Name: מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: למד מדידה של חמצון חומצות שומן β-בהפטוציטים עכבריים טריים. שיטה זו שומרת על שלמות אברונים וממזערת שינויים בביטוי גנים לתוצאות מדויקות במחקרי מטבוליזם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות R35GM119528 לרוברטה לאונרדי.

<ol><li>Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride+Metabolism+in+the+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Triglyceride Metabolism in the Liver.</a> Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).</li>
<li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).</li>
<li>Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+organization+of+peroxisomal+beta-oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).</li>
<li>Kerner, J., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+import+into+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Fatty acid import into mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).</li>
<li>Baker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+ABC+transporters%3A+functions+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism.</a> Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).</li>
<li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PloS One. 5 (6), 11107(2010).</li>
<li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).</li>
<li>Richert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+human+hepatocytes+in+suspension+after+isolation+is+similar+to+the+liver+of+origin%2C+is+not+affected+by+hepatocyte+cold+storage+and+cryopreservation%2C+but+is+strongly+changed+after+hepatocyte+plating%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%3A+The+Biological+Fate+of+Chemicals%22%5BJournal%5D)">Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating.</a> Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).</li>
<li>Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+expression+of+hepatocyte+protein+gene-products+associated+with+adaptation+of+cells+to+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture.</a> Clinical Chemistry. 30 (12), Pt 1 2053-2058 (1984).</li>
<li>Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flux+control+coefficient+of+carnitine+palmitoyltransferase+I+on+palmitate+beta-oxidation+in+rat+hepatocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures.</a> Biochemical Journal. 323, Pt 1 119-122 (1997).</li>
<li>Consitt, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+coactivator-1alpha+overexpression+increases+lipid+oxidation+in+myocytes+from+extremely+obese+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals.</a> Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).</li>
<li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615(2013).</li>
<li>Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+etomoxiryl-CoA+on+different+carnitine+acyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases.</a> Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).</li>
<li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+of+palmitate+change+during+postnatal+development+and+food+deprivation+in+liver%2C+kidney+and+heart+of+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs.</a> Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).</li>
<li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+hepatic+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+to+increasing+palmitate+concentrations+in+piglets%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Neonate%22%5BJournal%5D)">Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets.</a> Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).</li>
<li>Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+rat+and+human+tissues.+Effect+of+nutritional+state%2C+clofibrate+treatment+and+postnatal+development+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).</li>
<li>Hakvoort, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interorgan+coordination+of+the+murine+adaptive+response+to+fasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).</li>
<li>Sokolovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptomic+signature+of+fasting+murine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The transcriptomic signature of fasting murine liver.</a> BMC Genomics. 9, 528(2008).</li>
<li>Kersten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+mediates+the+adaptive+response+to+fasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Primary+Rat+Hepatocytes+with+Multiparameter+Perfusion+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289(2021).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917(2012).</li>
<li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li>
<li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li>
<li>Bougarne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+blocks+glucocorticoid+receptor+alpha-mediated+transactivation+but+cooperates+with+the+activated+glucocorticoid+receptor+alpha+for+transrepression+on+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).</li>
<li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

במהלך זלוף הכבד, חשוב להימנע מהכנסת בועות אוויר, שכן הן חוסמות את המיקרו-קפילרים בכבד, מונעות או מגבילות את זרימת החיץ ומפחיתות באופן כללי את תפוקת הפטוציטים ואת הכדאיות20,21. אמצעי זהירות, כגון בדיקה מדוקדקת של קו הכניסה הממולא במאגר לפני התותח של ה-IVC והימנעות מהרמת קו הכניסה מהצינור המכיל את Buffer 1 כדי לעבור ל-Buffer 2, כמתואר כאן, יכולים להפחית בהצלחה את מספר הזלופים הכושלים (כדאיות <70%). השימוש במלכודות בועות במערכת הזלוף יכול גם להפחית באופן משמעותי את ...

