Name: הפלקה של וירוסי הרפס סימפלקס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: למדו שיטת הפלקה לכימות וירוסי הרפס סימפלקס בתאי יונקים. פרוטוקול זה משלב תהליכי קיבוע וצביעה פשוטים לתוצאות אמינות וחוזרות, ומסייע בהערכת יעילות טיפולים אנטי-ויראליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאינספור סטודנטים במעבדות שלנו (PJD ו- BJM) שעבדו איתנו לאורך השנים בשיפור שיטות אלה. תודה מיוחדת לסטן פרסון, שתחת חסותו פותחה לראשונה מתודולוגיה זו. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי אוניברסיטת טוסון פישר המכללה למדע ומתמטיקה תואר ראשון מחקר תמיכה קרן וגשרים NIGMS למענק Baccalaureate 5R25GM058264. תוכן זה הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות.

כל ההליכים עם תאי Vero והרפסוירוסים חיים אושרו על ידי ועדת הביו-בטיחות המוסדית של אוניברסיטת טוסון. ערכה כללית של הליכים אלה מיוצגת באיור 1.
1. זריעת תאי Vero
<ol><li>יום לפני תחילת בדיקת הפלאק, טריפסינציה תאי Vero resuspened אותם רגילים של Dulbecco שונה נשרים בינוני (DMEM) ולהשלים לפי מתודולוגיית תרבית התא הסטנדרטית19. הגדילו מחדש את התאים הטריפסיניים ב-10 מ"ל של DMEM לכל בקבוק T-75 של תאי Vero המתנגשים (כ-107 תאים). הערה: DMEM משמש לבדיקות פלאק במקום אלפא-MEM מכיוון שהוא מאט מעט את קצב צמיחת התא ומעדיף תוצאות בדיקת פלאק טובות יותר.</li>
	<li>ספור את התאים לפי השיטה המועדפת על האדם (לדוגמה, המוציטומטר סטנדרטי עם אי-הכללה של טריפאן בלו)19.</li>
	<li>זרע את התאים ב 4 x 106 תאים / צלחת; עבור HSV-2, להשתמש 6-well צלחות עם 2.5 מ"ל של DMEM (עם תוספי מזון) לבאר; ועבור HSV-1, השתמש צלחות 12-well עם 1.25 מ"ל של DMEM (עם תוספי מזון) לבאר. הערה: מספר התאים צריך להיות קבוע ללא קשר ללוח המשמש, אם כי גודל הבארות חשוב לגבי דיוק בבדיקת הפלאק. זה חיוני כדי לקבל תאים מופצים באופן שווה, אשר ניתן להשיג בצורה היעילה ביותר על ידי הזזת הצלחת קדימה ואחורה, לא בצורה מעגלית.</li>
	<li>אפשר לתאים לגדול בן לילה בטמפרטורה של 37 °C /5% CO2 באינקובטור לח. הערה: הלחות נשמרת עם מחבת של מים מזוקקים המכילים קוטל בתחתית האינקובטור.</li>
</ol>2. דילול מדגם
<ol><li>להשלים את דילול המדגם ואת התוספת של וירוס לתאים במושב מעבדה אחד. זהירות: HSV-1 ו-2 מדבקים לבני אדם ויש לטפל בהם תחת בלימה בטיחות ביולוגית נאותה (BSL-2). יש להפריד את כל החומרים שבאים במגע עם הנגיף ולחטא עם סוכן רבעוני בדילול של 1/256 (ראו טבלת חומרים), יודופר, אקונומיקה או חומר ניקוי יוני חזק (למשל, SDS) לפני הסרתם מארון הבטיחות הביולוגית.</li>
	<li>יום לאחר זריעת תאי Vero, לדלל באופן סדרתי כל דגימת וירוס להיות פלאק ב 1x PBS; בדרך כלל משתמשים בדילולים של פי 10 למעקב המדויק ביותר.</li>
	<li>הפוך את הדילולים האלה דרך 10-4 (לריכוזים נמוכים של וירוסים) או דרך 10-9 (לציפיות של דגימות טיטר גבוהות יותר) עם לפחות 1 מ"ל של כל מדגם שנותר לבדיקת הפלאק עצמה.</li>
	<li>שמור את כל הדילול הנגיפי על הקרח (לא יותר מ 1 שעות) עד מוכן להוסיף דגימות וירוס מדולל אלה לתאים.</li>
</ol>3. תוספת של וירוס לתאים
<ol><li>הסר את מדיום תרבית התאים מבאר אחת או שתיים על ידי פיפטה. הערה: אין להשתמש בשאיפה מכיוון שהיא מסירה יותר מדי נוזלים ממונולייר התאים ומייבשת את התאים. שיקול מכריע אחד הוא להבטיח כי monolayer התא נשאר hydrated לאורך כל מהלך הניסוי. אם התאים יתייבשו, הם ישטפו את הצלחת בשלב האחרון וייצרו נתונים שאינם שמישים. לכן, לעבד רק באר אחת או שתיים בכל פעם כדי להפחית את האפשרות הזאת.</li>
