Name: קביעת נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזיס בדגימות רקמת רשתית Ex Vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: למדו לנתח נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזיס בזמן אמת ברקמת רשתית אקס-ויו מעכבר. פרוטוקול זה מאפשר מדידת OCR ו-ECAR בדיסקיות רשתית שלמות לחקר מטבוליזם רטינלי בפיזיולוגיה ומחלה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר התוך-ארצית של מכון העיניים הלאומי (ZIAEY000450 ו- ZIAEY000546).

<ol><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+In+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: In sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
<li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+Brain%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye Brain. 2, 99-116 (2010).</li>
<li>Yu, D. Y., Cringle, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+distribution+and+consumption+within+the+retina+in+vascularised+and+avascular+retinas+and+in+animal+models+of+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retina+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease.</a> Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).</li>
<li>Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in retinal diseases.</a> Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).</li>
<li>Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+energy+demands+control+vascular+supply+of+the+retina+in+development+and+disease%3A+The+role+of+neuronal+lipid+and+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retina+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism.</a> Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).</li>
<li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%2C+lactate%2C+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li>
<li>Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+to+see-Drivers+of+aerobic+glycolysis+in+the+mammalian+retina%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).</li>
<li>Wright, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+and+mitochondrial+control+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration.</a> Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).</li>
<li>Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways to neurodegeneration.</a> Nature Medicine. 10, Suppl 2-9 (2004).</li>
<li>Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+retinal+metabolic+dysfunction+at+the+center+of+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).</li>
<li>Vlachantoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+severe+mitochondrial+oxidative+stress+and+a+protective+effect+of+low+oxygen+in+mouse+models+of+inherited+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).</li>
<li>Grenell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+MPC1+reprograms+retinal+metabolism+to+impair+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).</li>
<li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+degeneration%3A+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li>
<li>Jarrett, S. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+oxidative+stress+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).</li>
<li>Rozing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%3A+A+two-level+model+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retina+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis.</a> Progress in Retina Eye Research. 76, 100825(2020).</li>
<li>Yokosako, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolysis+in+patients+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Ophthalmology+Journal%22%5BJournal%5D)">Glycolysis in patients with age-related macular degeneration.</a> Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).</li>
<li>Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy.</a> Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).</li>
<li>Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+dysregulation+and+neurovascular+dysfunction+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy.</a> Antioxidants. 9 (12), Basel. (2020).</li>
<li>Futterman, S., Kinoshita, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+the+retina.+I.+Respiration+of+cattle+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).</li>
<li>Linsenmeier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+light+and+darkness+on+oxygen+distribution+and+consumption+in+the+cat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina.</a> Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).</li>
<li>Medrano, C. J., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+consumption+in+the+rat+outer+and+inner+retina%3A+light-+and+pharmacologically-induced+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition.</a> Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).</li>
<li>Kooragayala, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+oxygen+consumption+in+retina+ex+vivo+demonstrates+limited+reserve+capacity+of+photoreceptor+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li>
<li>Adlakha, Y. K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+the+retina+ex+vivo%3A+applications+for+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).</li>
<li>Agilent Mitocondrial stress test user guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021).</li>
<li>Agilent Glycolytic rate assay user guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021).</li>
<li>Agilent wave 2.6 user guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/S7894-10000_Rev_C_Wave_2_6_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/S7894-10000_Rev_C_Wave_2_6_User_Guide.pdf</a> (2021).</li>
<li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf">https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf</a> (2021).</li>
<li>Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf</a> (2021).</li>
<li>Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf</a> (2021).</li>
<li>Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf</a> (2021).</li>
<li>Agilent sensor cartridges and cell culture microplates. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf</a> (2021).</li>
<li>Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021).</li>
<li>Fan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioassay+to+measure+energy+metabolism+in+mouse+colonic+crypts%2C+organoids%2C+and+sorted+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).</li>
<li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).</li>
<li>Corso-Diaz, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+identifies+DNA+methylation+signatures+of+aging+in+rod+photoreceptors+associated+with+alterations+in+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism.</a> Cell Reports. 31 (3), 107525(2020).</li>
<li>Berkowitz, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+in+outer+retina+contributes+to+light-evoked+increase+in+hydration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).</li>
<li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן מפורטות הוראות לביצוע בדיקות מבוססות מיקרו-פלט של נשימה מיטוכונדריאלית ופעילות גליקוליזה באמצעות דיסקים של ניקוב רשתית ex vivo, שניתחו זה עתה. הפרוטוקול עבר אופטימיזציה ל: 1) להבטיח שימוש במדיום בדיקת אסאי מתאים לרקמת רשתית ex vivo ; 2) להעסיק בגודל הנכון של דיסקים ניקוב רשתית כדי לקבל קריאות OCR ו- ECAR כי נופלים בתוך טווח הזיהוי האופטימלי של המכונה; 3) ציפוי רשת מוסיף כדי לשפר את הדבקות של אגרוף רשתית לקריאה יציבה במהלך מחזור המדידה; 4) שימוש בריכוז אופטימלי של כל תרכובות סמים מוזרקות; ו 5) להבטיח...

