Name: שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: חקור שחזור פעילות החילוץ של Msp1 באמצעות רכיבים מטוהרים לחלוטין בליפוזומים מוגדרים. פרוטוקול זה מפשט את חקר AAA-ATPases לבקרת איכות חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MLW פיתח חלק מפרוטוקול זה במהלך לימודי הפוסט דוקטורט שלו עם ד"ר רוברט קינן באוניברסיטת שיקגו.
עבודה זו ממומנת על ידי מענק NIH 1R35GM137904-01 ל- MLW.

תפקוד מיטוכונדריאלי תקין תלוי במערכת בקרת איכות חלבון חזקה. בשל מגבלות מובנות בנאמנות של מסלולי פילוח חלבון ת"א, חלבוני ת"א מאושפזים הם מקור מתמיד ללחץ למיטוכונדריה. מרכיב מרכזי ברשת הפרוטאוסטזיס המיטוכונדריאלי הוא Msp1, שהוא ATPase מעוגן AAA+ המודרת שמסיר חלבוני ת"א לא מאוסים מה- OMM. כאן, תיארנו כיצד להכין פרוטאוליפוזומים, שיתוף reconstitute Msp1 וחלבון ת"א מודל, ולבצע מבחן מיצוי. השתמשנו בעבר בבדיקה זו כדי להדגים כי Msp1 מזהה ישירות חלבוני ת"א שלא הוקצו כהלכה ומסוגל לחלץ חלבונים אלה משכבת שומנים ללא חלבוני אביזר או קו...