חמצון β של חומצות שומן הוא תהליך חיוני בחילוף החומרים של השומנים, המספק מסלול קטבולי לאיזון סינתזת חומצות השומן וצריכתן מהתזונה. תהליך זה מייצר אנרגיה עבור איברים רבים, כולל שריר הלב, קליפת הכליות והכבד הצום, ומשתמש בחומצות שומן המתקבלות מהתזונה, ליפוליזה של רקמת השומן ומאגריהטריגליצרידים הפנימיים 1,2.
חמצון של חומצת שומן דרך מסלול החמצון β גורם לקיצור רציף של שרשרת האציל השומנית על ידי שני פחמנים בו זמנית, המשתחררים כאצטיל-CoA, ותהליך זה מתרחש הן במיטוכונדריה והן בפרוקסיזומים. בעוד שרוב חומצות השומן עוברות רק חמצון β, חלקן מתחמצנות בפחמנים שונים לפני שהן נכנסות למסלול זה. לדוגמה, חומצות שומן בתחליפי 3-מתיל, כגון חומצה פיטנית, עוברות הסרה של פחמן אחד על ידי חמצון α בפרוקסיזומים לפני שהן נכנסות למסלול החמצון β. באופן דומה, חומצות שומן מסוימות מומרות תחילה לחומצות שומן דיקרבוקסיליות על ידי חמצון של קבוצת המתיל הטרמינלית (ω-חמצון) ברשתית האנדופלסמית לפני שהן עוברות חמצון מועדף בפרוקסיזומים על ידי חמצון β3.
ללא קשר לאברון הספציפי, יש להמיר תחילה חומצת שומן לתיואסטר קו-אנזים A (CoA), או אציל-CoA, כדי להתחמצן דרך מסלול החמצון β. β-חמצון של אציל-CoAs ארוכי שרשרת במטריצה המיטוכונדרית דורש את מעבורת קרניטין לטרנסלוקציה שלהם, כאשר קרניטין פלמיטואיל-טרנספראז 1 (CPT1) מזרז את ההמרה של אציל-CoAs לאציל-קרניטין והוא האנזים המגביל את הקצב בתהליך זה4. לאחר שהם עוברים טרנסלוקציה למטריצה המיטוכונדרית, האציל-CoAs נוצרים מחדש ומשמשים כמצעים למכונות החמצון β המיטוכונדריה. במצב של צום, האצטיל-CoA המיוצר באמצעות חמצון β במיטוכונדריה בכבד מתועל בעיקר לקטוזגנזה. פרוקסיזומים משמשים כאתר העיקרי לחמצון β של חומצות שומן ארוכות מאוד, שרשרת מסועפת ודיקרבוקסיליות. פרוקסיזומים אינם דורשים ממעבורת קרניטין לייבא מצעי חומצות שומן, ובמקום זאת מייבאים את הכתב אציל-CoAs באמצעות פעילותם של מובילי הקלטת הקושרים ATP (ABC) ABCD1-35. בתוך הפרוקסיזומים, אציל-CoAs מתחמצנים לאחר מכן על-ידי קבוצה ייעודית של אנזימים, הנבדלים מחומצת השומן המיטוכונדרית β-חמצון." גם מיטוכונדריה וגם פרוקסיזומים דורשים אספקה של NAD+ ו-CoA חופשי כדי לחמצן שרשראות אציל שומניות. רמות CoA בכבד הוכחו כגוברות בתגובה לצום, מה שתומך בקצב המוגבר של חמצון חומצות שומן המתרחש במצב זה6. יתר על כן, פירוק מוגבר של CoA בפרוקסיזומים גורם לירידה סלקטיבית בחמצון חומצות שומן פרוקסיסומליות7. לכן, התהליך של חמצון חומצות שומן בתוך התא מווסת על ידי רמות הביטוי והפעילויות של אנזימים המעורבים בהפעלה, הובלה וחמצון של חומצות שומן, כמו גם ריכוזים של קו-פקטורים ומטבוליטים אחרים לאורך תאים תת-תאיים מרובים.
פרוצדורות המשתמשות בהומוגנטים של רקמות למדידת חמצון חומצות שומן הורסות את הארכיטקטורה התאית המסדירה ותומכת בתהליך זה, מה שמוביל לאיסוף נתונים שאינם משקפים במדויק את חילוף החומרים in vivo. בעוד שטכניקות המשתמשות בהפטוציטים ראשוניים מצופים משמרות את המערכת הזו, גידול תאים מבודדים לפרקי זמן ממושכים גורם לאובדן פרופיל ביטוי הגנים in vivo שהיה קיים בתאים כאשר הם עדיין חיו בתוך החיה 8,9. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה לבודד הפטוציטים ראשוניים ולבחון את יכולתם לחומצת שומן β-חמצון מיד לאחר הבידוד ובתרחיף, באמצעות [1-14C]חומצה פלמיטית. הבדיקה מבוססת על מדידת הרדיואקטיביות הקשורה למטבוליטים המסיסים בחומצה (ASM) או למוצרים, כמו אצטיל-CoA, המיוצרים על ידי חמצון β של [1-14C] חומצה פלמיטית10,11.

