ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-מעטפת ליבה הנושאים כדוריות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

האזור נחשב לעניין בתרביות תלת-ממדיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בשל שיפור הפלוריפוטנטיות ופוטנציאל ההתמיינות שתרבית זו יצרה. תיארנו את אסטרטגיית האנקפסולציה שלנו שמובילה להיווצרות ניתנת לשחזור של כדוריות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. לאחר שהם מתמצתים, כדוריות תאי גזע אלה ניתנות לטיפוח, בין אם בלוחות מרובי בארות או בביוריאקטורים מעורבבים.

אסטרטגיית האנקפסולציה שלנו היא לייעל את שרידות ההדברה ואת היעילות הגבוהה של היווצרות ספרואידים. כדוריות עטוף מוגנות מפני גזירה או אנרגיה מכנית הקשורה לערבוב או נדנדה. פיתוח תאי גזע שמקורם בטיפול התאי תלוי בחלקו ביכולת לייצר את המוצר התאי הרצוי באופן מדרגי, יעיל וחסכוני.

טכנולוגיית האנקפסולציה המתוארת כאן מייצגת צעד בכיוון זה. טכנולוגיית האנקפסולציה המתוארת כאן תהיה ככל הנראה ישימה לטיפוח תלת-ממדי של סוגי תאים שונים מתאים אחרים לתאי גזע פלוריפוטנטיים אחרים. התחל על ידי הכנת 30 מיליליטרים של תמיסת מלאי ליבה כפולה כפולה על ידי ערבוב של 4.8 גרם של 35 קילודלטון PEG, 10.2 מיליליטרים של מדיית שיפוע צפיפות, ו-19.8 מיליליטרים של מדיית DMEM/F-12.

לאחר מכן סנן פתרון ליבה זה באמצעות מסנן מזרק מיקרומטר של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, להכין 50 מיליליטרים של שמן מינרלי עם 3 אחוז פעילי שטח על ידי ערבוב 48.5 מיליליטר של שמן מינרלי ו 1.5 מיליליטר של פעילי שטח. לאחר מכן לעקר את התמיסה על ידי העברתה דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.

לאחר מכן, הכן 1 DTT טוחן, 1 תה טוחן, ו 1 אחוז PF127 פתרונות, כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן הכינו תחליב cross-linker על ידי ערבוב של 4.5 מיליליטרים של שמן מינרלי עם 3 אחוז פעילי שטח ו-300 מיקרוליטרים של 1 DTT טוחן. לאחר מערבולת התמיסה במשך שתי דקות, סוניקט במשך 45 עד 60 דקות באמבטיה קולית ב 20 מעלות צלזיוס ולהעמיס אותו למזרק 5 מיליליטר עם מחט 27 מד.

לאחר מכן, הכינו תמיסת שמן מיגון על ידי העמסת השמן המינרלי בחומר פעילי שטח של 0.5 אחוז למזרק 5 מיליליטר עם מחט 27 מדים. כדי להכין את תמיסת המעטפת, הוסף 32 מיליגרם של PEG4 maleimide ב-400 מיקרוליטרים של DPBS. לאחר מכן, הוסף 6 מיקרוליטרים של 1 TEA טוחן.

מערבולת את הפתרון במשך 2 דקות וצנטריפוגה אותו באמצעות מסנן ספין. שמור את התמיסה בחושך על הנדנדה במשך 30 דקות לפני טעינה לתוך מזרק 1 מיליליטר עם מחט 27 מד. לבסוף, הכן את פתרון הליבה הסופי על-ידי השעיה מחדש של 20 מיליון hPSCs במדיה של 200 מיקרוליטרים וערבב עם 30 מיקרוליטרים של 1 אחוז PF127 ו-200 מיקרוליטרים של פתרון ליבה 2X.

מכניסים מוט מיקסר קטן למזרק 1 מיליליטר. לאחר מכן, טען את תמיסת הליבה המכילה את התא לתוך המזרק עם מחט של 27 מדים. התחל על ידי הצבת מכשיר הטיפות PDMS מלוכד, 4 חתיכות באורך 20 ס"מ, וחתיכה אחת של מיקרו-צינוריות כניסה באורך 5 ס"מ, חתיכה אחת של צינור מוצא 10 ס"מ ו-6 חתיכות של צינורות מתאימים באורך 0.5 ס"מ מתחת למקור האור החיידקי למשך 30 דקות לצורך עיקור.

כעת התאימו את 4 החלקים של מיקרו-צינוריות כניסה באורך 20 ס"מ לתוך הקונכייה, השמן, תחליב ההצלבה והכניסות למכשירי הדיסוציאציה באמצעות מלקחיים. לאחר מכן, הכנס את הקצה הנגדי של הצינורות לתוך מחט המזרק עם הפתרון המתאים. בינתיים, חברו את כניסת הליבה של המכשירים המיקרופלואידיים ואת שקע התקני הדיסוציאציה עם מיקרו-צינורית של 5 סנטימטרים.

