הקלטת פעילות רשת במעגלים נוסיקפטיים בעמוד השדרה באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרוניקה
9 בפברואר 2022
מתואר השימוש המשולב בטכנולוגיית מערך מיקרו-אלקטרודים ובגירוי כימי המושרה על-ידי 4-אמינו-פירידין לחקר פעילות נוציצפטיבית ברמת הרשת בקרן הגבית של חוט השדרה.
הכנת פרוסת עמוד השדרה MEA 4-AP שתוארה בפניכם מספקת פלטפורמה לחקר הקישוריות של מעגלי קרן הגב וכיצד רשתות אלה מתקשרות במהלך עיבוד חושי בעמוד השדרה. המתודולוגיה המוצגת מאפשרת לחקור את פעילות מעגלי הקרן הגבית ברמה אזורית מקרוסקופית של רזולוציה. הכנה זו יכולה לשמש ככלי סינון מהיר להערכת היכולת של תרכובות לשבש איתות במעגלים חושיים בעמוד השדרה.
שיטה זו מסייעת לגשר על הפער בהבנתנו כיצד פעילותם של סוגי תאים ספציפיים ומעגלי מיקרו קטנים משפיעה על אוכלוסיות גדולות של נוירונים לעצב לאחר מכן את התפוקה של תגובות התנהגות הקרן הגבית ובסופו של דבר את חוויית הכאב. כדי להתחיל, למלא את MEA היטב עם סרום סוס במשך 30 דקות. לאחר הסרת הסרום, יש לשטוף היטב את ה-MEA חמש פעמים במים מזוקקים עד שהמים המזוקקים הופכים ללא מוקצפים.
לאחר מכן, מלא את הבאר ב- CSF מלאכותי. לאחר עריפת העכבר המרדים, הסר את העור מעל אזור הבטן על ידי ביצוע חתך קטן בעור ברמת הירכיים. לאחר מכן, משכו את העור משני צדי החתך בצורה רוסטרלית עד שכל העור מוסר מהחלק העליון של כלוב הצלעות לחלק העליון של האגן, הן בגחון והן בגב.
לאחר הנחת הגוף על קרח, השתמש בגישה גחונית כדי לחשוף את עמוד החוליות על ידי הסרת הקרביים וחיתוך דרך הצלעות לרוחב אל עצם החזה. הסר את כלוב הצלעות הגחוני, הן את עצם השכמה, ואת הגפיים התחתונות ואת האגן. העבר את עמוד החוליות והכנת הצלעות לאמבטיית ניתוח המכילה סוכרוז קר כקרח מלאכותי CSF.
הצמד את כל ארבע פינות ההכנה על ידי הנחת סיכות דרך שרירי הגב התחתון והצלעות העליונות המחוברות. הסר את כל רקמות השרירים והחיבור מעל פני הגחון של החוליות עם הרונגורים וזהה את אזור החוליות מעל הגדלת הלומבו-עצם, הנמצאת בערך מתחת לגופי החוליות T12-L2. הסר את גוף החוליה לאזור ההרחבה הלומבו-מקודש כדי לגשת לחוט השדרה היושב על תעלת החוליות.
באמצעות מספריים קפיציים מעוקלים, חותכים דרך פדיקלים חוליות באופן דו-צדדי תוך כדי הרמה ומשיכה של גוף החוליות באופן רוסטרלי כדי להפריד בין ההיבט הגחוני והגבי של החוליות ולחשוף את חוט השדרה. לאחר הוצאת גופי החוליות כדי לחשוף את הגדלת הלומבו-עצם, נקו בזהירות את השורשים הנותרים המעגנים את חוט השדרה במספריים קפיציים עד שהחוט צף חופשי. בודדו את חוט השדרה עם חתכים רוסטרליים וקאודאליים מעל ומתחת להגדלה הלומבו-שקולה כדי להפוך את אזור המטרה של החוט לצוף חופשי.
עבור פרוסות רוחביות, הרימו והניחו את הקטע הלומבו-sacral על ידי מסלול מחובר על גוש פוליסטירן מקדים עם תעלה רדודה שנחתכה במרכז. לאחר מכן, השתמש בדבק ציאנואקרילט כדי לחבר את הבלוק והכבל לפלטפורמת החתך ולהניח אותו באמבט החיתוך המכיל תבשיל CSF מלאכותי של סוכרוז קר כקרח. לאחר קבלת הפרוסות בעובי של 300 מיקרומטר, העבירו את הפרוסות לתא דגירה של ממשק אוויר המכיל CSF מלאכותי מחומצן ואפשרו לפרוסות להתאזן במשך שעה בטמפרטורת החדר.