<table><tbody><tr><td>(R)-(+)-מלח נתרן אטומוקסיר</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4539/10</td><td></td></tr><tr><td>[1-14C]-חומצה פלמיטית, 50&ndash; 60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL</td><td>כימיקלים אמריקאים עם תווית רדיו</td><td>ARC 0172A</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES,</td><td>קורנינג</td> סטרילי <td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>10 ומיקרו; L נימים/בוכנות חד פעמיות לפיפטה תזוזה חיובית</td><td>מטלר טולדו</td><td>17008604</td><td></td></tr><tr><td>1000 ומיקרו; L, 200 ומיקרו; L, ו-10 ומיקרו; פיפטות וקצוות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L 5 מ"ל, 10 מ"ל ו-25 מ"ל פיפטות סרולוגיות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגות סטריליות</td><td>CellTreat</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>70% חומצה פרכלורית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A2296-1LB</td><td></td></tr><tr><td>BSA, ללא חומצות שומן</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9704100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dihydrate</td><td>MilliporeSigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>E-217</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Pharmco</td><td>111000200CSPP</td><td></td></tr><tr><td>מערכת סינון, 0.22 &mu; m מסנן PES, 500 מ"ל, CellTreat סטרילי</td><td></td><td>229707</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin sulphate</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G-400-25</td><td></td></tr><tr><td>HDPE, 6.5 מ"ל בקבוקוני נצנוץ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-342-3</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחטים היפודרמיות 22 גרם, 1.5 ב</td>- <td>BD Biosciences</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VetOne</td><td></td><td></td>502017</tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>MilliporeSigma 5401119001</td><td></td><td>תערובת מוגדרת של קולגנאז מטוהר I ו-II עם ריכוז בינוני של תרמוליזין</td></tr><tr><td>M199 בינוני</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 heptahydrate</td><td>MilliporeSigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>accuSpin Micro 17</td></tr><tr><td>מספריים מיקרו-ניתוחים</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-5980</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chem-Impex International</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>424270010 חומצה</td><td>פלמיטית MilliporeSigma</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח בופר פוספט (PBS)</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה עם תזוזה חיובית MR-10, 10 ומיקרו; L</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008575</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת עם תוספות לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>5810 R</td></tr><tr><td>מבחנות בדיקה עגולות תחתונות, 14 מ"ל, תרבית פוליפרופילן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-956-9A</td><td></td></tr><tr><td>דלפק נצנוץ</td><td>פרקין אלמר</td><td></td><td>TriCarb 4810 TR</td></tr><tr><td>קוקטייל ScintiVerse BD</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SX18-4</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים רועד, קיבולת 30 ליטר</td><td>ניו ברונסוויק סיינטיפיק</td><td></td><td>&nbsp; דגם G76</td></tr><tr><td>מסנני תאים סטריליים, 100 ומיקרו; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים חבישת אגודל</td><td>Roboz מכשיר כירורגי Co</td><td>RS-8120</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25900CI</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית בזרימה משתנה</td><td>Fisher Scientific</td><td>138762</td><td></td></tr><tr><td>אמבטיות מים, 2&ndash; קיבולת</td><td></td><td></td><td></td> 2.5 ליטר</tr></tbody></table>