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים המווסתים את חילוף החומרים התאי, איתות, הומאוסטזיס, אפופטוזיס על ידי תיאום תהליכים פיזיולוגיים חיוניים מרובים1. המיטוכונדריה משמשת תחנת הכוח בתא ליצירת אדנוסין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחן חמצוני (OXPHOS) ולספק אנרגיה התומכת כמעט בכל האירועים התאיים. רוב החמצן התאי מטבוליזם במיטוכונדריה, שם הוא משמש כקבל האלקטרונים הסופי בשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC) במהלך נשימה אירובית. כמויות נמוכות של ATP ניתן גם לייצר גליקוליזה בציטוסול, שבו גלוקוז מומר pyruvate, אשר ניתן להמיר עוד יותר לקטט או להיות מועבר לתוך מיטוכונדריה מחומצן אצטיל-CoA, מצע במחזור חומצה tricarboxylic (מחזור TCA).
הרשתית היא אחת הרקמות הפעילות ביותר מבחינה מטבולית ביונקים2, המציגה רמות גבוהות של נשימה מיטוכונדריאלית וצריכת חמצן גבוהה מאוד3. מוט ו photoreceptors חרוט מכילים צפיפות גבוהה של מיטוכונדריה4, ו OXPHOS מייצר את רוב ATP ברשית5. בנוסף, הרשתית מסתמכת גם בכבדות על גליקוליזה אירובית6,7 על ידי המרת גלוקוז לקטט5. פגמים מיטוכונדריאליים קשורים למחלות ניווניות שונות8,9; ועם דרישות האנרגיה הגבוהה הייחודיות שלה, הרשתית פגיעה במיוחד לפגמים מטבוליים, כולל אלה המשפיעים על OXPHOS4 מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס10. תפקוד לקוי מיטוכונדריאלי ופגמים בגליקוליזיס מעורבים במחלות ניווניות ברשתית11,12 ו- macular13, ניוון מקולרי הקשור לגיל10,14,15,16, ורטינופתיה סוכרתית17,18. לכן, מדידות מדויקות של נשימה מיטוכונדריאלית וטליקוליזה יכולות לספק פרמטרים חשובים להערכת שלמות ובריאות הרשתית.
ניתן למדוד נשימה מיטוכונדריאלית באמצעות קביעת שיעור צריכת החמצן (OCR). בהתחשב בכך ההמרה של גלוקוז pyruvate ולאחר מכן לקטט תוצאות שחול של פרוטונים לתוך חמצה של הסביבה החוץ תאית, מדידות של שיעור החמצה חוץ תאית (ECAR) לספק אינדיקציה של שטף גליקוליזה. כמו הרשתית מורכבת מסוגי תאים מרובים עם יחסים אינטימיים וסינרגיה פעילה, כולל חילופי מצעים6, זה הכרחי לנתח את התפקוד המיטוכונדריאלי ואת חילוף החומרים בהקשר של רקמת הרשתית כולה עם למינציה ומעגלים שלמים. במשך העשורים האחרונים, אלקטרודות O2 מסוג קלארק ומיקרו-ectectrodes חמצן אחרים שימשו למדידת צריכת חמצן ברשתית19,20,21. אלקטרודות חמצן אלה יש מגבלות עיקריות ברגישות, דרישה של נפח מדגם גדול, ואת הצורך ערבוב מתמשך של דגימת השעיה, אשר בדרך כלל מוביל להפרעה של הקשר הסלולר והרקמות. הפרוטוקול המתואר כאן פותח באמצעות טכניקה מבוססת מיקרו-פלאט, פלואורסצנטיות למדידת חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית ברקמת רשתית עכבר ex vivo ניתחה זה עתה. זה מאפשר מדידות בזמן אמת באמצע תפוקה של OCR ו- ECAR בו זמנית באמצעות מדגם קטן (פונץ '1 מ"מ) של רקמת רשתית ex vivo תוך הימנעות הצורך השעיה ערבוב מתמשך.
