Name: תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים של עכברים למלנוציטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למד שיטה יעילה לתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים של עכברים למלנוציטים תפקודיים באמצעות שלושה גורמי שעתוק: Mitf, Sox10 ו-PAX3. השיטה משפרת יציבות ויעילות לטיפול במחלות דה-פיגמנטציה כמו ויטיליגו.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82070638 ו-81770621) ומהקרן למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (BK20180281).

עבודה זו אושרה על ידי הוועדה לניהול ושימוש בחיות מעבדה באוניברסיטת ג'יאנגסו (UJS-IACUC-AP--20190305010). הניסויים בוצעו תוך הקפדה על התקנים שנקבעו על ידי האגודה להערכה והסמכה של ארגון המחקר הבינלאומי לטיפול בחיות מעבדה (AAALAC International). לא היו ניסויים שבהם היו מעורבים בני אדם, ולכן עבודה זו לא הייתה זקוקה לאישור ועדת האתיקה של המחקר האנושי. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על ריאגנטים.
1. בניית מערכת אריזה מרוכזת של נגיף הלנטי לגורמי שעתוק
<ol><li>ייצור הנגיף המרוכז (איור 1A, B)<ol>
<li>צלחת 1.5 × 106 תאי HEK-293T לתוך צלחת של 60 מ"מ ותרבית תאים אלה עם תווך רגיל (ראה טבלה 1) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO2. הערה: אם יש צורך לארוז את הנגיף בקבוצות, ניתן להשתמש בצלחת תרבית תאים של 100 מ"מ (לפרטים, ראו טבלה 2).</li>
		<li>לאחר 24 שעות, ודא שתאי HEK-293T הגיעו למפגש של 80-90% ביום ההעתקה, והחלף את המדיום ב-3.5 מ"ל של DMEM (150 μL של DMEM לכל 1 ס"מ2). השאירו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO2 למשך שעתיים. הערה: המדיום החלופי חייב להיות נטול סרום, כך שניתן יהיה "להרעיב" את התאים כדי לשפר את טרנספקציה של פלסמיד.</li>
		<li>הכן את התערובת של פלסמידים (תערובת A) המכילה 3 מיקרוגרם של פלסמידי המטרה של Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 או Snai2; 1 מיקרוגרם של האריזה פלסמיד PMD2. G, ו-2 מיקרוגרם של האריזה פלסמיד PSPAX2. הוסיפו את הנפח של תערובת A עד 150 μL עם DMEM ללא סרום. מכינים את התערובת של ריאגנט הטרנספקציה (תערובת B) על ידי הוספת 12 μL של מגיב הטרנספקציה (הנפח כפול מהמסה הכוללת של כל הפלסמידים), ומרכיבים את נפח התערובת B עד 150 μL עם DMEM ללא סרום. הערה: בעת הכנת התערובות, חשוב להוסיף נוזל לאט כדי למנוע בועות אוויר.</li>
		<li>ערבבו את תערובת A וערבבו את B לאחר שאפשרו להם לעמוד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. דגירה של התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות כדי ליצור את קומפלקס הטרנספקציה.</li>
		<li>הוציאו את תאי HEK-293T מהאינקובטור, החליפו את המדיום ב-DMEM + 2% FBS, הוסיפו את התערובת משלב 1.1.4 בצורה טיפתית וערבבו את הנוזל בעדינות.</li>
		<li>לאחר 8 שעות, לשנות את המדיום עם 3.5 מ"ל של בינוני נורמלי. לאחר שינוי המדיום, לאסוף את supernatant הנגיף כל 24 שעות ו 48 שעות.</li>
		<li>ערבבו את חומרי העל של הנגיף שנאספו בשתי נקודות זמן שונות. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנט דרך מסנני 0.45 מיקרומטר ואוספים אותו בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל. הערה: ניתן לאחסן את הנגיף שנאסף בשעה 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולערבב אותו עם הנגיף שנאסף בשעה 48 שעות.</li>
		<li>רכז את הווירוס סופרנאטנט על ידי צנטריפוגה ב 6000 × גרם ב 4 °C בלילה (~ 16 שעות). ודא שכדור הווירוס נראה בתחתית הצינור החרוטי לאחר הצנטריפוגה.</li>
		<li>שופכים את ה-supernatant לאט. ממיסים את כדור הנגיף בנפח של מדיום תקין שהוא 1/100th מנפח ה-supernatant של הנגיף. באמצעות מיקרופיפט P1000, פיפטה למעלה ולמטה בעדינות עד לקבלת תערובת הומוגנית. מחלקים את הנגיף המרוכז לצינורות מיקרוצנטריפוגה לפי הצורך. יש לאחסן בטמפרטורה של −80 °C (80 °F). הערה: הנגיף מרוכז פי 100 בשיטה זו. ניתן לאחסן את הנגיף המרוכז (100x) במשך שנה >1 בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. הימנעו מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות של הנגיף.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהוי של טיטר וירוסים מרוכז (איור 1C)<ol>
<li>צלחת 1 × 105 תאי HEK-293T לבאר אחת של צלחת בעלת 6 בארות. זכור להוסיף אחד טוב כמו שליטה שלילית. תרבית תאים אלה עם תווך נורמלי ב 37 °C בחממה לחה עם 5% CO2.</li>
		<li>הוסף 0.1 μL או 0.2 μL של נגיף מרוכז פלואורסצנטי (100x) לכל באר לאחר 24 שעות, והוסף 4 ng/μL של מגיב הטרנספקציה הפולימרית הקטיונית לכל באר. כ 8-12 שעות לאחר ההדבקה, להחליף את המדיום עם בינוני נורמלי. הערה: כדי להבטיח את הדיוק והיעילות של זיהוי הפלואורסצנציה, שיעור ההדבקה חייב להיות 10-30%. הוספת 0.1 μL או 0.2 μL של הנגיף המרוכז פלואורסצנטי יכולה לשמור על יעילות הזיהום בטווח זה. טיטר הנגיף המרוכז יכול להגיע ל-1 × 108 יחידות התמרה (TU)/mL לפחות.</li>