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

חמצון β של חומצות שומן הוא מסלול מטבולי מרכזי כדי לענות על דרישות האנרגיה של הכבד ולספק מצעים וקו-פקטורים לתהליכים נוספים, כגון קטוגנזה וגלוקונאוגנזה, החיוניים לשמירה על הומאוסטזיס של גלוקוז בכל הגוף ולתמיכה בתפקוד איברים חוץ-כבדיים במצב של צום. חומצת שומן β-חמצון מתרחשת בתוך המיטוכונדריה והפרוקסיזומים ומווסתת באמצעות מנגנונים מרובים, כולל ספיגה והפעלה של חומצות שומן, רמות ביטוי אנזימים וזמינות של קו-פקטורים כגון קו-אנזים A ו-NAD+. במבחנים המודדים חומצות שומן β-חמצון בהומוגנטים של הכבד, ליזה של תאים והתוספת הנפוצה של רמות סופראפיזיולוגיות של קו-פקטורים מסווים את ההשפעות של מנגנוני ויסות אלה. יתר על כן, שלמות האברונים בהומוגנטים קשה לשליטה ויכולה להשתנות באופן משמעותי בין ההכנות. המדידה של חומצת שומן β חמצון בהפטוציטים ראשוניים שלמים מתגברת על המלכודות הנ"ל. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת חומצת שומן β-חמצון בתרחיף של הפטוציטים של עכברים ראשוניים שבודדו זה עתה, עם 14חומצה פלמיטית עם תווית C. על ידי הימנעות משעות עד ימים של תרבית, לשיטה זו יש יתרון בכך שהיא משמרת טוב יותר את רמות ביטוי החלבון ואת פעילות המסלולים המטבוליים של הכבד המקורי, כולל הפעלת חומצת שומן β חמצון שנצפתה בהפטוציטים שבודדו מעכברים בצום בהשוואה לעכברים שניזונו.

זלוף הכבד המתואר כאן מניב בדרך כלל 30-40 מיליון תאים/כבד עם כדאיות ממוצעת של 80%, כפי שהוערך על ידי הרחקה כחולה של טריפאן (איור 2). הריכוז האופייני של גלוקוז במאגר Krebs-Henseleit (KHB), המשמש להכנת מאגרי הזלוף 1 ו -2, הוא 11 mM. כאשר מודדים חומצת שומן β-חמצון בהפטוציטים המבודדים מעכברים בצום, ניתן להוריד את ריכוז הגלוקוז ב-KHB כדי לייצג טוב יותר את מצב הצום. כפי שניתן לראות באיור 2, להורדת ריכוז הגלוקוז ל-5.6 mM אין השפעה שלילית על התשואה או על הכדאיות של ההפטו...

חמצון β חומצות שומן הוא מסלול מטבולי חיוני האחראי על הפקת אנרגיה בסוגי תאים רבים ושונים, כולל הפטוציטים. כאן אנו מתארים שיטה למדידת חמצון-β חומצות שומן בהפטוציטים ראשוניים שזה עתה בודדו באמצעות 14חומצה פלמיטית המסומנת כ-C.