הוכח כאן הוא ההליך הניסיוני לבדיקת מתח מיטוכונדריאלי ובוחן קצב גליקוליטי על דיסקי ניקוב רשתית שזה עתה נותחו. פרוטוקול זה מאפשר מדידה של פעילויות מטבוליות הקשורות במיטוכונדריה בהקשר של רקמת ex vivo. בשונה מבוחות שבוצעו באמצעות תאים מתורבתים, הקריאות המתקבלות כאן משקפות את חילוף החומרים של האנרגיה המשולבת ברמת הרקמה ומושפעות מאינטראקציות בין סוגי התאים השונים בתוך הרקמה. הפרוטוקול משתנה מגרסה שפורסמה בעבר22,23 כדי להסתגל לדור החדש של מנתח השטף החוץ-תאי Agilent Seahorse 24-בארות (XFe24) עם צלחת לכידת אי. בינוני אסאי, ריכוזי תרכובת הזרקה, ומספר/משך של מחזורי בדיקת אופטימיזציה גם עבור רקמת הרשתית. פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב ניתן להכנת דיסקים ניקוב רשתית. מידע נוסף על הגדרת התוכנית וניתוח נתונים ניתן לקבל ממדריך המשתמש של היצרן24,25,26.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>2-דאוקסי גלוקוז (2-DG), תמיסת מלאי 500 מ"מ</td><td>סיגמא</td><td>D6134</td><td>מתמוססים במדיום סוסון ים XF DMEM, מכינים מבעוד מועד</td></tr><tr><td>מחט 30 מד</td><td>BD Precision Glide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>אנטימיצין A, תמיסת מלאי 10 מ"מ</td><td>סיגמא</td><td>A8674</td><td>מתמוססים ב-DMSO, מתכוננים מבעוד מועד</td></tr><tr><td>Bam15, מלאי 10 מ"מ פתרון</td><td>TimTec</td><td>ST056388</td><td>להתמוסס ב-DMSO, להתכונן מבעוד</td></tr> מועד <tr><td>מנקב ביופסיה, 1 מ"מ</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning מדעי החיים</td><td>CB40240</td><td></td></tr><tr><td>תא חנק CO2 מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיסקציה-Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>דיסקציה של קצה ישר</td></tr><tr><td> מלקחיים-Dumont #7</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11274-20</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>חיתוך</td></tr> קצה מעוקל <tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים Graefe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>קצה מעוקל ומשונן</td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Fine Science</td><td>Tools 15004-08</td><td>קצה</td></tr><tr><td>מעוקל תמיסת NaOH, 1 M</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S8263</td><td>תמיסה מימית, הכנה מבעוד מועד</td></tr><tr><td>רוטנון, תמיסת מלאי 10 מ"מ</td><td>סיגמא</td><td>R8875</td><td>התמוססות ב-DMSO, הכנה מבעוד מועד</td></tr><tr><td>מדיום כיול סוסון ים</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 1.0 M גלוקוז</td><td>Agilent</td><td>103577-100</td><td></td></tr><tr><td>סוסון ים XF 100 מ"מ פירובט</td><td>Agilent</td><td>103578-100</td><td></td></tr><tr><td>סוסון ים XF 200 מ"מ גלוטמין</td><td>Agilent</td><td>103579-100</td><td></td></tr><tr><td>סוסון ים XF DMEM בינוני</td><td>Agilent</td><td>103575-100</td><td>pH 7.4, עם 5 מ"מ HEPES</td></tr><tr><td>Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak</td><td>Agilent</td><td>103518-100</td><td>המכיל מחסנית חיישן ומיקרופלטת לכידת איים</td></tr><tr><td>סוסון ים XFe24, מנתח שטף סלולרי נוסף</td><td>תמיסת</td> נתרן ביקרבונט Agilent<td></td><td></td></tr><tr><td>, 0.1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>תמיסה מימית, הכינו מבעוד מועד</td></tr><tr><td>מברשת ריסים עדינה</td><td>טד פלה</td><td>113</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזיס בדגימות רקמת רשתית ex vivo

