שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין
10 באוגוסט 2021
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשיקום פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין בפרוטואוליפוזומים מוגדרים.
השימוש ב-AAA-ATPases להסרת חלבונים משכבת שומנים הוא נושא נפוץ בבקרת איכות החלבון. הבנה מכנית של תהליך חיוני זה דורשת מערכת מחודשת. שחזורים קודמים עם AAA-ATPases היו מורכבים והטרוגניים.
המערכת שלנו פשוטה ומוגדרת במלואה. זה מאפשר לנו לתפעל את AAA-ATPase Msp1, את המצע ואת סביבת השומנים. כדי להתחיל, להוסיף חוצץ שיקום שהוכן בעבר, חלבוני Msp1 ו- TA מטוהרים וליפוזומים בצינור PCR, ולאחר מכן לדגור את התערובת על קרח במשך 10 דקות.
במהלך הדגירה, חותכים את הקצה של קצה פיפטה P200 לקוטר של כ -1/8 אינץ '. לאחר מכן, מערבולת הצינור המכיל BioBeads ביסודיות כדי לקבל תערובת אחידה. לאחר מכן, הסר במהירות את המכסה והשתמש בקצה פיפטה P200 לחתוך כדי להעביר נפח מתאים של החרוזים לצינור PCR ריק.
לאחר הדגירה של 10 דקות לשחזור הושלמה, באמצעות קצה פיפטה לא מלוטש, להסיר את כל הנוזל מן BioBeads. לאחר מכן, להעביר 100 microliters של השיקום לתוך הצינור עם BioBeads ולאפשר לו לסובב על גלגל במשך 16 שעות. למחרת, לסובב את הצינור PicoFuge כדי גלולה החרוזים, ולאחר מכן להעביר את החומר reconstituted לצינור PCR נקי ולשמור את הצינור על קרח.
להסרת חלבונים שלא הצליחו לשחזר לתוך ליפוזומים, ישיבב את עמודי ספין גלוטתיון עם חוצץ החילוץ, אשר בדרך כלל כרוך שלושה סיבובים של כביסה עם 400 microliters של חוצץ, ואחריו צנטריפוגה כדי להסיר את המאגר. לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרומולים של כל מלווה לחומר המחודש, ואחריו 100 מיקרוליטרים של חיץ החילוץ, מה שמביא את הנפח עד 200 מיקרוליטרים. הוסף תערובת זו לעמודות ספין גלוטתיון המשודרגות, ולאחר מכן חבר את עמודות הסיבוב וסובב אותן במשך 30 דקות, ומאפשר למלווים להיקשר לשרף.
לאחר הסיבוב, סובב את העמודות בקצרה. לאסוף את הזרימה דרך, שהוא החומר פינה מראש מרוקן של חלבונים מצטברים. מניחים אותו על קרח וממשיכים ישירות לבחיסת החילוץ.
הכן צינורות לניתוח SDS-PAGE. הוסף 45 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים לצינור הכניסה, 40 מיקרוליטרים של מים לצינור הזרימה, ו-16.6 מיקרוליטרים של חיץ טעינה 4X SDS-PAGE לכל צינור. לבדיקת החילוץ, הכינו את תגובת החילוץ והעלו את הנפח הסופי ל-200 מיקרוליטרים עם חיץ החילוץ.
לאחר מכן, לפני המלחמה את ההסתה החילוץ בבלוק חום 30 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. כדי ליזום את ההסתה, להוסיף ATP לריכוז סופי של שני מילימולים. לסובב את הצינור במשך חמש שניות PicoFuge, ולדגירה אותו ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
במהלך הדגירה, לקחת דגימת מיקרוליטר חמש של התגובה ולהוסיף אותו צינור הקלט. כמו כן, שיווי משקל עמודת ספין גלוטתיון אחת עבור כל דגימה בבדיקת החילוץ כפי שהודגם בעבר. לאחר הדגירה של 30 דקות הושלמה, להוסיף 200 microliters של חוצץ החילוץ לצינור, להביא את הנפח הכולל ל 400 microliters.
לאחר מכן, הוסף תגובה זו לשרף גלוטתיון המשוויב ואפשר לו להסתובב במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, לסובב את העמודות כדי לאסוף את הזרימה דרך, ולאחר מכן לקחת מדגם 10 microliter עבור צינור הזרימה דרך. לשטוף את השרף פעמיים עם 400 microliters של חוצץ החילוץ, להשליך את הזרימה דרך לאחר כל לשטוף.