		<li>כ-48 שעות לאחר ההדבקה, שטפו את התבנית ב-1 מ"ל של מי מלח סטריליים עם מאגר פוספט (PBS) כדי להסיר תאים מתים.</li>
		<li>נסה את התאים האלה באמצעות 250 μL של 0.05% טריפסין-EDTA לבאר בצלחת של 6 בארות למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C ולאחר מכן להסיר את supernatant.</li>
		<li>בצעו החייאה של גלולת התא ב-1 מ"ל של PBS, הוסיפו את ההשעיה לצינור בעל תחתית עגולה של פוליסטירן 5 מ"ל, וזהו את יעילות הזיהום של הפלואורסצנציה של הנגיף (חלבון פלואורסצנטי ירוק, GFP+) באמצעות ציטומטריה של זרימה.</li>
		<li>חשב את טיטר הנגיף המרוכז באמצעות הנוסחה הבאה: 105 (נפח תא) × שיעור ההדבקה (GFP+%)/נפח הנגיף המוסף (0.1 μL או 0.2 μL).</li>
	</ol></li>
</ol>2. תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים (איור 2A)
<ol><li>מצפים באר אחת של צלחת תרבית תאים בת 6 בארות עם 1 מ"ל של תמיסת ג'לטין 0.1% בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות. ודא כי הבאר מכוסה לחלוטין עם תמיסת ג'לטין 0.1%. שאפו לתמיסת הג'לטין 0.1% לאחר הציפוי. הערה: הכינו תמיסת ג'לטין 0.1% (100 מ"ל) באופן הבא: 0.1 גרם אבקת ג'לטין מומסת ב-100 מ"ל של מים אולטרה-אפורים בבקבוק זכוכית אוטו-קליפה ולאחר מכן מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מחודשיים.</li>
	<li>צלחת 5 × 104 MEFs לבאר אחת של צלחת 6 בארות המצופה בג'לטין 0.1% (כמו בשלב 2.1), ותרבית תאים אלה עם תווך נורמלי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO2 למשך הלילה.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, לאשר כי MEFs הגיעו 40-50% מפגש. החלף את המדיום במדיום רגיל.</li>
	<li>ביום 0, מוציאים את הנגיף המרוכז מהמקפיא וממיסים את הנגיף על קרח. חשב את נפח הווירוס שיש להוסיף באמצעות eq. (1). הוסף את הווירוס המרוכז עבור ששת גורמי השעתוק, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 ו- Snai2 (ראה טבלת חומרים) לכל באר בהתאם לנפח המחושב, ולאחר מכן הוסף 4 מיקרוגרם /מ"ל של חומר הטרנספקציה הפולימרי הקטיוני. מספר תא (5 × 104) × 30 (ריבוי זיהום, MOI)/וירוס טיטר (1)</li>
	<li>ביום הראשון, 8-12 שעות לאחר ההדבקה, הסירו את המדיום המכיל את הנגיף והחליפו אותו במדיום תקין טרי תוך הוספת 0.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין לסינון קווי תאים נגועים יציבים.</li>
	<li>ביום 2, 48 שעות לאחר ההדבקה, החליפו את התווך הסופר-נטנטי בהדרגה במדיום התכנות מחדש. ראשית, שנה 1/4מהנפח הבינוני הכולל, והוסף 3 μM CHIR99021.</li>
	<li>מיום 3 עד יום 7, בהתאם למצב התאים, שנה את המדיום על ידי החלפה בשיעור גבוה יותר של מדיום תכנות מחדש (ראה טבלה 1) בהדרגה, ועבור לבינוני תכנות מחדש מלא תוך 5 ימים. הערה: במהלך תקופה זו, יש להשתמש בפורומיצין וב- CHIR99021 מדי יום. תאים מתים רבים יופיעו ביום הראשון והשני של שינוי מדיום התכנות מחדש. זה נורמלי מכיוון שהתאים מסתגלים בהדרגה לטרנספורמציה. לכן, המדיום צריך להיות שונה בהדרגה כדי להבטיח את התפשטות בריאה של התאים.</li>
	<li>כדי להעביר את התאים, הוסיפו 500 μL של 0.05% טריפסין-EDTA כדי לעכל את התאים במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. כאשר כ-60% מהתאים צפים למעלה, הפסיקו את העיכול על ידי הוספת מדיום תקין פי 2 מנפח אנזים העיכול. לאסוף את תרחיף התא בצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, להסיר את הסופרנאטנט, להחזיר את גלולת התא עם מדיום התכנות מחדש, ולצלוח את התאים בצלחת סטרילית של 60 מ"מ בצפיפות של 3 × 104/ס"מ2. תרבית תאים אלה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 של 5% לחות. הערה: מהיום ה-8 ועד היום ה-21, תאים אלה עוברים תת-תרבית כל 3-5 ימים ומתרבית במנות סטריליות בקוטר 60 מ"מ כדי להתרחב. הם יכולים להיות מתורבתים כדי להגיע לפחות מעבר 5.</li>
</ol>3. אופטימיזציה לתכנות מחדש וזיהוי ישירים
<ol><li>סינון לגורמי השעתוק הממוטבים<ol>
<li>חזור על שלבים 2.1-2.7, תוך הפחתת אחד מששת גורמי השעתוק בכל פעם. הדביקו את ה-MEFs בנגיף בשילובים של חמישה גורמי שעתוק.</li>
		<li>שבעה ימים לאחר ההדבקה, הוציאו את הרנ"א של התאים האלה16, וניתחו את רמות הביטוי של הגנים המלנוציטיים שלהם באמצעות PCR של שעתוק הפוך (RT-PCR)17 כדי לסנן את גורמי השעתוק בעלי ההשפעה הגדולה ביותר על ההמרה למלנוציטים על ידי הסרתם בזה אחר זה (איור 3A).</li>
		<li>השתמש בשלושת גורמי השעתוק המובילים המשפיעים על ההמרה למלנוציטים כדי להדביק את ה- MEFs. חזור על שלבים 2.1-2.7. הערה: שבעה ימים לאחר ההדבקה, הגנים המלנוציטיים צריכים להיות ניתנים לזיהוי בתאים שעברו טרנספורמציה (איור 3B). מידע ראשוני לאפיון iMels כלול בטבלה 3.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהוי מלנוציטים מושרים (iMels)<ol>