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

נשימה מיטוכונדריאלית היא מסלול קריטי לייצור אנרגיה בכל התאים, במיוחד קולטני אור ברשתית בעלי חילוף חומרים פעיל מאוד. בנוסף, קולטני אור מציגים גם גליקוליזה אירובית גבוהה כמו תאים סרטניים. מדידות מדויקות של פעילויות מטבוליות אלה יכולות לספק תובנות חשובות על הומאוסטזיס תאי בתנאים פיזיולוגיים ובמדינות מחלה. בדיקות מבוססות מיקרו-לוחית בעלות תפוקה גבוהה פותחו כדי למדוד נשימה מיטוכונדריאלית ופעילויות מטבוליות שונות בתאים חיים. עם זאת, רובם המכריע של אלה מפותחים עבור תאים מתורבתים ולא עברו אופטימיזציה עבור דגימות רקמה שלמה עבור יישום ex vivo. מתואר כאן פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב, באמצעות טכנולוגיית פלואורסצנטיות מבוססת מיקרופלסטיט, כדי למדוד ישירות את קצב צריכת החמצן (OCR) כאינדיקטור לנשימה מיטוכונדריאלית, כמו גם שיעור החמצה חוץ תאית (ECAR) כאינדיקטור לגליקוליזיס, ברקמת רשתית ex vivo שלמה. שיטה זו שימשה כדי להעריך בהצלחה פעילויות מטבוליות רשתית עכבר למבוגרים ולהדגים את היישום שלה בחקירת מנגנונים תאיים של הזדקנות ומחלות.

הנתונים המדווחים כאן הם בדיקת לחץ מיטוכונדריאלית מייצגת המציגה עקבות זיהוי התווים האופטי (איור 1) ובוחן קצב גליקוליטי המציג עקבות זיהוי OCR ועקבות ECAR (איור 2), שבוצעו באמצעות דיסקים של ניקוב רשתית 1 מ"מ טריים מעכברי Nrl-L-EGFP מהונדסים בני 4 חודשים (רקע C57B/L6). עכברים אלה מבטאים GFP במיוחד בפוטורפטורים מוט מבלי לשנות התפתחות רשתית נורמלית, היסתולוגיה, ופיזיולוגיה, היו בשימוש נרחב כמו פקדים מסוג בר במחקר רשתית. נעשה שימוש בשני...

מתואר כאן פרוטוקול מפורט לביצוע בדיקת מתח מיטוכונדריאלית ובוחן קצב גליקוליטי בדגימות רקמת רשתית ex vivo באמצעות ביואנלייזר מסחרי.

קביעת נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזיס בדגימות רקמת רשתית Ex Vivo