תפקוד תאי תקין תלוי בתהליך הנקרא פרוטאוסטזיס, המבטיח כי חלבונים פונקציונליים נמצאים בריכוז הנכון ובמיקום התאי1. כשלים בפרוטאוסטזיס מובילים לתפקוד אברונים נפגעים והם קשורים למחלות ניווניות רבות2,3,4. חלבוני ממברנה מציגים אתגרים ייחודיים לרשת הפרוטאוסטזיס מכיוון שהם חייבים להיות ממוקדים לממברנה הנכונה תוך הימנעות מצבירה מתחומי הטרנס-מברן ההידרופוביים (TMDs)5. כתוצאה מכך, מכונות מיוחדות התפתחו כדי להגן על TMD הידרופובי מן cytosol ולהקל על מיקוד והכנסת לתוך הממברנה התאית הנכונה6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
המיטוכונדריה הם הרכזת המטבולית של התא והם מעורבים בתהליכים תאיים חיוניים רבים כגון: זרחן חמצוני, ייצור אשכול גופרית ברזל, ורגולציה אפופטוטית16,17. אברונים אנדוזימביוטיים אלה מכילים שתי ממברנות, המכונות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית (IMM) והממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית (OMM). מעל 99% מתוך 1,500 חלבונים מיטוכונדריאליים אנושיים מקודדים בגנום הגרעיני ויש להעבירם על פני ממברנה אחת או שתיים שונות18,19. תפקוד מיטוכונדריאלי תקין ולכן תלוי ברשת פרוטאוסטזיס חזקה כדי לתקן שגיאות כלשהן פילוח חלבון או translocation.
המעבדה שלנו מתמקדת בתת-קבוצה של חלבונים ממברנה מיטוכונדריאלית הנקראים חלבונים מעוגנים בזנב (TA), שיש להם תחום טרנס-מברן יחיד בטרמינל C20,21,22,23,24. חלבוני ת"א מעורבים במספר תהליכים חיוניים, כגון אפופטוזיס, הובלת ארסיה, וטרנסלוקציה של חלבונים25. הטופולוגיה הייחודית של חלבוני ת"א דורשת החדרה לאחר התרגום, המתרחשת ברטיקולום אנדופלסמי (ER) על ידי הכניסה המודרכת של זנב מעוגן (GET) או רטיולמוסית קרום חלבון קומפלקס (EMC) או לתוך OMM על ידי מסלול מאופיין בצורה גרועה20,26,27,28. המאפיינים הביופיזיים של TMD נחוצים ומספיקים כדי להנחות חלבוני ת"א לממברנה הנכונה29. ההכרה במאפיינים ביופיסיים ולא במוטיב רצף מוגדר מגבילה את הנאמנות של מסלולי הפילוח5. לכן, הקצאה שגויה של חלבוני ת"א היא מתח נפוץ עבור רשתות פרוטאוסטזיס. מתח תאי, כגון עיכוב של מסלול GET, גורם לעלייה באילוץ חלבונים ל- OMM ולתפקוד מיטוכונדריאלי אלא אם כן חלבונים אלה מוסרים מייד30,31.
נושא נפוץ בפרוטוסטזיס ממברנה הוא השימוש ב- AAA+(TPase Aהמנוקד לחלבונים Activities תאיים) להסרת חלבונים ישנים, פגומים או לא מאוטצים מהלבייה השומנים1,32,33,34,35,36,37,38 . חלבוני AAA+ הם מנועים מולקולריים היוצרים טבעות הקסמריות ועוברים תנועות תלויות ATP כדי לשפץ מצע, לעתים קרובות על ידי טרנסלוקציה באמצעות נקבובית צירית צרה39,40. למרות מאמץ רב הוקדש לחקר החילוץ של חלבוני ממברנה על ידי AAA + ATPases, reconses הם מורכבים או כרוכים תערובת של שומנים וחומרי ניקוי41,42, אשר מגביל את הכוח הניסיוני לבחון את המנגנון של מיצוי מצע מן bilayer השומנים.
Msp1 הוא AAA + ATPase שמור מאוד המעוגן ב- OMM וב- peroxisomes הממלא תפקיד קריטי בפרוטוסטזיס של הממברנה על ידי הסרת חלבוני ת"א לא מאותרים43,44,45,46,47. Msp1 הוכח לאחרונה גם כדי להקל על לחץ ייבוא חלבון מיטוכונדריאלי על ידי הסרת חלבונים ממברנה לעכב במהלך טרנסלוקציה על פני OMM48. אובדן Msp1 או ההומולוגיה האנושית ATAD1 גורם לפיצול מיטוכונדריאלי, כשלים בזרחן חמצוני, התקפים, פציעה מוגברת בעקבות שבץ, ומוות מוקדם31,49,50,51,52,53,54,55,56.
הראינו כי ניתן לשחזר חלבוני ת"א עם Msp1 ולזהות את החילוץ מ bilayer השומנים57. מערכת פשוטה זו משתמשת בחלבונים מטוהרים לחלוטין המחודשים לליפוזומים מוגדרים המחקים את ה- OMM (איור 1)58,59. רמה זו של שליטה ניסיונית יכולה לענות על שאלות מכניות מפורטות של מיצוי מצע כי הם עקשניים מבחינה ניסיונית עם שחזורים מורכבים יותר מעורבים חלבונים אחרים AAA + . כאן, אנו מספקים פרוטוקולים ניסיוניים המפרטים את השיטות שלנו להכנת ליפוזום, שחזור חלבון ממברנה, ובחאיית החילוץ. תקוותנו היא כי פרטים ניסיוניים אלה יאפשרו מחקר נוסף של תהליך חיוני אך לא מובן היטב של פרוטאוסטזיס ממברנה.

<table><tbody><tr><td>Biobeads</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>כבד בקר פוספטידיל אינוזיטול</td><td>Avanti</td><td>840042C</td><td>PI</td></tr><tr><td>ביצת עוף פוספטידיל כולין</td><td>Avanti</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>PC ביצת עוף פוספטידיל אתנולמין</td><td>Avanti</td><td>840021C</td><td>PE</td></tr><tr><td>ECL בחר ריאגנט לזיהוי כתמים מערביים</td><td>GE</td><td>RPN2235</td><td></td></tr><tr><td>מסנן תומך</td><td></td><td>בבקבוקון זכוכית Avanti</td> 610014 <td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>60910L-1</td><td></td></tr><tr><td>עמוד סיבוב גלוטתיון</td><td>תרמו פישר</td><td>PI16103</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב</td><td>תרמו פישר</td><td>NC1050917</td><td></td></tr><tr><td>מיני מכבש</td><td>Avanti</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת פוליקרבונט</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td>200 ננומטר</td></tr><tr><td>קרום PVDF</td><td>תרמו פישר</td><td>88518</td><td>45 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-FLAG</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' F7245</td><td></td></tr><tr><td>סינתטי 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td><td>Avanti</td><td>840035C</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>סינתטי 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-גליצרול</td><td>Avanti</td><td>710335C</td><td>מזרק TOCL</td></tr><tr><td>, 1 מ"ל</td><td>Norm-Ject</td><td>53548-001</td><td></td></tr><tr><td>מזרק, 1 מ"ל, אטום</td> <td>לגזAvanti</td><td>610017</td><td></td></tr></tbody></table>