<li>השתמשו בכתם אימונופלואורסצנטי18 כדי לוודא שה-iMels מבטאים חלבונים מלנוציטיים, כולל TYRP-1 ו-DCT (איור 4A).</li>
		<li>כתם ספציפי למלנין 3,4-דיהידרוקסיפנילאלנין (DOPA) ספציפי למלנין (איור 4B)<ol>
<li>הכן 4% paraformaldehyde (10 מ"ל) כדלקמן: להמיס 0.4 גרם של אבקת paraformaldehyde ב 10 מ"ל PBS. מניחים את התמיסה בתנור בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לקדם את הפירוק. הערה: הפתרון יכול להישמר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מחודש.</li>
			<li>מרבים את ה-iMels במנה של 30 מ"מ ושוטפים את המנה פעמיים עם PBS שחומם מראש. מוסיפים 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד כדי לתקן את התאים למשך 20 דקות, ושטפו את המנה 3 פעמים עם PBS.</li>
			<li>הכינו תמיסת כתמי DOPA 0.1% (10 מ"ל) ממש לפני השימוש על ידי המסת 0.01 גרם אבקת L-DOPA ב-10 מ"ל של PBS. הניחו את התמיסה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; לנער אותו מספר פעמים כדי לקדם פירוק.</li>
			<li>הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת צביעת DOPA 0.1% שהוכנה זה עתה. דגירה בתנור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-5 שעות. אם אין חלקיקים חומים-שחורים, יש להמשיך לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות נוספות, אך לא למשך >5 שעות. בדוק את הדגימות כל 30 דקות.</li>
			<li>יש לשטוף את המנה 3 פעמים עם PBS למשך דקה אחת בכל פעם. הכתימו את הגרעין ב-1 מ"ל של תמיסת צביעת המטוקסילין למשך 2 דקות.</li>
			<li>לאחסון לטווח ארוך, לייבש את הדגימות באמצעות 95% אתנול במשך 3 דקות ולאחר מכן 100% אתנול למשך 5 דקות. אוטמים את המנה בקסילן ובבלזם נייטרלי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>צביעת מאסון-פונטנה ספציפית למלנין (איור 4B)<ol>
<li>צלחת iMels בצלחת 30 מ"מ ולתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות; לשטוף את המנה 3 פעמים עם PBS.</li>
			<li>הוסיפו 1 מ"ל של תמיסה A (תמיסת כסף אמוניה) מתוך ערכת הכתמים של מאסון-פונטנה (ראו טבלת חומרים), הניחו את המנה בקופסה כהה והניחו את הקופסה הכהה בתנור בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 15-40 דקות. הערה: אם חלקיקים חומים-שחורים אינם נראים לאחר 15 דקות בתנור, החזירו את הדגימות לתנור של 56 מעלות צלזיוס כדי להמשיך לדגר אך לא למשך >40 דקות. ניתן להוסיף מעט מים לקופסה הכהה כדי למנוע התייבשות.</li>
			<li>שאפו לפתרון A ושטפו את התבשיל 5-6 פעמים במים מזוקקים, 1-2 דקות בכל פעם.</li>
			<li>הוסיפו תמיסה B של 1 מ"ל (היפו תמיסה) מתוך ערכת הכתמים של Masson-Fontana, והשאירו את המנה בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.</li>
			<li>שאפו לתמיסה B ושטפו את הכלים במי ברז 3 פעמים, דקה בכל פעם.</li>
			<li>הוסיפו 1 מ"ל של תמיסה C (צבע אדום נייטרלי) מתוך ערכת הכתמים של Masson-Fontana, והשאירו את המנה בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.</li>
			<li>שאפו לתמיסה C ושטפו את התבשיל 3 פעמים במים מזוקקים, דקה אחת בכל פעם.</li>
			<li>מוסיפים 1 מ"ל של 100% אתנול להתייבשות מהירה, ושואפים את האתנול לאחר 3 דקות. הערה: ניתן לאחסן דגימות מוכתמות במשך זמן רב לאחר איטום עם קסילן ובלסם נייטרלי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li>
<li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011(2015).</li>
<li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%3A+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li>
<li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo+management%3A+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li>
<li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+therapies+for+vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Clinics%22%5BJournal%5D)">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li>
<li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509(2018).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li>
<li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+strategies%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+achievements%2C+hurdles%2C+and+new+roads+to+success%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li>
<li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807(2014).</li>
<li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891(2016).</li>
<li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-transcription+PCR+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li>
<li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