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

פרוטוקול זה מספק ניתוח בזמן אמת של שני מסלולים ביו-אנרגטיים עיקריים: נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזה ברקמות רשתית עכבר ex vivo ניתחו זה עתה. ניתוח סוסוני הים המסורתי התמקד בתאים חד-שכבתיים מתורבתים, בעוד פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור פעילות מיטוכונדריאלית ברקמות שזה עתה נותחו, במיוחד ברשתית. טכניקה זו משמשת לחקר הפעילויות של המיטוכונדריה ודגלי הגליקוליזיס ברשתיות של דגמי עכבר ניוון רשתית תורשתית.זהו כלי שימושי לחקר הרשתית ויש לו גם פוטנציאל להיות מיושם על סוג אחר של רקמה לפתח טיפולים פוטנציאליים. החלק הקשה ביותר בפרוטוקול זה הוא להשיג דיסקי ניקוב איכותיים רשתית עכבר ניתחו זה עתה, ולכן מומלץ כי לאדם שיבצע טכניקה זו יש כישורים טובים לנתח רשתית. יום לפני הניסוי, פתח את קלטת מחסנית החיישן והוסף מיליליטר אחד של מדיום כיול לכל באר של צלחת השירות.דגירה לילה באינקובטור ללא פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפעיל את הפלורופורים. ביום הניסוי, להכין בינוני אסאי בתרופות מורכבות לדלל מהמלאי. לחמם את בינוני אסאי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.הגדר את תוכנית ההסמכה על המכונה כמתואר בכתב היד של הטקסט. פתח את המכסה של הקלטת המכילה תוספות רשת. Pipette שמונה מיקרוליטרים של תערובת הציפוי לכל תוספת רשת, ולאחר מכן להשתמש קצה פיפטה כדי להפיץ בעדינות את הטיפה סביב כדי להפיץ את תערובת הציפוי באופן שווה לאו

determination-mitochondrial-respiration-glycolysis-ex-vivo-retinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטות לביופסיה של lateralis vastus, הכנת המיטוכונדריה מטוהרת, ופרופיל respirometric מתוארות. השימוש בשרירים קטן נפח עושה בטכניקה זו מתאימה ליישומי מחקר קליניים.

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

השיטות המוצגות מספקות הוראות שלב אחר שלב לביצוע אוסף של בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרו-צלחת באמצעות מיטוכונדריה מבודדת מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר. מבחנים אלה מסוגלים למדוד שינויים/התאמות מכניסטיות בצריכת החמצן המיטוכונדריאלית במודל נפוץ של בעלי חיים.

באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

respirometry ברזולוציה גבוהה משמש לקביעת צריכת חמצן המיטוכונדריה. זוהי טכניקה פשוטה כדי לקבוע מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה, ויושרת הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.

ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

טכניקה זו מתארת הקלטה בזמן אמת של צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית ברקמות רשתית העכבר explanted באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

פיתחנו פרוטוקול מעשי וגישה אנליטית להערכת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי ויכולת העברת אלקטרונים בהומוגנטים של גידול טרי. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לסקור פונקציות מיטוכונדריאליות שונות התורמות ייזום סרטן, התקדמות, תגובה לטיפול.

קביעה אנליטית של תפקוד מיטוכונדריאלי של הומוגנטים של גידול מוצק מובחר

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

המצב המטבולי של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית האנושית (H-RPE) משקף את בריאותם ותפקודם. מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לבחינת שטף מטבולי בזמן אמת של H-RPE באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

ניתוח בזמן אמת של ביואנרגטיקה בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים בבני אדם באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

אנו מציגים מכשיר חדשני למדידת קצבי צריכת חמצן (OCR) בתרביות אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE). המכשיר יכול למדוד OCR במשך שבועות בכל פעם על RPE גדל על לוחות תרבית תאים סטנדרטיים עם מדיה סטנדרטית בעוד הלוחות נמצאים באינקובטור תרבית תאים סטנדרטי.

ניטור ארוך טווח של שיעורי צריכת החמצן בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית מובחנות ומקוטבות מאוד

פרוטוקול זה מתאר דרך חסכונית לביצוע בדיקת מאמץ גליקוליזית לכימות תכנות מחדש מטבולי במיקרוגליה ראשונית של העכברים. לאחר בידוד וגירוי דלקתי, נמדד קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR) באמצעות מגיבים טריים ומותאמים ל-pH, ולאחר מכן נרמול חלבונים כדי לאפשר הערכה מדויקת וניתנת לשחזור של היסטים גליקוליטיים.

חקר גליקוליזה במיקרוגליה ראשונית באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאית

למדו לנתח נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזיס בזמן אמת ברקמת רשתית אקס-ויו מעכבר. פרוטוקול זה מאפשר מדידת OCR ו-ECAR בדיסקיות רשתית שלמות לחקר מטבוליזם רטינלי בפיזיולוגיה ומחלה.

קביעת נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזיס בדגימות רקמת רשתית Ex Vivo

גלה סרטונים נוספים