כדי להתחיל להקליט את פעילות הקרן הגבית, העבירו את הפרוסה מהאינקובטור לבאר MEA באמצעות פיפטת פסטר גדולה מלאה ב-CSF מלאכותי והוסיפו CSF מלאכותי נוסף. השתמשו במברשת צבע עדינה לשיער קצר כדי למקם את הפרוסה מעל מערך הקלטת 60 האלקטרודות. לאחר מכן, הניחו צוואר משוקלל מעל הרקמה כדי להחזיק אותה במקומה ולקדם מגע טוב עם אלקטרודות MEA.
מקם את ה- MEA בשלב ראש ההקלטה. בדוק את מיקום הרקמה מעל האלקטרודות באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לאשר שכמה שיותר אלקטרודות נמצאות תחת ה- DH השטחי. ודא שלפחות שתיים עד שש אלקטרודות אינן יוצרות קשר עם הפרוסה. לאחר חיבור המצלמה למכשיר, צלם תמונת ייחוס של הפרוסה ביחס ל- MEA לשימוש במהלך הניתוח.
לאחר מכן, לחץ על הפעל DAQ בתוכנת ההקלטה ואשר כי כל האלקטרודות מקבלות אות ברור. לאחר מכן, חברו את קווי הכניסה והיציאה של פרפוזיה ל-MEA המלאים היטב ב-CSF מלאכותי והפעילו את מערכת הזלוף. בדקו את קצב הזרימה וודאו שהיציאה מספיקה כדי למנוע הצפה של ה-superfusate.
לאחר שיווי המשקל של הרקמה במשך חמש דקות, רשמו את נתוני הבסיס הגולמיים למשך חמש דקות. הזיזו את קו הכניסה של פרפוזיה מ-CSF מלאכותי לתמיסת 4-אמינופירידין והמתינו במשך 12 דקות עד שהפעילות הקצבית המושרה ב-4 אמינופירידין תגיע למצב יציב. לאחר מכן, הקלט חמש דקות של פעילות המושרה של 4-aminopyridine והיה מוכן להקלטות הבאות כדי לבדוק את התרופות או לבדוק את היציבות של 4-aminopyridine.
לאחר כל סשן הקלטה, שטפו את הקווים ב-CSF מלאכותי. לאחר הסרת ה- MEA משלב הראש והסרת הרשת והרקמה מבאר ה- MEA, שטפו את ה- MEA והרשת ב- CSF מלאכותי וחזור על כל התהליך עם פרוסה חדשה. פתח את תוכנת הניתוח וטען את פריסת הניתוח המוכנה מראש.
פתח את הקובץ המעניין ובטל את הבחירה באלקטרודת הייחוס ובכל אלקטרודות הנחשבות לרועשות יתר על המידה. הגדר את חלון הזמן לניתוח. לאחר מכן, עבור לכרטיסיית המסנן חוצה ערוצים.
בחר את אלקטרודות ההתייחסות וההתייחסות המורכבות בהתבסס על התמונה שצולמה וההערות שנעשו במהלך הניסוי ולחץ על Explore לפני שתמשיך. עבור לכרטיסיית המסנן EAP והחל מסנן Butterworth מסדר שני עם מעבר גבוה כדי להסיר פעילות LFP. עבור לכרטיסיית המסנן LFP והחיל מסנן מעבר פס מסדר שני של Butterworth כדי להסיר פעילות EAP.
בכרטיסייה גלאי EAP, הקפד לבחור סף אוטומטי, סמן את תיבות הקצה העולות והיורדות והגדר את הזמן המת לשלוש אלפיות השנייה. כדי להגדיר סף חיובי ושלילי, בדוק את הנתונים על-ידי חזרה למסך מנתח הנתונים הגולמי, הזזת סמן הזמן, חזרה לכרטיסיית גלאי EAP ולחיצה על explore. חזור על התהליך עד שסף הזיהוי המוגדר יתפוס EAPs מבלי ללכוד רעש או פעילות לא פיזיולוגית.