איכות הנגיף חיונית להצלחת התכנות מחדש הישיר למלנוציטים בפרוטוקול זה. השיטה של אריזה וריכוז וירוסים בפרוטוקול זה היא פשוטה וקלה לחזרה ואינה מסתמכת על כל מגיב מרוכז עזר אחר. פרוטוקול זה ניתן לעקוב בהצלחה ברוב המעבדות. כדי להבטיח את איכות הנגיף המרוכז, הנקודות הבאות זקוקות לתשומת לב מיוחדת. האחד הוא מצב התא של HEK-293T. למרות שתאי HEK-293T הם תאים מונצחים, התאים המשמשים לייצור הנגיף המרוכז חייבים להיות תאים בריאים בתוך 10 מעברים (הטיטר יורד עם מעברים גבוהים יותר).
נקודה קריטית נוספת היא חלקו של מ...

ויטיליגו היא מחלת עור המשפיעה קשות על בריאותם הגופנית והנפשית של האנשים המושפעים. מסיבות שונות, כולל הפרעות מטבוליות, עקה חמצונית, יצירת מתווכים דלקתיים, ניתוק תאים ותגובה אוטואימונית, המלנוציטים התפקודיים הולכים לאיבוד, והפרשת המלנין נעצרת, מה שמוביל להתפתחות של ויטיליגו 1,2. מצב זה מתרחש באופן נרחב והוא בעייתי במיוחד על הפנים. הטיפול העיקרי הוא שימוש סיסטמי בקורטיקוסטרואידים ובאימונומודולטורים. פוטותרפיה יכולה לשמש למחלות סיסטמיות או מקומיות, וישנם טיפולים כירורגיים, כגון השתלת עור מחורר והשתלת מלנוציטים אוטולוגית 3,4,5. עם זאת, חולים המשתמשים בטיפול תרופתי ובפוטותרפיה נוטים להישנות, ולטיפולים אלה יש השפעות טיפוליות ארוכות טווח גרועות. הטיפול הכירורגי הוא טראומטי ויעיל למדי רק 2,6. לכן, יש צורך באסטרטגיה טיפולית חדשה ויעילה עבור ויטיליגו.
התכנות מחדש של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) הופך את התאים האלה ממצבם הסופי למצב פלוריפוטנטי, תהליך המתווך על ידי גורמי השעתוק, Oct4, Sox2, Klf4 ו-c-Myc7. עם זאת, בשל האפשרות של גידולים סרטניים וזמן הייצור הארוך, טכנולוגיה זו נתקלה בספקנות כאשר יושמה על הגדרות קליניות8. תכנות מחדש ישיר הוא טכנולוגיה שגורמת לסוג אחד של תא סופני להפוך לסוג אחר של תא סופני9. תהליך זה מושג על ידי גורמי שעתוק מתאימים. תאים שונים כבר תוכננו מחדש ישירות בהצלחה, כולל קרדיומיוציטים10, נוירונים11 ותאי שיער שבלול12. חלק מהחוקרים אף תיכנתו מחדש את רקמת העור ישירות באתרה, שיכולה לשמש לתיקוןפצעים 13. היתרונות של תכנות מחדש ישיר כוללים זמני המתנה ועלויות מופחתים, סיכון נמוך יותר לסרטן, פחות בעיות אתיות והבנה טובה יותר של המנגנון העומד בבסיס קביעת גורל התא9.
למרות ששיטת התכנות מחדש הישירה נמצאת בשימוש נרחב, אין כיום שיטה מוגדרת לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים, במיוחד בגלל גורמי השעתוק הרבים להיחשב14,15. גורמי השעתוק, Mitf, Sox10 ו-Pax3, שימשו לתכנות מחדש ישיר של תאי העור למלנוציטים14. לעומת זאת, השילוב של MITF, PAX3, SOX2 ו-SOX9 שימש גם לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים אנושיים במחקר אחר15. בפרוטוקול זה, למרות השימוש בשיטת סינון שונה, אותה תוצאה הושגה עם השילוב של Mitf, Sox10 ו- Pax3 לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים כפי שתואר קודם לכן14. פיתוח מערכת ליצירת מלנוציטים מתאי עור אחרים יכול לספק תוכנית להפיכת תאי עור אחרים של חולי ויטיליגו למלנוציטים. לפיכך, חיוני לבנות שיטה פשוטה ויעילה לתכנות מחדש ישיר זה כדי ליצור מלנוציטים בהצלחה.