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

פרוטוקול זה פותח כדי לספק שיטה חזקה למדידת סך כל חומצות השומן המיטוכונדריאליות והפרוקסיסומליות בטא-חמצון בפטוציטים ראשוניים של עכברים. השימוש בתאים שלמים שומר על שלמות האברונים ועל מנגנוני הוויסות הקיימים. בנוסף, בדיקת הפטוציטים שבודדו זה עתה ממזערת את השינויים בביטוי הגנים ביחס לכבד המוצא.הניתוח יכול להיות מאתגר. אתה צריך להיות בטוח, חרוץ וממוקד. לאחר שהתותח מצליח, נסו להירגע, אך שימו לב ועקבו אחר איכות הזלוף.כדי להתחיל את ההליך, לרסס בנדיבות את הבטן והחזה של העכבר המרדים עם 70% אתנול. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי למשוך את העור ואת דופן הבטן ליד בסיס הבטן ולחתוך לרוחב משני צדי קו האמצע ועד הסרעפת כדי לחשוף את האיברים. חשוף את הווריד הנבוב התחתון, או IVC, על ידי הזזת המעיים לצד ימין והפיכה עדינה של אונות הכבד כלפי מעלה.הכנס אובייקט גלילי קטן, כגון מכסה מחט, מתחת לגב העכבר כדי להטות מעט את ה- IVC ולהקל על התותח. לאחר הפעלת המשאבה עם buffer אחד במהירות הנמוכה ביותר, להכניס את המחט לתוך IVC. לאחר מכן חותכים את וריד הפורטל כדי להקל על הלחץ ולאפשר ניקוז של מאגרי דם וזלוף.לפני הגדלת קצב הזרימה לשבעה מ"ל לדקה. הוסיפו לכבד חיץ חם אחד וודאו שהקו המוחדר לצינור המכיל חיץ אחד נשאר שקוע באופן רציף כדי למנוע החדרת בועות אוויר. בזמן שמתרחשת זלוף, מוסיפים 130 מיקרוליטרים של תמיסת קולגן כדי לאגור שניים, ומערבבים על ידי צנרת עם פיפטה סרולוגית.כאשר הנפח בצינור המכיל חיץ אחד יורד לכ-5 מ"ל, הוסיפו באיטיות חמישה מ"ל של חיץ שניים כדי לאגור אחד על ידי צנרת בצד הצינור. חזור על התוספת פעמיים לפני שתוסיף את שני המאגרים הנותרים לצינור. עצור את הזלוף כאשר כ 5 עד 10 מ"ל של חיץ שני נשארים בצינור.לאחר מכן הוציאו את הכבד והעבירו אותו לתבשיל התרבית של 100 מ"ל המכיל 20 מ"ל של חיץ קר כקרח שניים. מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, מפרקים בעדינות את רקמת הכבד באמצעות מספריים כירורגיים ופינצטה. לאחר מכן מוסיפים כ-20 מ"ל של חיץ M199 קר כקרח לתרחיף הפטוציטים ומסננים אותו דרך מסננת תאים של 100 מיקרון באמצעות בוכנה של מזרק כדי לקדם בעדינות את שחרורם של הפטוציטים נוספים מחתיכות הכבד הגדולות יותר.יש לשטוף את תבשיל התרבית של 100 מ"ל ואת מסננת התאים עם מאגר M199 כדי לאסוף את תרחיף התא עד שצינור האיסוף מתמלא. לאחר מכן צנטריפוגה את ההשעיה ב 50 x g במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. לשאוף את supernatant לפני החייאה של כדור hepatocyte ב 30 מ"ל של M199 קר על ידי מערבולת.חזור על הכביסה פעם אחת. להפשיר את החומצה הדקלמית ואת אלבומין סרום בקר, או BSA, תמיסות לפני הכנת תערובת המצע לתגובות מרובות. אליקוט 13.5 מיקרוליטרים של תמיסת BSA לכל תגובה בצינור מיקרוצנטריפוגה.לאחר חימום הצינור ל-41 מעלות צלזיוס, הוסיפו מיקרוליטר אחד של תמיסת החומצה הדקלמית של 200 mM לכל תגובה. מערבולת הצינור במרץ לפני ובמהלך הדגירה ב 41 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 30 דקות כדי להקל על היווצרות של קומפלקס חומצה פלמיטית מסיסה-BSA. במהלך תקופה זו, aliquot 133 microliters של 1 M של חומצה פרכלורית אשר ישמשו כדי לעצור את התגובות בצינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים 1.5 מ"ל.לפני תחילת התגובות, aliquot ודגירה של 485.5 מיקרוליטרים של חיץ M199 לכל תגובה לתוך צינור ב 37 מעלות צלזיוס כדי לדלל את קומפלקס החומצה הרדיואקטיבית BSA-palmitic מוכן. לאחר מכן מחלקים 750 מיקרוליטרים של M199 עם או בלי מעכבים בצינורות התחתונים העגולים הנפרדים של 14 מ"ל כדגימות. במהלך שלבי שטיפת הפטוציטים, 10 עד 15 דקות לפני תחילת התגובות, מעבירים את הצינורות לאמבטיית מים רועדת שנקבעה ל-37 מעלות צלזיוס ב-180 עד 200 סיבובים לדקה.