בכרטיסייה גלאי LFP, הקפד לבחור את הסף הידני, לסמן את תיבות הקצה העולות והיורדות ולהגדיר את הזמן המת לשלוש אלפיות השנייה. הגדר סף לאלקטרודה אחת, ולאחר שהיית מרוצה, בחר להחיל על כולם ולאחר מכן לחץ על ניתוח התחלה. יישום האמבטיה של אנטגוניסט תעלת הנתרן המגודר במתח טטרודוטוקסין ביטל הן את פעילות ה- EAP והן את פעילות ה- LFP, ואישר את תלות הספייק של אותות אלה.
היציבות של פרמטרי פעילות המושרים 4-aminopyridine התאפיינה עבור EAP או LFP. כל מאפייני הפעילות בתוספת צירוף מקרים של פעילות עבור LFPs היו יציבים בהתבסס על הדמיון של 4-aminopyridine המושרה פעילות ב 4-aminopyridine המושרה ב 12 דקות לאחר יישום 4-aminopyridine ו 15 דקות מאוחר יותר. ה-EAPs או ה-LFPs של התכונה התאפיינו בעלייה במספר האירועים המקריים שזוהו על פני אלקטרודות מרובות.
מספר האלקטרודות הסמוכות המקושרות, ועוצמת הקשרים בין אלקטרודות סמוכות ל-LFPs בעקבות גירוי 4-אמינופירידין ולאחר מכן יציבות יחסית. כיוון הפרוסה הוא שיקול חשוב להכנות במבחנה. גירוי 4-aminopyridine גרם לפעילות ריתמית דומה ב-SDH ללא קשר לכיוון הפרוסה.
לבסוף, כדי לשפוך אור נוסף על הרלוונטיות של הפעלת 4-aminopyridine של רשתות ה-DH, תמיסת CSF מלאכותית מוגברת של אשלגן הופעלה והוכחה כמעוררת תגובת DH דומה לגירוי 4-אמינופירידין. שלבים מרכזיים בפרוטוקול הם בהכנת הרקמות ובמיקום של מקטעים, המבטיחים שהרקמה בריאה באמצעות דיסקציה זהירה, אך בזמן, כמו גם מיקום אופטימלי עדין של הרקמה על ה- MEA יסייעו בהשגת תוצאות איכותיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוטוקול לשימוש במערכי מיקרו-אלקטרודות (MEAs) להקלטה ולניתוח של פעילות חשמלית ברמת הרשת בחתכים של קרן הגב (DH) של חוט השדרה בעכברים. על ידי גירוי כימי של מעגלי ה-DH באמצעות 4-aminopyridine (4-AP), השיטה מאפשרת ניטור ברזולוציה גבוהה ובמספר אתרים של פעילות עצבית קצבית, ובכך מספקת פלטפורמה למחקר של עיבוד תחושתי בחוט השדרה ולסריקת תרכובות אנטי-נוציצפטיות פוטנציאליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- מחקר כאב
רקע
- הקרן האחורית (dorsal horn) של חוט השדרה קריטית לעיבוד אותות כאב.
- מרבית המחקרים מתמקדים בנוירונים בודדים או במעגלים קטנים, מה שמגביל את ההבנה של דינמיקת רשת רחבה יותר.
- מערכי מיקרו-אלקטורודות מאפשרים הקלטה סימולטנית מנוירונים רבים, ומספקים תובנות לגבי פעילות ברמת הרשת.
- הבנת הפעילות של רשת ה-DH חשובה למחקרי כאב ולפיתוח תרופות.
מטרת המחקר
- ביסוס שיטה הניתנת לשחזור להקלטת פעילות רשת ה-DH באמצעות MEAs בחתכים של חוט השדרה של עכבר.
- אפיון ההשפעות של גרייה המושרית על ידי 4-AP על מעגלי ה-DH.
- אספקת פלטפורמה לסריקה מהירה של תרכובות המודולטיביות של עיבוד תחושתי בחוט השדרה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת פרוסות של חוט השדרה של עכבר, עם התמקדות בהרחבה הלומבסקראלית (lumbo-sacral enlargement).
- הנחת הפרוסות על MEAs להקלטה חשמלית ממספר אתרים.
- גירוי כימי של מעגלי ה-DH באמצעות 4-aminopyridine (4-AP) ובמקרים מסוימים, נוזל CSF מלאכותי עם ריכוז גבוה של אשלגן.
- ניתוח של פוטנציאלי פעולה חוץ-תאיים (EAPs) ופוטנציאלי שדה מקומיים (LFPs) באמצעות תוכנה ייעודית וטכניקות סינון.
תוצאות עיקריות
- 4-AP משרה פעילות קצבית ויציבה המוגבלת ל-DH השטחי, הניתנת לזיהוי במספר אלקטרודות.
