבב על ידי pipetting. מערבולת את הפתרון הפולימרי שוב, ואז לערבב את הפתרון החומרי הגנטי בתמיסת הפולימר ביחס של אחד לאחד בצינור צנטריפוגה מיקרו ודגורת הצינור ב 25 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בתרמובלוק.לאחר הדגירה לזרז את התערובת עם אחד עד שני מים חינם RNase על ידי הוספת המדגם צינור צנטריפוגה מיקרו המכיל את המים, ולאחר מכן לכלול את excipients, להוסיף ערימות 20 מילימולר 4% תמיסת סוכרוז באותו נפח כמו תערובת של אסטרים אמינו mRNA ופולי בטא, מעורבב על ידי pipetting. עבור Lyophilization לאחר הקפאת פתרון polyplex במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, לבצע את הייבוש העיקרי, ולאחר מכן מיד לאחסן את polyplexes במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי למנוע התייבשות. עבור resuspension polyplex, להסיר את ננו-חלקיקים ליופילי ממקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס ולהוסיף במהירות את הכמות המתאימה של מים מוקשים עמוקים כדי לפזר מחדש את המוצק והשיג את הריכוז הרצוי.פיפטה בעדינות עד לחידוש מוחלט ופעם מומסת, פיפטה למעלה ולמטה במרץ הימנעות בועות. לאחר 24 שעות של טרנספקטציה להערכה איכותית על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הנח את צלחת 96 הבאר המכילה את תאי הלה שהודבקו על המיקרוסקופ והתחל לדמיין באמצעות המטרה 10 פעמים. ראשית, להחיל איזון לבן כדי ליצור הפניית רקע עבור התוכנה, ולאחר מכן לרכוש תמונה כדי לכסות אותו עם תמונת פלואורסצנטיות במהלך הניתוח.שנה את מצב המיקרוסקופ למצב השתקפות והזז את גלגל המסנן ללייזר הכחול כדי לדמיין EGFP. לאחר מכן לרכוש תמונות עבור כל התנאים או בארות המעסיקים את אותו זמן חשיפה. להערכה כמותית על ידי ציטומטריית זרימה, לשטוף את תאי Hela transfected בצלחת 96 היטב באמצעות 100 microliters של PBS לבאר.לאחר שאיפה PBS ב 25 microliters של טריפסין לבאר ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר שהתאים מנותקים, הוסף את המדיה ששוחזרה בעבר כדי לנטרל את טריפסין, ולאחר מכן לתקן את התאים על ידי הוספת 31.25 microliters של 10% פורמלין לבאר ודגרה במשך 20 דקות. הבא להפעיל את cytometer הזרימה ואת התוכנה, ולאחר מכן להגדיר את התנאים המתאימים עבור הניסוי, כולל סוג של נפח דגימת צלחת ופרמטרים אחרים כגון רועד ושטיפה בין דגימות.הגדר את הפרמטרים המתאימים כדי לכמת את אחוז התאים שהועברו באופן חיובי על-ידי הצגת נתוני הזרימה באור מפוזר קדימה לעומת אור מפוזר בצד כדי להבחין בין התאים לבין הפסולת. ואז מתווים עוד פיזור, משווים את המשרעת לעומת הגובה לשער ומפלים תאים בודדים. יום אחד לפני ההדבקה, צלחת 10, 000 תאי JAWS II לבאר בצלחת 96 באר לדגירה בין לילה.למחרת להדביק את התאים עם 0.6 מיקרוגרם mRNA לבאר ולדגירה את הצלחת במשך 24 שעות בחממה אוויר יבש ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת, לשטוף את התאים שנותרו בבאר עם 25 microliters של PBS. לאחר שאיפה PBS ב 25 microliters של טריפסין ודגורת הצלחת במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס לנתק את התאים.הפסק את תגובת טריפסין על-ידי הוספת המדיה שנמצאה בעבר לבאר הכתב. לאחר מכן צנטריפוגה הצלחת, לשאוף את התקשורת, ולתקן את התאים על ידי הוספת 50 microliters של PBS ו 2.5% פורמלין לבאר ואחריו דגירה הלוח בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, צנטריפוגה הצלחת. לאחר מכן להוסיף 50 microliters של PBS ו 3%BSA לבאר אינקובטור במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר דגירה צנטריפוגה הצלחת שוב, ולאחר מכן להוסיף 50 microliters של נוגדן אליבבומין העכבר PBS ו 3%BSA אינקובטור במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. חזור על שלב צנטריפוגה, ולאחר מכן לשטוף את התאים עם 50 microliters של PBS. לאחר שאיפה PBS, להוסיף את הנוגדנים המשניים ודגרה במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, חזור על צנטריפוגה וצעדי כביסה. לאחר מכן respend התאים ו 100 microliters של PBS ו 2.5% פורמלין לניתוח ציטומטריית זרימה. אפיון פיזיוכימי של חלקיקי GFP mRNA טריים וליופיליים אינו מראה הבדלים משמעותיים בגודל ובמדד פיזור פולי.מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור של polyplexes מאשר היווצרות של חלקיקים כדוריים ומונו מפוזרים בקוטר של כ -50 ננומטר. נתוני יעילות אנקפסולציה של פפטיד לגו ופוליפלקסים פולי בטא אמינו שונה תמצית GFP, או אליבאמין להראות הבדלים משמעותיים בהתאם לסוג של mRNA. ניתוח איכותי של ביטוי EGFP, 24 שעות לאחר העסקה בקו התא JAWS II מוצג כאן.כמותית בהשוואה לפקד השלילי. אחוז התאים החיוביים של GFP גבוה משמעותית ודומה לשליטה חיובית המבוצעת עם ריאגנט טרנס-זיהום קלאסי. אליקופפטיד טעון ovalbumin mRNA ו poly beta אמינו אסטר חלקיקים שונה יכול להפעיל תאים דנדריטי כפי שניתן לראות על ידי הביטוי גבוה משמעותית של CD11b וסמני ממברנה CD86 בתאים שעברו טרנספקט בהשוואה לתאים שאינם שעברו טרנס-זיהום.פלטפורמת החיסונים שלנו המבוססת על השימוש ב- mRNA כעיקרון הפעיל, כמו גם ניתן להתאים את הפולימרים הקנייניים שלנו לשימוש במניעה כמו גם לטיפול בסרטן. אנו יכולים להשתמש בטכנולוגיה שלנו כדי להדגיש את התרומה הזו באימונותרפיה של סרטן. מאז אנחנו יכולים לתמצת אנטיגנים הקשורים לגידול בננו-חלקיקים שלנו ולעשות שינוי בטיפולים בסרטן.