שחזור פעילות החילוץ msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

כמרכז לזרחן חמצוני ורגולציה אפופטוטית, המיטוכונדריה ממלאת תפקיד חיוני בבריאות האדם. תפקוד מיטוכונדריאלי תקין תלוי במערכת בקרת איכות חזקה לשמירה על הומאוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס). ירידות בפרוטוסטזיס מיטוכונדריאלי נקשרו לסרטן, הזדקנות, ניוון עצבי, ומחלות רבות אחרות. Msp1 הוא ATPase AAA+ המעוגן בקרום המיטוכונדריאלי החיצוני השומר על פרוטאוסטזיס על ידי הסרת חלבונים מעוגנים בזנב. באמצעות רכיבים מטוהרים מחדש לתוך proteoliposomes, הראינו כי Msp1 הוא הכרחי מספיק כדי לחלץ חלבון מעוגן זנב מודל מן bilayer השומנים. המערכת המחודשת הפשוטה שלנו מתגברת על כמה מהמחסומים הטכניים שהפריעו למחקר מפורט של מיצוי חלבון ממברנה. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות ליצירת ליפוזומים, שחזור חלבון ממברנה, ובחאיית החילוץ Msp1.

כדי לפרש כראוי את התוצאות, יש לראות יחד את הג'ל נטול הכתם ואת הכתם המערבי. הג'ל ללא כתמים מבטיח טעינה שווה בכל הדגימות. בעת צפייה בג'ל ללא כתמים, המלווים (GST-calmodulin ו- GST-SGTA) יהיו גלויים בנתיבי קלט (I) ו- ELUTE (E). בדוק שוב כי עוצמת הרצועות האלה אחידה על פני כל דגימות הקלט. כמו כן, ודא כי העוצמה אחידה על פני דגימות ELUTE. ELUTE מרוכז פי 5 מהקלט וההבדל הזה בעוצמה יהיה גלוי בג'לים.
לאחר השימוש בג'ל ללא כתמים כדי לאשר טעינה נכונה, לבחון את כתם המערבי כדי לקבוע את פע...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשיקום פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין בפרוטואוליפוזומים מוגדרים.

שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

השימוש ב-AAA-ATPases להסרת חלבונים משכבת שומנים הוא נושא נפוץ בבקרת איכות החלבון. הבנה מכנית של תהליך חיוני זה דורשת מערכת מחודשת. שחזורים קודמים עם AAA-ATPases היו מורכבים והטרוגניים.המערכת שלנו פשוטה ומוגדרת במלואה. זה מאפשר לנו לתפעל את AAA-ATPase Msp1, את המצע ואת סביבת השומנים. כדי להתחיל, להוסיף חוצץ שיקום שהוכן בעבר, חלבוני Msp1 ו- TA מטוהרים וליפוזומים בצינור PCR, ולאחר מכן לדגור את התערובת על קרח במשך 10 דקות.במהלך הדגירה, חותכים את הקצה של קצה פיפטה P200 לקוטר של כ -1/8 אינץ '. לאחר מכן, מערבולת הצינור המכיל BioBeads ביסודיות כדי לקבל תערובת אחידה. לאחר מכן, הסר במהירות את המכסה והשתמש בקצה פיפטה P200 לחתוך כדי להעביר נפח מתאים של החרוזים לצינור PCR ריק.לאחר הדגירה של 10 דקות לשחזור הושלמה, באמצעות קצה פיפטה לא מלוטש, להסיר את כל הנוזל מן BioBeads. לאחר מכן, להעביר 100 microliters של השיקום לתוך הצינור עם BioBeads ולאפשר לו לסובב על גלגל במשך 16 שעות. למחרת, לסובב את הצינור PicoFuge כדי גלולה החרוזים, ולאחר מכן להעביר את החומר reconstituted לצינור PCR נקי ולשמור את הצינור על קרח.להסרת חלבונים שלא הצליחו לשחזר לתוך ליפוזומים, ישיבב את עמודי ספין גלוטתיון עם חוצץ החילוץ, אשר בדרך כלל כרוך שלושה סיבובים של כביסה עם 400 microliters של חוצץ, ואחריו צנטריפוגה כדי להסיר את המאגר. לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרומולים של כל מלווה לחומר המחודש, ואחריו 100 מיקרוליטרים של חיץ החילוץ, מה שמביא את הנפח עד 200 מיקרוליטרים. הוסף תערובת זו לעמודות ספין גלוטתיון המשודרגות, ולאחר מכן חבר את עמודות הסיבוב וסובב אותן במשך 30 דקות, ומאפשר למלווים להיקשר לשרף.לאחר הסיבוב, סובב את העמודות בקצרה. לאסוף את הזרימה דרך, שהוא החומר פינה מראש מרוקן של חלבונים מצטברים. מניחים אותו על קרח וממשיכים ישירות לבחיסת החילוץ.הכן צינורות לניתוח SDS-PAGE. הוסף 45 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים לצינור הכניסה, 40 מיקרוליטרים של מים לצינור הזרימה, ו-16.6 מיקרוליטרים של חיץ טעינה 4X SDS-PAGE לכל צינור. לבדיקת החילוץ, הכינו את תגובת החילוץ והעלו את הנפח הסופי ל-200 מיקרוליטרים עם חיץ החילוץ.לאחר מכן, לפני המלחמה את ההסתה החילוץ בבלוק חום 30 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. כדי ליזום את ההסתה, להוסיף ATP לריכוז סופי של שני מילימולים. לסובב את הצינור במשך חמש שניות PicoFuge, ולדגירה אותו ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.במהלך הדגירה, לקחת דגימת מיקרוליטר חמש של התגובה ולהוסיף אותו צינור הקלט. כמו כן, שיווי משקל עמודת ספין גלוטתיון אחת עבור כל דגימה בבדיקת החילוץ כפי שהודגם בעבר. לאחר הדגירה של 30 דקות הושלמה, להוסיף 200 microliters של חוצץ החילוץ לצינור, להביא את הנפח הכולל ל 400 microliters.לאחר מכן, הוסף תגובה זו לשרף גלוטתיון המשוויב ואפשר לו להסתובב במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, לסובב את העמודות כדי לאסוף את הזרימה דרך, ולאחר מכן לקחת מדגם 10 microliter עבור צינור הזרימה דרך. לשטוף את השרף פעמיים עם 400 microliters של חוצץ החילוץ, להשליך את הזרימה דרך לאחר כל לשטוף.לאחר הכביסה השלישית, לשמור על הזרימה דרך ולקחת מדגם 50 microliter עבור צינור לשטוף. לאחר מכן, להכין חמישה מיליליטר של חוצץ elution על ידי הוספת גלוטתיון מופחת לריכוז הסופי של חמישה מילימולים במאגר החילוץ. הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר ההרחבה לעמודת הספין ודגר במשך חמש דקות.לאחר מכן, צנטריפוגה העמוד ולאסוף את הזרימה דרך. חזור על שלב ההתחמקות פעם נוספת. לאחר ההשתלטות השנייה, קחו 50 מיקרוליטר אליקוט מדגם ההחמצה והוסיפו אותו לצינור האלגנטי.לאחר הפעלת כתם מערבי, יעילות החילוץ יכולה להיקבע על ידי השוואת כמות המצע בשבר האלגנטי עם שבר הקלט. האות בזרימה מראה שונות מסוימת, אך הוא בדרך כלל דומה לשבר הקלט, ואין אות בשבר הכביסה. בדרך כלל, יש יעילות חילוץ כ 10% עבור השליטה החיובית ויעילות החילוץ של אחד עד 2% עבור השליטה השלילית.כאשר תנאי השיקום אינם ממוטבים, רמות החילוץ דומות בין הדגימות החיוביות והשליליות. טכניקה זו אפשרה למעבדה שלנו לבדוק תכונות ביופיסיות של המצע להשפיע על זיהוי על ידי Msp1.

reconstitution-msp1-extraction-activity-with-fully-purified

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיהור מאוד פעיל Hsp104, AAA hexameric + חלבון מן שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ל-ATP disaggregation חלבון. תכנית זו מנצל לבנות His6-tagged לטיהור זיקה...

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

Nanodiscs הם חלקיקי discoid קטנים המשלבים חלבונים בממברנה לתיקון קטן של bilayer פוספוליפידים. אנו מספקים פרוטוקול חזותי המציג את שילוב צעד אחר הצעד של טרנספורטר MalFGK2 לתוך דיסק.