לאחר הכביסה השלישית, לשמור על הזרימה דרך ולקחת מדגם 50 microliter עבור צינור לשטוף. לאחר מכן, להכין חמישה מיליליטר של חוצץ elution על ידי הוספת גלוטתיון מופחת לריכוז הסופי של חמישה מילימולים במאגר החילוץ. הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר ההרחבה לעמודת הספין ודגר במשך חמש דקות.
לאחר מכן, צנטריפוגה העמוד ולאסוף את הזרימה דרך. חזור על שלב ההתחמקות פעם נוספת. לאחר ההשתלטות השנייה, קחו 50 מיקרוליטר אליקוט מדגם ההחמצה והוסיפו אותו לצינור האלגנטי.
לאחר הפעלת כתם מערבי, יעילות החילוץ יכולה להיקבע על ידי השוואת כמות המצע בשבר האלגנטי עם שבר הקלט. האות בזרימה מראה שונות מסוימת, אך הוא בדרך כלל דומה לשבר הקלט, ואין אות בשבר הכביסה. בדרך כלל, יש יעילות חילוץ כ 10% עבור השליטה החיובית ויעילות החילוץ של אחד עד 2% עבור השליטה השלילית.
כאשר תנאי השיקום אינם ממוטבים, רמות החילוץ דומות בין הדגימות החיוביות והשליליות. טכניקה זו אפשרה למעבדה שלנו לבדוק תכונות ביופיסיות של המצע להשפיע על זיהוי על ידי Msp1.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לשחזור של פעילות החילוץ של Msp1 באמצעות רכיבים מופקים במלואם בתוך פרוטאו-ליפוזומים מוגדרים. מטרת המחקר היא לפשט את תהליך השחזור של AAA-ATPases, החיוניים לבקרת איכות של חלבונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- ביוכימיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- לבדי AAA-ATPases יש תפקיד חיוני בהסרת חלבונים משכבות ליפידיות כפולות.
- הבנה מכניסטית של תהליך זה דורשת מערכת רקונוסטיטוציה.
- שיטות קודמות היו מורכבות והטרוגניות.
- מחקר זה מציג מערכת רקונוסטיטוציה פשוטה ומוגדרת במלואה.
מטרת המחקר
- למניפולציה של ה-AAA-ATPase Msp1 והסובסטרט שלו.
- ליצירת סביבה ליפידית מוגדרת לצורך המחקר.
- להעמקת ההבנה של מנגנוני חילוץ חלבונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של בופר השחזור.
- שימוש בחלבוני Msp1 ו-TA מופקים.
- הכנסת ליפוזומים לשפופרת PCR.
- דגירה של התערובת על קרח למשך 10 דקות.
תוצאות עיקריות
- הוקם פרוטוקול פשוט ואפקטיבי לשחזור Msp1.
- המערכת המוגדרת מאפשרת מניפולציה טובה יותר של הרכיבים.
- הושגה הבנה משופרת של תהליך המיצוי.
- התוצאות מעידות על יעילות משופרת בבקרת איכות החלבון.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה פשוטה לבדיקת AAA-ATPases.
- הוא תורם להבנת תהליך מיצוי חלבונים מממברנות.
- ניתן להשתמש בפרוטוקול זה למחקרים נוספים בבקרת איכות של חלבונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
פרוטוקול זה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית (de-risking) של חילוץ חלבונים המתווך על ידי AAA-ATPase, נתיב בקרת איכות שמור הרלוונטי לפרוטאוסטזיס מיטוכונדריאלי. באמצעות אספקת מערכת reconstituted מוגדרת במלואה עם רכיבים מופרשים, הוא תומך בתיקוף מטרות ובפיתוח בדיקות למחלות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, כולל ניוון עצבי וסרטן. הגישה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי בידוד משתנים המשפיעים על זיהוי הסובסטרט ויעילות החילוץ.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תפקידו של Msp1 בהסרת חלבונים בעלי עיגון זנב (tail-anchored proteins) שמוקמו באופן שגוי, ובכך תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות במסלולי הפרוטאוסטזיס המיטוכונדריאליים.
- ערך תפעולי: משתמש ב-Msp1 מטוהר, בחלבוני TA ובליפוזומים כדי להסיר מורכבות תאית, מה שמאפשר מניפולציה מדויקת של ה-ATPase, הסובסטרט וסביבת הליפידים.
- ערך חיזוי: מקל על ניתוח מבנה-תפקוד של זיהוי סובסטרט על ידי Msp1, ומסייע בזיהוי מועמדים למודולטורים של פעילות חילוץ חלבונים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מבסס בדיקת מיצוי כמותית שבה נמדדת היעילות על ידי השוואת רמות הסובסטרט בתסמיך (eluate) לעומת הקלט באמצעות Western blot.