<table><tbody><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>0.45 &mu; מסנן M</td><td>Millipore</td><td>SLHVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול</td><td>פלקון</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>95%/100% אתנול</td><td>LANBAO</td><td>210106</td><td>מאוחסן ב-RT</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td>ריכוז מלאי 40 מ"ג/מ"ל ריכוז סופי 24 ומיקרו; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 עז נגד עכבר IgG2a</td><td>Invitrogen</td><td>A21137</td><td>דילול של 1:500 לשימוש</td></tr><tr><td>באנטיביוטיקה (עט/סטרפטוקוקוק)</td> <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Anti-TRP1/TYRP1 נוגדן</td><td>Millipore</td><td>MABC592</td><td>מארח/איזוטיפ: עכבר IgG2a תגובתיות מינים: עכבר/אדם דילול של 1:200 לשימוש</td></tr><tr><td>בנוגדנים נגד TRP2/DCT</td><td>Abcam</td><td>ab74073</td><td>מארח/איזוטיפ: ארנב IgG תגובתיות מינים: דילול עכבר/אדם של 1:200 לשימוש</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>ריכוז מלאי 10 מ"מ סופי ריכוז 3 &mu; M</td></tr><tr><td>כולרה טוקסין</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>ריכוז מלאי 0.3 מ"ג/מ"ל ריכוז סופי 20 pM</td></tr><tr><td>Cy3 עז אנטי-ארנב IgG (H+L)</td> <td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-165-144</td><td>דילול של 1:500 לשימוש</td></tr><tr><td>ב-DMEM (גלוקוז גבוה)</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>מאוחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>מאוחסן ב-RT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; C מופעל בחום לפני השימוש</td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא</td><td>G9391</td><td>מאוחסן</td></tr><tr><td>בפלסמידים RT GFP-PURO (MITF, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 ו-Snai2)</td> <td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td><td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td><td>מאוחסן ב -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>המטוקסילין</td><td>Abcam</td><td>ab220365</td><td>מאוחסן ב- RT</td></tr><tr><td>Human EDN3</td><td>אמריקאי-פפטיד</td><td>88-5-10A</td><td>ריכוז מלאי 100 &mu; M ריכוז סופי 0.1 &mu; M</td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא</td><td>H0888</td><td>ריכוז מלאי 100 ומיקרו; גרם/מ"ל ריכוז סופי 0.5 ומיקרו; g/mL</td></tr><tr><td>L-DOPA</td><td>Sigma</td><td>D9628</td><td>מאוחסן ב-RT</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>מגיב טרנספקציה, מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>ערכת צביעה C Masson-Fontana</td><td>Solarbio</td><td>G2032</td><td>מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>בלסם ניטרלי</td><td>Solarbio</td><td>G8590</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>מאוחסן ב-RT</td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>מאוחסן ב-RT</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td>ריכוז מלאי 1 mM ריכוז סופי 200 ננומטר</td></tr><tr><td>פוליברן</td><td>סיגמא</td><td>H9268</td><td>מגיב טרנספקציה פולימרי קטיוני; ריכוז מלאי 8 &mu; g/&micro; L ריכוז סופי 4 נ"ג/&מיקרו; L</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>ריכוז מלאי 4 &mu; g/mL ריכוז סופי 10 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>אינסולין אנושי רקומביננטי</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>I3536</td><td>ריכוז מלאי 10 מ"ג/מ"ל ריכוז סופי 5 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr>מו"פ<td>אנושי רקומביננטי</td><td> D</td><td>255-SC-010</td><td>ריכוז מלאי 200 &mu; g/mL ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>מאוחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>1330-20-7</td><td>מאוחסן ב-RT</td></tr></tbody></table>

תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים של עכברים למלנוציטים

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

אובדן התפקוד של מלנוציטים מוביל vitiligo, אשר משפיע ברצינות על הבריאות הפיזית והנפשית של האנשים המושפעים. כיום, אין טיפול יעיל לטווח ארוך עבור vitiligo. לכן, זה הכרחי לפתח טיפול נוח ויעיל עבור vitiligo. טכנולוגיית רפואה רגנרטיבית לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים נראית כטיפול חדשני ומבטיח בויטיליגו. זה כרוך בתכנות מחדש ישיר של תאי העור של המטופל למלנוציטים תפקודיים כדי לעזור למתן את אובדן המלנוציטים בחולים עם ויטיליגו. עם זאת, שיטה זו צריכה להיבדק תחילה על עכברים. למרות שתכנות מחדש ישיר נמצא בשימוש נרחב, אין פרוטוקול ברור לתכנות מחדש ישיר למלנוציטים. יתר על כן, מספר גורמי השעתוק הזמינים הוא מכריע. 
כאן, פרוטוקול מערכת אריזה מרוכזת של lentivirus מוצג כדי לייצר גורמי שעתוק שנבחרו לתכנות מחדש של תאי עור למלנוציטים, כולל Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 ו- Snai2. פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) נדבקו בנגיף הלנטי המרוכז עבור כל גורמי השעתוק הללו לתכנות מחדש ישיר של ה-MEFs למלנוציטים מושרים (iMels) במבחנה. יתר על כן, גורמי שעתוק אלה נבדקו, והמערכת הותאמה לתכנות מחדש ישיר למלנוציטים. הביטוי של הסמנים האופייניים של מלנין ב- iMels ברמת הגן או החלבון היה מוגבר באופן משמעותי. תוצאות אלה מצביעות על כך שתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים יכול להיות אסטרטגיה טיפולית חדשה ומוצלחת עבור ויטיליגו ולאשר את המנגנון של התפתחות מלנוציטים, אשר יספק את הבסיס לתכנות מחדש ישיר נוסף של פיברובלסטים למלנוציטים in vivo.

מאמר זה כולל את הפרוטוקולים של מערכת אריזה מרוכזת של lentivirus לייצור lentivirus של גורמי שעתוק לתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים ופרוטוקולים לסינון גורמי שעתוק ותכנות מחדש ישיר של מלנוציטים מ- MEFs.
ההצלחה של ייצור לנטי-וירוס מרוכז הוערכה על ידי התבוננות בעוצמת הפלואורסצנטיות של GFP (איור 1A) או על ידי ציטומטריית זרימה (איור 1B) לאחר הדבקת תאי HEK-293T במשך 48 שעות בנגיף לנטי לא מרוכז (1x) ובנגיף לנטי מרוכז (100x). הטיטר של...

כאן, אנו מתארים מערכת תכנות מחדש ישירה ממוטבת עבור מלנוציטים ומערכת אריזה מרוכזת של וירוסים ביעילות גבוהה המבטיחה תכנות מחדש ישיר חלק.