אם הכדאיות של hepatocytes הוא לפחות 75% להשלים את ההכנה של תערובת המצע על ידי העברת 0.8 microliters של פחמן-14 חומצה פלמיטית לכל תגובה לצינור microcentrifuge המכיל את תמיסת חומצה BSA-palmitic הבהיר. מערבולת לפני החזרת הצינור לאמבטיית המים בטמפרטורה של 41 מעלות צלזיוס. מיד לאחר ההחייאה הסופית של הפטוציטים, העבירו 750 מיקרוליטרים של תרחיף הפטוציטים לכל אחד מהצינורות התחתונים העגולים של 14 מ"ל באמבט המים הרועד באמצעות פיפטה אחת של מ"ל ומערבולת הצינורות לזמן קצר במהירות הנמוכה לפני המעבר לחממה, מה שמזעזע כל תוספת ב-30 שניות.מעבירים אליקוט נפרד של הפטוציטים לצינור מיקרו-צנטריפוג של 1.5 מ"ל כדי להסתובב ב-3000 x גרם במשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט לפני אחסון הכדור במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי למדוד את כמות החלבון הכוללת בדגימה כדי לנרמל את התוצאות. בזמן שההפטוציטים נמצאים תחת דגירה מוקדמת ב-37 מעלות צלזיוס, הוסיפו את קומפלקס החומצה הרדיואקטיבית BSA-palmitic למדיום החם כדי לשמור על 37 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים להתחיל את התגובות.כדי להתחיל את התגובות, להסיר את hepatocytes מן האמבטיה מים ולהוסיף 500 microliters של תערובת המצע hepatocytes. מערבולת את התאים במהירות נמוכה במשך חמש שניות לפני שהם חוזרים לאמבטיית המים כדי לדגור במשך 15 דקות. התחל קבוצה של תגובות ומיד עצור כדי לקבוע את הרדיואקטיביות ברקע.מעבירים ומניחים בצד את האליקוטים הכפולים של 200 עד 250 מיקרוליטרים של שאריות המצע בתערובת המצע הנותרת בבקבוקוני 6 מ"ל כדי לבצע את הספירה. כדי לעצור את התגובות, הסר את הפטוציטים מאמבט המים כדי לבצע החייאה על ידי מערבולת במהירות מתונה ולאחר מכן העבר 400 מיקרוליטרים של תרחיף הפטוציטים לצינורות microcentrifuge המכילים חומצה פרכלורית. מיד מכסה ומסובב את הצינורות לפני שחוזרים על הרצף של כל הדגימות, מזעזע ב -30 שניות.לאחר סיבוב במורד צינורות המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ב-13, 000 x g למשך 10 דקות, מעבירים 300 מיקרוליטרים של ה-supernatant לבקבוקון ציצית של 6 מ"ל ומוסיפים 4 מ"ל מ"ל של נוזל הציצית כדי לספור את הרדיואקטיביות בדגימות ואת תערובת המצעים אליקוטים במונה סקינטילציה. במחקר, זלוף הכבד הניב 30 עד 40 מיליון תאים לכל כבד, עם כדאיות ממוצעת של 80%, כמו כן נצפתה כי הורדת ריכוז הגלוקוז בקבוצת הצום לא השפיעה לרעה על התשואה או הכדאיות של הפטוציטים. תרחיף הפטוציטים, שבודד מעכברים זכרים שניזונו וצום, נבדקו לצורך יכולת חמצון בטא של חומצת שומן בנוכחות ובהיעדר אטומוקסיר, מעכב רב עוצמה של CPT1 וחמצון חומצות שומן מיטוכונדריאליות.הספירות לדקה, או CPM, הקשורות לרדיואקטיביות הרקע משתנות עם קבוצת החומצה הדקלמית. עם זאת, CPM עדיין היה נמוך משמעותית מהדגימות שהודגמו בתערובת המצע. ההפטוציטים שבודדו מהעכברים הצומים מראים עלייה חזקה בשיעורי החמצון של חומצת שומן מיטוכונדריאלית ופרוקסיזומית.הנתונים נחקרו עוד יותר כדי לקבוע את הקצב שבו חומצה פלמיטית מתחמצנת בהפטוציטים המבודדים מהעכברים המוזנים והצומים. מנעו מבועות להיכנס לקו. שמור על המחט יציבה במהלך הזלוף.היו עדינים בעת הטיפול בהפטוציטים. שמור אותם במתלים בעת חלוקתם. הפטוציטים המבודדים מהליך זה יכולים לשמש כתרחיף כדי לבחון מסלולים מטבוליים אחרים, כגון סינתזה של חומצות שומן, או שניתן לצפות אותם לניסויים בתרביות תאים.