synthesis-characterization-mrna-loaded-poly-beta-aminoesters

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת מועמד לחיסון mRNA באמצעות ננו-חלקיקים פולימריים. הפולימר הקטיוני מקיים אינטראקציה עם mRNA טעון שלילית, ויוצר פוליפלקסים. היווצרות פוליפלקסים מייצבת את ה-mRNA, מה שהופך אותו למועמד פוטנציאלי לחיסוני mRNA עתידיים ביישומים אימונותרפיים.

ניסוח ננו-חלקיקים טעוני mRNA למטרות חיסון

פרוטוקול לניתוח nanoparticle מעקב (נ.ת. ע) והזרימה cytometry תפוקה גבוהה להעריך חלקיקים פולימריים גן משלוח מתואר. נת"ע מנוצל כדי לאפיין את התפלגות גודל חלקיקי nanoparticle והפצת החלקיקים לפלסמיד. cytometry זרימת תפוקה גבוהה מאפשר הערכת יעילות transfection כמוני לספרייה של biomaterials מסירת הגן.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

ננו מספקות מנגנונים מגוונים של משלוח טיפולית מבוקרת מדע בסיסי ויישומים translational, אך ייצור שלהם לעתים קרובות דורשת מומחיות שאינו זמין במעבדות ביותר ביו. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור ייצור מדרגי של טעינת טיפוליות מגוונות nanocarriers התאספו עצמית באמצעות nanoprecipitation פלאש.

הרכבה מהירה, מדרגי וטעינה של חלבונים ביו, Immunostimulants לתוך Nanocarriers סינתטי מגוונות באמצעות פלאש Nanoprecipitation

כאן נתאר פרוטוקול לדור של cationic nanoliposomes, אשר מבוססת על שיטת יבש-סרט והוא יכול לשמש עבור הכספת, אספקה יעילה של במבחנה עיבד RNA שליח.

דור של Cationic Nanoliposomes למסירה יעיל של במבחנה עיבד RNA שליח

שיטה מפורטת מסופקת כאן ומתארת את הטיהור, הקיפול והאפיון של חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית (סאפאנס) לשימוש בפיתוח החיסונים.

ייצור של E. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הביו-הנדסה של שלפוחיות הממברנה החיצונית כפלטפורמת חיסון "Plug-and-Display", כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.

פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2

ננו-חלקיק פפטיד-פולוקסאמין בהרכבה עצמית (PP-sNp) פותח באמצעות מכשיר ערבוב מיקרופלואידי כדי לתמצת ולהעביר רנ"א שליח מתועתק במבחנה . ה-mRNA/PP-sNp המתואר יכול להעביר ביעילות תאים בתרבית במבחנה.

טרנספקציה יעילה של mRNA מתועתק במבחנה בתאים בתרבית באמצעות ננו-חלקיקים פפטיד-פולוקסאמין

כאן, אנו מציגים שיטות מפורטות להכנה והערכה של החיסון לגידול ננו-תחליב בהרכבה עצמית באף במבחנה  ו-in vivo.

הכנה, מאפיינים, רעילות והערכת יעילות של החיסון לגידול ננו-תחליב באף בהרכבה עצמית במבחנה וב-Vivo

שיטה זו מתארת את האנקפסולציה של אנטיגן הכלבת למיקרו-חלקיקים פולימריים מתכלים בעלי תכונות מבניות וחומריות המאפשרות שחרור פולסטילי לאחר עיכוב קבוע מראש. הערכת ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) של האנטיגן שנלקח מליבת החלקיק מאשרת את נוכחותו של גליקופרוטאין תקין של נגיף הכלבת הטרימרי באמצעות ייצור חלקיקים.

ייצור של מיקרו-חלקיקים פולימריים פולסטיליים העוטפים אנטיגן כלבת

הפרוטוקול הנוכחי מכין ומעריך את התכונות הפיזיקליות, התגובה החיסונית וההשפעה המגנה in vivo של חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב חדשני.

הערכת התגובה החיסונית של חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב נגד זיהום סטפילוקוקוס אאורוס עמיד למתיצילין (MRSA)

למד סינתזה של חלקיקי ננו פולימריים לשחרור mRNA באמצעות פולי(בטא אמינואסטרים). השיטה מאפשרת הכלה יעילה של חומצות גרעין בצעד אחד פשוט ליישומי חיסון.

סינתזה ואפיון של חלקיקי פולי (בטא אמינואסטרים) טעונים mRNA למטרות חיסון

גלה סרטונים נוספים