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

דווח על תכנות מחדש ישיר ליצירת מלנוציטים. עם זאת, גורמי שעתוק שונים משמשים במחקרים שונים. בפרוטוקול זה, אימתנו והפחתנו את מספר גורמי השעתוק עדיין עם יעילות תכנות מחדש גבוהה יותר.הקמנו מערכת תכנות מחדש ישירה כדי ליצור מלנוציטים באמצעות שלושה גורמי שעתוק בלבד, Mitf, Sox10 ו-PAX3, ושינינו את מערכת התרבית כדי להפוך אותה ליציבה וחזקה יותר. כיצד לחדש מלנוציטים תפקודיים היא שאלה משמעותית שעשויה לעזור לטפל במגבלות הטיפול במחלות דפיגמנטציה כמו ויטיליגו. התכנות מחדש הנכון מספק פרוספקטיבי הטכניקה שלנו יש את המאפיינים של נוחות, יכולת פעולה חזקה ויציבות, אשר קל יותר לקדם ולחזור.כדי להתחיל בייצור של נגיף הלנטי המרוכז, צלחת 1.5 כפול 10 עד 6 תאי HEK-293T לתוך צלחת של 60 מילימטר, ותרבית את התאים עם תווך נורמלי ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות של הדגירה, כאשר תאי HEK-293T הגיעו ל-80 עד 90% מפגש, החליפו את המדיום ב-3.5 מ"ל של DMEM, ואז דגירו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו-חמצני במשך שעתיים. לאחר הסרת התאים מהאינקובטור, החליפו את המדיום ב-DMEM המכיל 2%FBS, והוסיפו את תערובת קומפלקס הטרנספקציה שזה עתה הוכנה לתאים בצורה טיפתית.מערבבים את התערובת הנוזלית בעדינות. בסיום שמונה שעות, לשנות את מדיום התא עם 3.5 מ"ל של בינוני נורמלי. לאסוף את supernatant וירוס ב 24 ו 48 שעות.לאחר מכן, ערבבו את הווירוסים שנאספו בשתי נקודות זמן שונות וצנטריפוגות בתערובת ב-200 xg למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן מעבירים את הסופרנטנט שנאסף דרך מסנני 0.45 מיקרון כדי לאסוף את התסיס בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל. מרכזים את הווירוס המסונן על ידי צנטריפוגה ב-6, 000 xg בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה.לאחר שתסיים, ודא שכדור הנגיף נראה בתחתית הצינור החרוטי. שופכים את ה-supernatant לאט. להמסת גלולת הנגיף במדיום התקין עם נפח אחד על 100*של הווירוס.השתמשו במיקרופיפט P1000 כדי לטפטף למעלה ולמטה בעדינות עד לקבלת תערובת וירוסים מרוכזת הומוגנית פי 100. מחלקים את הנגיף המרוכז לצינורות המיקרו-צנטריפוג' כדי לאחסן אותם בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. צלחת 1 כפול 10 עד 5 תאי HEK-293T לתוך באר אחת של צלחת שש באר.תרבית תאים אלה עם המדיום הנורמלי ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות, הוסף 0.1 עד 0.2 מיקרוליטרים של הנגיף המרוכז 100x פלואורסצנטי לכל באר. לאחר מכן נוספו ארבעה ננוגרמים לכל מיקרוליטרים של מגיב הטרנספקציה הפולימרית הקטיונית לכל באר.כשמונה עד שתים עשרה שעות לאחר ההדבקה בנגיף, החליפו את המדיום במדיום הרגיל. בארבעים ושמונה שעות לאחר ההדבקה, שטפו את התבשיל עם 1 מ"ל של PBS סטרילי כדי להסיר את התאים המתים. לאחר מכן נסה את התאים באמצעות 250 מיקרוליטרים של תמיסת 0.05% טריפסין-EDTA לכל באר של צלחת בעלת שש בארות בטמפרטורת החדר.צנטריפוגה על הלוח ב 200 xg במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את גלולת התא במ"ל אחד של PBS והוסיפו את תרחיף התא לצינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה של חמישה מ"ל. לאחר מכן מניחים את הצינור לתוך ציטומטר הזרימה כדי לנתח את הדגימה.לתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים, ציפו באר אחת של צלחת תרבית תאים בת שש בארות עם תמיסת ג'לטין של 1 מ"ל של 0.1% בטמפרטורת החדר. לאחר 15 עד 30 דקות, כאשר הבאר מכוסה לחלוטין בג'לטין, שאפו לתמיסת ג'לטין 0.1%. לאחר מכן, צלחת 5 כפול 10 עד הפיברובלסטים העובריים של העכבר הרביעי, או MEFs, לתוך באר אחת של צלחת בעלת שש בארות המצופה בג'לטין של 0.1%, ותרבית את התאים למשך הלילה עם המדיום הרגיל ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו-חמצני.לאחר 24 שעות, כאשר ה- MEFs הגיעו למפגש של 40 עד 50%, החלף את המדיום במדיום הרגיל. לאחר מכן, להמיס את הנגיף הקפוא והמרוכז על קרח. חשב את נפח הנגיף שיש להוסיף באמצעות משוואה ולאחר מכן הוסף את הווירוס המרוכז עבור ששת גורמי השעתוק לכל באר, בהתאם לנפח המחושב.הוסף ארבעה מיקרוגרם לכל מ"ל של חומר הטרנספקציה הפולימרית הקטיונית לבאר. שקול את זה כמו יום אפס של זיהום lentivirus. ביום הראשון, לאחר 8 עד 12 שעות של הדבקה, החליפו את המדיום המכיל את הנגיף במדיום הנורמלי הטרי, תוך הוספת 0.5 מיקרוגרם לפורומיצין מ"ל כדי לסנן קווי תאים נגועים יציבים.ביום השני, 48 שעות לאחר ההדבקה, החליפו את מדיום העל בהדרגה במדיום התכנות מחדש. שנה רבע מהנפח הבינוני הכולל לפני שתוסיף שלושה מיקרומולרים CHIR99021. מהיום השלישי ועד היום השביעי, בהתאם למצבם של התאים, משנים את המדיום על ידי החלפתו בהדרגה בשיעור גבוה יותר של מדיום תכנות מחדש כדי לעבור למדיום התכנות מחדש המלא תוך חמישה ימים.לאחר מכן, נתקו את התאים עם 500 מיקרוליטרים של אנזים העיכול 0.05% טריפסין-EDTA למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. כאשר כשישים אחוז מהתאים צפו למעלה, עצרו את העיכול על ידי הוספת המדיום התקין, פי שניים מנפח אנזים העיכול. אספו את מתלי התא בצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל לצנטריפוגה ב-200 xg במשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.הסר את ה-supernatant לפני השהייה מחדש של גלולת התא עם מדיום התכנות מחדש. בסיום, צלחת את התאים התלויים מחדש בצלחת סטרילית של 60 מילימטר. תרבית את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו-חמצני.לאחר ארבעים ושמונה שעות של זיהום lentivirus בתאי HEK-293T, ההצלחה של ייצור לנטיוירוס מרוכז הוערכה על ידי התבוננות בעוצמת הפלואורסצנציה של GFP או על ידי ציטומטריה של זרימה. נמצא כי הטיטר של הנגיף המרוכז היה גבוה ב-10 עד ה-TU/mL ה-8. במהלך התכנות מחדש הישיר של הפיברובלסטים, המורפולוגיה של התא השתנתה בהדרגה לסינפסה התארית ולגרעיני תאים מוגדלים.עם זאת, התאים הזדקנו בהדרגה לאחר היום העשרים. הסרת גורמי השעתוק, Mitf, Pax3 או Sox10, הביאה להשתקת הביטוי של גנים מלנוציטיים, Tyr, Tyrp1 ו-Mlana, מה שמעיד על ההשפעה הגדולה ביותר על המרת פיברובלסטים למלנוציטים. לפיכך, הביטוי של גנים מלנוציטיים המושרים על ידי התכנות הישיר עם שלושה גורמי שעתוק היה גבוה יותר בהשוואה לשישה גורמי שעתוק.כדי לזהות מלנוציטים המושרים על ידי MEF, או iMels, הביטוי של סמנים מלנוציטיים, TYRP1 ו- DCT זוהה באמצעות כתמים אימונופלואורסצנטיים. יתר על כן, שיטות ההכתמה הספציפיות למלנין כגון DOPA וצביעת מאסון-פונטנה הראו תוצאות חיוביות. תאי 293T צריכים להיות מופצים באופן שווה.כמו כן, התוספת של תערובת טרנספקציה לתאים חייבת להיעשות בעדינות כדי למנוע מהתאים לצוף. הפרוטוקול יציב ומעשי וניתן להשתמש בו כדי לתכנת מחדש סוגים אחרים של תאים. הוא מצפה לספק התייחסות ואסטרטגיה לתכנות מחדש ישיר in vivo בהתחדשות מלנוציטים ברפואה עתידית.

