בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

בדיקת קורא צלחות חזקה כמו שלנו שימושית מאוד לסינון ראשוני של מעכבי מתיל-טרנספראז פוטנציאליים. היכולת לאסוף נתונים בזמן אמת היא יתרון גדול של הבדיקה הרציפה של אנדונוקלאז. התחילו בהכנת 600 מיקרוליטרים של תנאי הבדיקה המכילים 20 מיקרומולרים ו-50 תרכובות מיקרומולריות בנפרד בצינורות המיקרוצנטריפוגה על הקרח.

לשם כך, הוסיפו מים מזוקקים כפולים וחיץ מתילציה 5X לכל צינור כדי להשיג ריכוז סופי של חיץ מתילציה 1X. לאחר מכן, הוסף 3.15 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר אלבומין בסרום בקר, או BSA, לכל דגימה. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של מצע DNA של 3.15 מיקרומולרים ו-1.33 מיקרוליטרים של 4.75 מיקרומולר S-אדנוזיל-מתיונין, או SAM, לכל דגימה.

הוסף מעכב לדגימות המתאימות כדי להשיג ריכוז סופי של 21 מיקרומולאר או 52.5 מיקרומולאר וכמות שווה ערך של דימתיל סולפוקסיד, או DMSO, לדגימת בקרה לפני ערבוב התמיסות על ידי מערבולת ב -3, 000 סיבובים לדקה למשך שלוש שניות. לאחר מכן, סובבו את הדגימות למשך מספר שניות בשולחן מיני צנטריפוגה בגודל 1, 200 פעמים G כדי להבטיח שהפתרון ייאסף בתחתית הצינור. Aliquot 95 מיקרוליטר של כל תמיסת בדיקה לשש בארות רצופות בצלחת באר שחורה של חצי אזור 96.

הכן 75 מיקרוליטרים של Gla I או DNMT1 בתוספת תמיסת אנזים Gla I בצינורות המיקרוצנטריפוגה כפי שתואר קודם לריכוז סופי של חיץ חד פעמי. לאחר מכן, הוסף 1.2 מיקרוליטר של 10 יחידות למיקרוליטר Gla I לכל תמיסה כדי להשיג ריכוז סופי של 0.16 יחידות למיקרוליטר. הוסף 0.6 מיקרוליטרים של חמישה DNMT1 חסרי RFTS מיקרומולרי לתמיסת DNMT1 בתוספת Gla I לקבלת ריכוז סופי של 40 ננו-מולר.

לאחר ערבוב עדין, סובבו את הדגימות למשך מספר שניות בצנטריפוגה שולחנית בגודל 1, 200 גרם כדי לוודא שהתמיסה נאספת בתחתית הצינור. לאחר מכן, aliquot 12 microliters של כל תמיסת אנזים לתוך שש בארות בצלחת תחתית חרוטית 96 באר. לצורך בדיקת המתילציה של דגימת הדנ"א, מחממים מראש את קורא הצלחות ל-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הכנס את הלוח השחור המכיל את תמיסות הבדיקה בקורא הלוחות. לאחר ניעור הצלחת ב-425 קמ"ש, יש למדוד את הפלואורסצנציה באורך גל עירור של 485 ננומטר ובאורך גל פליטה של 528 ננומטר. לאחר מכן, לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

הסר את צלחת הבדיקה מקורא הצלחות והוסף חמישה מיקרוליטרים של תמיסת האנזים לכל באר, ולאחר מכן ערבב את התמיסה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הכנס את הצלחת לקורא הצלחות ונער את הצלחת לפני הקלטת הפלואורסצנטיות כל 53 שניות למשך 30 דקות. קבל את הפלואורסצנטיות הממוצעת של מבחני הבקרה המשולשים של Gla I עבור כל תנאי והפחת את ה- Gla I הממוצע המכיל מגשי תגובת בקרה מהעקבות המשולשים המתקבלים בנוכחות DNMT1 חסר RFTS.

לאחר מכן, קבע את השגיאה הממוצעת והסטנדרטית של הממוצע עבור המשכפלים המתוקנים. התווה את עקבות התגובה המתוקנת הממוצעת והתאם את החלק הליניארי ההתחלתי לקו כדי לקבוע את המהירות ההתחלתית. קבע את אחוז הפעילות על ידי חלוקת המהירות שנצפתה בנוכחות תרכובת על ידי המהירות שנצפתה ב- DMSO המכילה תגובת בקרה והכפלה ב- 100.

התוצאות של בדיקה מצומדת אנדונוקלאז בלתי פוסקת הראו כי דנ"א של מוצר שעבר מתילציה מלאה מוגן מפני ביקוע, ואישרו כי DNMT1 חסר RFTS פעיל ומסוגל לבצע מתילציה של דנ"א המצע ההמימתילציה. בבדיקה מבוססת פלואורסצנציה, בהיעדר Gla I, התוספת של DNMT1 או חיץ בלבד לא השפיעה על פלואורסצנציה ברקע. הוספה מאוחרת יותר של Gla I לכל המבחנים הביאה ליצירת פלואורסצנציה רק במבחנים שהכילו DNMT1.

התוספת המקבילה של DNMT1 ו-Gla I חסרי RFTS לשלושה מבחנים הביאה ליצירת פלואורסצנציה חזקה. התוספת של Gla I לבדה לא יצרה פלואורסצנציה. כדי לסנן מעכבים פוטנציאליים, נבדקה פעילות המתילציה של DNMT1 חסר RFTS בנוכחות DMSO, תרכובת אחת, תרכובת שתיים או תרכובת שלוש בריכוזים של 20 ו-50 מיקרומולר.

התרכובות המפחיתות את יצירת הפלואורסצנציה במבחן מצומד זה חייבות לקבל תוקף נוסף. ההבטחה שהתרכובות אינן מעכבות את אנזים הצימוד היא השלב הבא החשוב.