הכנס צינור יציאה אחד ליציאת היציאה הנוזלית והכניס את הקצה הנגדי למאגר איסוף. לאחר מכן, הניחו את המכשיר על במת מיקרוסקופ והצמידו את הצינורות כדי למנוע כל תנועה. יישמו את המיקרוסקופ ומקדו את המיקרוסקופ על זרבובית המכשיר לצורך בדיקת זרימה.

מניחים כל מזרק על משאבות מזרק שונות ואובטחים כראוי. תכנת כל משאבה על פי פרוטוקולי היצרן לקצבי הזרימה המוזכרים בכתב היד של הטקסט, והתחל את הזרימה בכל המשאבות. המתן עד שכל נוזל ייכנס למכשיר ומלא את הערוצים תוך כדי דחיפת האוויר הנותר.

כאשר היווצרות הקפסולה מתייצבת, מניחים את הקצה הנגדי של צינור האיסוף לתוך צינור חרוטי חדש המכיל 5 מיליליטרים של מדיית mTeSR. לאחר שנאספות מספיק כמוסות, דגירה אותם במשך 10 דקות. הכמוסות הנמצאות בשלב השמן יהיו בחלק העליון של הצינור, אשר משקעים לתחתית בעת הקשה עדינה על הצינור.

כדי לאחזר את הכמוסות, התחילו בהסרת שמן מצינור האיסוף. לאחר מכן, מניחים את הכמוסות על מסננת תאים בגודל נקבובית של 100 מיקרומטר ושוטפים את המסננת בכמויות אדירות של מדיה. הפכו את המסנן על גבי באר של צלחת תרבית בת 6 בארות ואספו את המיקרו-קפסולות על ידי העברת 2 מיליליטרים של מדיה דרך המסנן.

דגירה של כמוסות תאי הגזע בצלחת תרבית של 6 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5 אחוז פחמן דו חמצני. החליפו את המדיה אחת ליומיים על ידי איסוף הכמוסות על מסנן מסנני תאים, שטיפתן במדיה עודפת ותלייתן מחדש לבאר חדשה בצלחות 6 בארות עם 2 מיליליטר מדיה. בצע בדיקת כדאיות על ידי הוספת 4 מיקרוליטרים של 2 מיקרומולר Ethidium Homodimer-1 ומיקרוליטר אחד של 4 תמיסות Calcein-AM מיקרומולריות ל -2 מיליליטרים של DPBS סטרילי.

מערבולת כדי להבטיח ערבוב מלא. אספו כ-100 מיקרו-קפסולות על מסננת תאים ושטפו אותן ב-DPBS סטרילי כדי לאפשר דיפוזיה בינונית החוצה מהכמוסות. אספו אותם שוב בצלחת תרבית של 12 בארות באמצעות מיליליטר אחד של התמיסה המוכנה המכילה אתידיום הומודימר-1 וקלצין AM ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.

דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המיקרו-קפסולות האופטימליות והתת-אופטימליות שיוצרו באמצעות יצירת טיפות מיקרופלואידיות הראו הבדלים במורפולוגיה של הקפסולה כפונקציה של תכולת PEG4-Maleimide במעטפת. כמוסות חלקות עם קצוות בהירים קשורות לשלמות המכנית הרצויה.

צבירה של חרוזים במרכז הכמוסות מצביעה על כך שהליבה הייתה מימית והחרוזים היו חופשיים לנוע. האנולוס הפלואורסצנטי הצביע על נוכחות של מעטפת הידרוג'ל ושימש לקביעת עובי הקונכייה. כתמים חיים או מתים 6 שעות לאחר עטיפת תאי H9 הראו שהתאים השיגו יותר מ-95 אחוזי כדאיות באופן שגרתי במהלך ריצות האנקפסולציה.

על ידי השוואת קצב הצמיחה ופוטנציאל ההבחנה של כדוריות עטופות לעומת לא מכוסות. נקבע כי לתהליך האנקפסולציה אין השפעות שליליות על hPSCs. זכור, חשוב לקבוע יחס קצב זרימה אופטימלי בין מעטפת הליבה לזרמי הנפט.

הימנעות מכך עלולה לגרום לכמוסות שלא יהיו חזקות מכנית ועלולות להיקרע במהלך הטיפול. ברצוננו לציין שטכניקת אנקפסולציה זו נועדה לסוגי תאים שאינם תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. עטפנו, בעיקר השערות, קווי תאים סרטניים ותאי גזע מזנכימליים באמצעות אסטרטגיה דומה.

נכון לעכשיו, הצוות שלנו מפתח את הדור הבא של מיקרו-לכידות. מיקרו-לכידות אלה הן ביו-אקטיביות ועשויות להיות עמוסות בגורמים צולבים להתמיינות עטופה של תאי גזע.