direct-reprogramming-of-mouse-fibroblasts-into-melanocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

וידאו זה מציג את התהליך להפקת המושרה בתאי גזע pluripotent באמצעות lentivirus ועין מתנהלת המבטאים Oct4, Sox2, c-myc ו Klf4.

יצירת iPS תאים MEFS דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו Klf4

סרטון זה מתאר את השיטה המהירה לבודד ולגדל את המלנוציטים והפיברובלסטים בו זמנית מעורו של גור העכבר לאחר הלידה. תאים אלה יכולים להישמר ולתפעל במבחנה כדי לחקור ביולוגיה של תאי העור, ריפוי פצעים ומלנומה.

גידול מהיר של מלנוציטים ופיברובלסטים ראשוניים של מורין: בידוד מלנוציטים ופיברובלסטים מדגימת עור מורין שלם

דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השראת תוכנית המוגנית בפיברובלסטים עובריים של עכברים באמצעות ביטוי יתר של קבוצה מינימלית של גורמי שעתוק. טכנולוגיה זו עשויה להיות מתורגמת למערכת האנושית כדי לספק פלטפורמות למחקר עתידי של המטופואיזה, מחלות המטולוגיות והשתלת תאי גזע המטופויאטיים.

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

כאן אנו מציגים שיטה חזקה לתכנת fibroblasts עובריים הראשי לתוך cardiomyocytes פונקציונלי. דרך ביטוי של GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, מיר-1, ומיר-133 (GHMT2m) לצד עיכוב של TGF-β איתות. פרוטוקול שלנו יוצרת מכות cardiomyocytes מוקדם ככל 7 ימים שלאחר התמרה חושית עם עד 60% יעילות.

דיכוי של Pro-fibrotic איתות Potentiates בתיווך גורם התכנות של העכבר מתחלקים Fibroblasts לתוך Cardiomyocytes המושרה

כאן אנו מציגים שלנו פרוטוקול עבור הפקת המושרה אבות erythroid (iEPs) מן העכבר fibroblasts למבוגרים באמצעות מונחי-פקטור שעתוק ישיר לשושלת התכנות (DLR).

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

כאן נתאר שיטת הרלוונטית קלינית, יעילות גבוהה, ללא מזין לתכנת fibroblasts העיקרי אנושי לתוך תאי גזע pluripotent המושרה משתמש ששונה mRNAs קידוד גורמים התיכנות, בוגרת microRNA-367/302 מחקה. נכללים גם הם שיטות להערכת יעילות התיכנות, להרחיב iPSC המשובטים מושבות, לאשר את הביטוי של סמן pluripotency טרה-1-60.

מבוסס-RNA תכנות מחדש של האנושי Fibroblasts הראשי לתוך תאי גזע Pluripotent המושרה

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לייצר בו תרבויות מלנוציט ופיברובלסט מן העור של 0-4 העכברים הישנים של היום. התרבויות העיקריות הללו ניתן לשמור ומניפולציות בתוך מבחנה כדי ללמוד מגוון של תהליכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, כולל ביולוגיה של תאי העור, פיגמנטציה, ריפוי פצעים ומלנומה.

הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט

פרוטוקול זה ממחיש את האינדוקציה של תוכנית המטוגניים בתוך הגוף האנושי פיברותקיעות על ידי ביטוי נאכף של הגורמים שעתוק GATA2, GFI1B ו-FOS כדי ליצור גזע המטפאות ובתאי קדמון.

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

פרוטוקול זה מתאר את ההמרה של פיברובלסטים בעור לתוך myoblasts ואת הבידול שלהם myotubes. קווי התאים נגזרים מחולים עם הפרעות נוירומוסקולריות וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מנגנונים פתולוגיים ולבדוק אסטרטגיות טיפוליות.

תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

למד שיטה יעילה לתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים של עכברים למלנוציטים תפקודיים באמצעות שלושה גורמי שעתוק: Mitf, Sox10 ו-PAX3. השיטה משפרת יציבות ויעילות לטיפול במחלות דה-פיגמנטציה כמו ויטיליגו.

תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים של עכברים למלנוציטים

גלה סרטונים נוספים