שיטת צעד אחר צעד לכינונה מחדש של טרנספורטר ABC לחלקיקי ליפידים Nanodisc

סרטון זה מדגים פרוטוקול במבחנה לחקר הסרה בתיווך Msp1 של חלבוני TA לא מקומיים המשולבים בדו-שכבה השומנית של הליפוזומים. חלבוני Msp1 ו-TA משולבים בליפוזומים, והטרנסלוקציה תלוית ה-ATP של חלבוני TA מאושרת באמצעות טיהור זיקה.

בדיקת מיצוי Msp1 לחקר הסרת חלבוני TA לא מקומיים

חלבון שמרי המיטוכונדריה nucleoid, Mgm101, הוא חלבון רקומבינציה Rad52 מסוג שיוצר טבעות oligomeric גדולות. פרוטוקול מתואר להכין Mgm101 רקומביננטי המסיס באמצעות חלבון מחייב מלטוז (MBP) תיוג אסטרטגיה בשילוב עם חילופי קטיון וכרומטוגרפיה הדרת גודל.

הכנה של חלבון רקומבינציה Mgm101 ידי אסטרטגיה תיוג מבוססת MBP

שיטה מתוארת לניקוי יעיל של חלבוני תאום סטרפטוקוקוס מתויג היתוך והמתחמים הספציפיים שלהם על streptavidin הותאם שרף (סטרפטוקוקוס-Tactin) קוולנטית צולבים עם Bis suberate (sulfosuccinimidyl) (BS3). יש שיטת היתרונות של מהירות מהירה, התאוששות חלבון מטרה טובה וטוהר גבוהים, והוא תואם את ניתוח שלאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.

טיהור צעד אחד של חלבונים מתויגים-Twin-סטרפטוקוקוס והמתחמים שלהם בSuberate (BS3) שרף סטרפטוקוקוס-Tactin הצולב עם Bis (sulfosuccinimidyl)

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

אנו מספקים פרוטוקול עבור במבחנה מבחני ארגון עצמי של המוח, שלי ליפידית הנתמכות בחדר פתוח. בנוסף, אנו נתאר כיצד הקף וזמינותו של לבושת השומנים microcompartments PDMS לחקות ויוו תנאים על ידי תגובת כליאה.

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

החדרה משותפת לננו-דיסקים שנוצרו מראש מאפשרת לחקור חלבוני ממברנה מסונתזים ללא תאים בסביבות שומנים מוגדרות ללא מגע עם חומרי ניקוי. פרוטוקול זה מתאר את הכנת רכיבי המערכת החיוניים ואת הפרמטרים הקריטיים לשיפור יעילות הביטוי ואיכות הדגימה.

החדרה משותפת של חלבוני ממברנה לננו-דיסקים מוכנים מראש

פרוטוקול זה מפרט את ההעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות (mEVs) מקוריות מתרביות אקסניות של Mycobacterium smegmatis (Msm) וכיצד ניתן לתכנן ולהעשיר MsmEV רקומביננטי המכיל mCherry (כתב פלואורסצנטי אדום). לבסוף, הוא מאמת את הגישה החדשנית עם העשרה של MsmEV המכילים את חלבון EsxA של Mycobacterium tuberculosis.

העשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות ורקומביננטיות של מיקובקטריה

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לביטוי יתר של Nsp15 רקומביננטי, נוקלאז רעיל, במערכת ביטוי C41(DE3), ואחריה טיהור החלבון המתויג באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה והדרת גודל. ניתן להתאים את הפרוטוקולים האלה לחלבונים רעילים מאתגרים אחרים.

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli

מחקר זה מתאר את ההליך לשיקום חלבון הממברנה הרגיש לחומצה ב-TWIK, ערוץ K+ 2 (משימה 2) לננו-דיסקים. ההרכבה המוצלחת אושרה על ידי מיקרוסקופ קריו-אלקטרון חד-חלקיק, שהניב ממוצעים דו-ממדיים מוגדרים היטב.

טכניקה לייצוב חלבוני ממברנה בננו-דיסקים

חקור שחזור פעילות החילוץ של Msp1 באמצעות רכיבים מטוהרים לחלוטין בליפוזומים מוגדרים. פרוטוקול זה מפשט את חקר AAA-ATPases לבקרת איכות חלבונים.

שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין

גלה סרטונים נוספים