measurement-fatty-acid-oxidation-suspension-freshly-isolated-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון זה, אנו מדגימים צביעה חוץ גופית של שומנים ניטרליים בהפטוציטים כדי לזהות סטאטוזיס בכבד או הצטברות שומן מופרזת בכבד. עודף שומן מצטבר בתאים בצורה של טיפות שומנים. שמן אדום O הוא צבע מסיס שומנים שנקשר לשומנים ניטרליים תוך תאיים בטיפות שומנים אלה. כאשר נצפים תחת מיקרוסקופ אור, טיפות שומנים תוך תאיות אלה מופיעות בצבע אדום עז.

שמן אדום O צביעה: טכניקה להכתמת שומנים ניטרליים ב hepatocytes לגילוי סטאטוזיס בכבד במבחנה

lipogenesis נובו דה וחמצון חומצת β-השומן מהווים מסלולי מפתח חילוף חומרים בhepatocyte, מסלולים המוטרדים בכמה הפרעות מטבוליות, כוללים מחלת כבד שומני. כאן אנו מדגימים בידוד של hepatocytes העיקרי עכבר ולתאר כימות של חמצון חומצת β-השומן וlipogenesis.

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

הפרוטוקול הבא מתאר את ההכנה והניצול של חוצצים למדידה כמותית של שיעורי חמצון הגלוקוז וחומצות השומן בלב החולדה המבודד. נדונות גם השיטות המשמשות לניתוח מדגם ופרשנות נתונים.

שיטות לקביעת המחירים של גלוקוז ו חומצות שומן חמצון שבלב עכברוש העבודה המבודד

כאן מתוארות שיטות מותאמות ליצירת מודלים in vivo ו-in vitro של סטיאטוזיס בכבד ולניתוח הפנוטיפים הסטאטוטיים והפרמטרים הפיזיולוגיים הקשורים.

ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לשימוש לבחינת חמצון מצע על ידי מעקב אחר ייצור 14CO2 במבחנה.

הערכת חמצון מצע אנרגיה במבחנה עם לכידת CO 2 14

כאן, אנו מציגים שיטה כמותית זולה המשתמשת תחמוצת דאוטריום וספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית גז (GCMS) לניתוח של חומצת שומן כוללת דה נובו ליפוגנזה ברקמת שומן חום in vivo.

קביעה כמותית של סינתזת חומצות שומן דה נובו ברקמת שומן חומה באמצעות תחמוצת דאוטריום

טריגליצרידים ליפוליזה באדיפוציטים היא תהליך מטבולי חשוב המביא לשחרור חומצות שומן חופשיות וגליצרול. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט למדידת ליפוליזה בסיסית ומגורה באדיפוציטים וברקמת שומן ex vivo מעכברים.

מדידת שיעור הליפוליזה ברקמת השומן Ex Vivo Murine ובפראדיפוציטים ראשוניים מובחנים במבחנה

מאמר זה מתאר את השימוש בתאי HepG2 הנגרמים על ידי חומצה אולאית כמודל למחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי.

מידול חוץ גופי של שקיעת שומן במחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי

אנו מציעים פרוטוקול לזיהוי חומצות שומן ללא צורך בטיהורן. הוא משלב מידע על זמני השמירה עם ספקטרום המסה של שלושה סוגים של נגזרות חומצות שומן: אסטרי מתיל של חומצות שומן (FAMEs), נגזרות 4,4-דימתיל אוקסזולין (DMOX) ואסטרי 3-פירידילקרביניל (פיקוליניל).

זיהוי של חומצות שומן ב<em&gt; Cereus בצילוס</em

כאן, אנו מציגים הידרוליזה יעיל והגנה Fmoc הבאות של חומצת אמינו מבודדת מתסביך Ni-שיף-בסיס. תנאים הידרוליזה שהוצגו כאן מתאימים לשימוש כאשר השמירה של קבוצות הגנה חומצה-רָפִיף בצד שרשרת נדרשת. טכניקה זו עשויה להיות להתאמה למגוון של מצעי חומצות אמינו לא טבעיים.

הידרוליזה של תנאי Ni-שיף-Base מורכבים באמצעות מתאים שמירת חומצה-רָפִיף קבוצות הגנה

למד מדידה של חמצון חומצות שומן β-בהפטוציטים עכבריים טריים. שיטה זו שומרת על שלמות אברונים וממזערת שינויים בביטוי גנים לתוצאות מדויקות במחקרי מטבוליזם.

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

גלה סרטונים נוספים