- פעילות EAP ו-LFP כאחד מבוטלת על ידי טטרודוטוקסין, מה שמאשר את תלותן בפוטנציאלי פעולה המתווכים על ידי תעלות נתרן.
- פרמטרי הפעילות נותרים יציבים לאורך זמן ועקביים בין אוריינטציות שונות של פרוסות.
- רמות גבוהות של אשלגן מעוררות תגובות DH דומות, דבר התומך ביכולת ההכללה של הגישה.
מסקנות
- הפרוטוקול המבוסס על MEA מאפשר ניתוח חסון וברזולוציה גבוהה של פעילות רשתות DH in vitro.
- שיטה זו מגשרת על הפער בין מחקרי תא בודד לבין הבנה ברמת הרשת של עיבוד חושי עמודי שדרה.
- הפלטפורמה מתאימה לסריקת תרכובות אנטינוציצפטיביות חדשות ולחקר רקמות של מודלי מחלה או רקמות שעברו שינוי גנטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקלטה ברזולוציה גבוהה ברמת הרשת במעגלים נוציצפטיביים בעמוד השדרה נותנת מענה לפער קריטי בהבנת הוויסות של נתיבי כאב ומעורבות המטרה. זרימת העבודה המבוססת על MEA מאפשרת הערכה כמותית ומהירה של השפעות תרכובות על פעילות הקרן הדורסלית, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בשלבים מוקדמים של גילוי משככי כאבים. פלטפורמה זו משפרת את הרציפות התרגומנית מחקירה מכניסטית לסריקה פרה-קלינית, ובכך משפיעה ישירות על מיון הפורטפוליו וקידום מותאם סיכונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של קישוריות מעגלים בקרן הגבית ותיקוף תפקודי של מטרות במסלולי כאב.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי קישור תגובות ברמה התאית ורמת הרשת למודולציה של מטרות מועמדות.
- מסייע בביסוס ביטחון ניבוי לגבי מעורבות המטרה באמצעות מיפוי כמותי של פעילות עצבית במספר אתרים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות מאושרות של פרוסות חוט השדרה עבור תהליכי סינון של תרכובות בהמשך העבודה.
- מספק קריאות סטנדרטיות, הניתנות לשחזור וכמותיות של פעילות רשת לאורך מספר אלקטרודות.
- מאפשר סינון מהיר וניתן להרחבה של תרכובות אנטינוציצפטיביות (antinociceptive) להשגחה על שיבוש תפקודי של סיגנלינג נוציצפטיבי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מודלים רלוונטיים למחלה על ידי התאמה לרקמות מעכברים נאיביים, עכברים עם כאב כרוני ועכברים שעברו שינוי גנטי.
- מספק רצף מהגילוי המכניסטי ועד לתיקוף פרה-קליני של מועמדים לאנלגזיה.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות כימות של השפעות פרמקודינמיות ברמת הרשת.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו, המבוססת על MEA, משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד לאישור פרה-קליני בשרשראות מחקר של כאב.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובהבהרת מסלולים באמצעות מיפוי תגובות רשת לשיבושים כימיים וגנטיים.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך הערכת תרכובות במערכות מתוקפות של פרוסות ไขสันหลัง (spinal slice).
- אנליטיקה: מספק מדידות רב-אלקטרודיות ותוצאות סטטיסטיות להשוואה חסונה של תנאים ניסויים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים למודלים פרה-קליניים, ובכך תומך בהתאמת סמנים ביולוגיים וברלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לצורך תיקוף מטרות מתמשך וסריקת תרכובות בתוכניות מחקר של כאב.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות כאב.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והרחבה של בדיקות אלקטרופיזיולוגיות ברמת הרשת לצורך סריקה הדירה.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להסרת סיכונים תפקודית בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום מועמדים לאנלגזיקה על בסיס שיבוש רשתי כמותי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח של חוט השדרה, הכנת פרוסות והקלטה אלקטרופיזיולוגית.
- דורש גישה לציוד של מערך מיקרו-אלקטרודות (microelectrode array) ותוכנות ניתוח ייעודיות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים לטיפול ברקמה ולניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של עכברים, כולל עכברים נאיביים (naïve), עכברים עם מחלה וקווי עכברים שעברו שינוי גנטי.
- תלוי בבריאות הרקמה ובמיקום מדויק של הפרוסה להשגת איכות נתונים אופטימלית.