- ערך תפעולי: מגדיר תנאים סטנדרטיים: דגירה של 10 דקות בקרח לצורך הרכבה מחדש (reconstitution), סיבוב של 16 שעות עם BioBeads, ומיצוי מונע ATP למשך 30 דקות בטמפרטורה של 30°C ולאחריו אלוציה באמצעות גלוטתיון.
- מוכנות הבדיקה: התוצאים כוללים את יעילות המיצוי (בדרך כלל ~10% עבור ביקורת חיובית, 1–2% עבור ביקורת שלילית), מה שמאפשר זיהוי פגיעות (hits) וסריקת תגובה למסע (dose-response) בפורמט של הרכבה מחדש.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות תרגומית: מקשר בין מנגנוני פרוטאוסטזיס מיטוכונדריאליים למודלים של מחלות שבהם תפקוד לקוי של Msp1 מעורב בסרטן, בהזדקנות ובניוון עצבי.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבודד משתנים המשפיעים על המיצוי — כגון הרכב ליפידי וביופיזיקה של הסובסטרט — כדי להבהיר את המעורבות של המטרה ולהפחית עמימות בתיקוף של מטרות פרה-קליניות.
- המשכיות: תומך במעבר מתיקוף ביוכימי של המטרה לסריקה פנוטיפית במערכות הרלוונטיות למחלה, על ידי הגדרת מודול מיצוי מינימלי שניתן לשלוט בו.
שילוב תהליכי עבודה ו-Pipeline
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ומאפשרת תיקוף של מטרה באמצעות ניתוח מכניסטי של מיצוי חלבונים, המנחה את פיתוח הבדיקה עבור רשראשי סריקה ותומך בהחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) המבוססות על מעורבות המטרה ומודולציה של המסלול.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי האופן שבו סביבת הליפידים ומאפייני הסובסטרט משפיעים על פעילות ה-ATPase של Msp1 ועל יעילות החילוץ.
- סקר (Screening): מספק פלטפורמה כמותית ומשוחזרת להערכת השפעת תרכובות על חילוץ המונע על ידי ATPase, עם בקרות חיוביות ושליליות מוגדרות.
- אנליטיקה: מייצר תוצרי מדידה מדידים — יעילות חילוץ באמצעות השוואת Western blot של פракציות האלוציה והקלט — המאפשרים השוואה סטטיסטית בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרלוונטיות פרה-קלינית על ידי מידול של נתיב בקרת איכות שמור, שהפרעה בו מקושרת למחלות אנוש.
- שימוש חוזר ארגוני: מערכת מוגדרת המשוחזרת בליפוזומים מאפשרת שימוש חוזר בפרויקטים הבוחנים AAA-ATPases, ספציפיות של סובסטרט, או מודולציה של חילוץ התלויה בליפידים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי חילוץ חלבונים באמצעות מערכת מוגדרת ומפושטת.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה באמצעות רכיבים מטוהרים ופרוטוקול מדורג (הרכבה מחדש, טיפול ב-BioBead, ניקוי מקדים של שפרונים, חילוץ מונע ATP, ואלוציה של גלוטתיון).
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך תהליך (go/no-go) על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של פוטנציאל המודולציה של המטרה לפני בדיקות תאיות או פנוטיפיות.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תומך בתיעוד בעדיפות מותאמת-סיכון של מטרות בבקרת איכות מיטוכונדריאלית, על ידי הבהרת האחריות המכניסטית והסבירות למניפולציה של המטרה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיהור חלבונים, רקונסטרוקציה של ליפוזומים ותכנון בדיקות ATPase.
- תלוי בגישה לאולטרה-צנטריפוגה או PicoFuge להשקעה, עמודי ספין של גלוטתיון ובלוקי חימום בבקרת טמפרטורה.
- מחייב סטנדרטיזציה של הרכב הליפידים, יחסי חלבון:פוליליפיד וריכוז ATP בין מעבדות להשגת יעילות חילוץ הדירה.
- התאמה לחלבוני TA אחרים או ל-AAA-ATPases עשויה לדרוש אופטימיזציה של באפר הרקונסטרוקציה, זמן האינקובציה ושלבי הסרת ליפידים מבוססי חרודים.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות באות הזרימה (flow-through) ותלות ברגישות ה-Western blot עבור סובסטראטים בריכוז נמוך, כפי שצוין במקור.