	<li>בזהירות להוסיף את מדגם וירוס מדולל (100-400 μL ו 50-200 μL של מדגם וירוס משמשים עבור 6-well ו 12-well צלחות, בהתאמה) dropwise לכל monolayer, הוספת הטיפות בצד של כל באר. חזור על התהליך עבור כל באר אחת או שתיים עד הצלחת כולה מתמלאת עם דגימות וירוס להיות פלאק. הערה: הוספת הטיפות למרכז הבאר עלולה לשחוק בטעות תאים מהמצע.</li>
	<li>בעדינות לטלטל את הצלחת כולה ביד כדי להבטיח PBS המכיל את הנגיף מכסה את כל monolayer של תאים בכל באר, ולאחר מכן למקם את הצלחת בחממה CO2 ב 37 °C (50 °F) כדי לאפשר את הנגיף לספוח.</li>
	<li>כל 10 דקות בתוך 1 שעה, להסיר את הצלחת מן האינקובטור, בעדינות לטלטל אותו שוב כדי להפיץ את הנגיף באופן שווה יותר על פני כל באר, ולאחר מכן למקם אותו בחזרה באינקובטור. הערה: כל ניסוי יכתיב את מספר השכפולים ואילו דילולים משמשים; העדפת הקורא מכתיבה החלטה זו.</li>
	<li>כדי להפחית את האפשרות של ספירה בשוגג inoculum unabsorbed, להסיר את דגימת הנגיף מן הבארות עם טיפים 1000 μL פיפטה ומניחים אותו בכוס פסולת. הערה: שוב, הליך זה מתנהל עם באר אחת או שתיים בלבד בכל פעם כדי לשמור על הידרציה של monolayer התא.</li>
	<li>מניחים 2.5 מ"ל של שכבת-על מתיל צלולוז (ממיסים 5% מתיל צלולוז w/w ב-100 מ"ל של PBS, אוטולבה אוטומטית למשך 15 דקות ב-121 °C ו-15 פסאיי על מחזור נוזלי, ולאחר מכן מוסיפים 375 מ"ל של DMEM בתוספת 25 מ"ל של FBS).</li>
	<li>לאחר צלחת שלמה מכילה כיסוי, מניחים את הצלחת בחזרה באינקובטור כדי לאפשר צמיחה במשך יומיים. הערה: אם הנגיף והתאים מורשים לגדול במשך שלושה ימים, אפילו ב- DMEM בתוספת תוספי מזון, אובדן משמעותי של תאים במונולייר עלול לגרום, ובכך להתפשר על הנתונים הסופיים.</li>
	<li>לחטא את הפסולת, בדרך כלל עם תוספת של אקונומיקה, יודופר, או וירוקסיד דומה, לפני הסרתו מארון הבטיחות הביולוגית.</li>
</ol>4. כתמים ללוחות
<ol><li>לאחר הדגירה בת היומיים, הסר את שכבת היתר של מתילצלולוז על ידי פיפטה, שוב באר אחת או שתיים בכל פעם, והניח אותו בכוס פסולת.</li>
	<li>מוסיפים ~ 2 מ"ל של 1% סגול קריסטל (ראה טבלת חומרים) ב 50% אתנול לכל באר כדי להכתים את הלוחות. הערה: אין זה חיוני כדי להסיר כל טיפה אחרונה של הכיסוי.</li>
	<li>לדגור על הצלחת עם כל הבארות מלאות בכתם במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F). בשלב זה, לחטא את הפסולת כנל בשלב 3.8.</li>
	<li>לשטוף את הצלחות במרץ עם מי ברז עד נגר ברור. הערה: זרם עדין של מים אינו נמרץ מספיק; לחץ מלא ממתקן כיור מעבדה נדרש.</li>
	<li>בשלב זה, ודא שיש הבדלים של פי 10 במספר הלוחות בכל סדרת דילול.</li>
	<li>אפשר ללוחות להתייבש בן לילה הפוך, ולאחר מכן ניתן לספור את הלוחות הבודדים.</li>
</ol>5. ספירת לוחות וקביעת טיטר וירוסים
<ol><li>ללא קשר לגישה (ראה הערה להלן), הכפל את מספר הלוחות על ידי גורם הדילול (למשל, אם הלוחות נספרו בבאר 10-4 , אז מספר הלוחות יוכפל ב -104). הערה: למרות ספירה בתוך טווח של 10-100 לוחות הוא שימושי5, ספירת בארות עם 30-300 לוחות הוא קצת יותר אמין לוקח בחשבון כ 1/2-log דילול במקום דילול מלא.</li>
	<li>חלק מספר זה בנפח של inoculum (כמו לעיל בשלב 3.2), וממוצע כל הבארות שיש להם לוחות בתוך הטווח שצוין כדי לקבל את הטיטר המדויק ביותר של HSV במדגם המקורי.</li>
	<li>בצע את החישובים בשלבים 5.3.1 עד 5.3.5, בהתחשב בשימוש בנתונים מדומים בטבלה 1.<ol>
<li>שקול רק בארות עם 30-300 לוחות (שלב 5.1). לפיכך, בטבלה 1, השתמש רק בעמודה 10-5 עבור שכפולים 1, 2 ו- 3.</li>
		<li>קח את מספר הלוחות בדילול הנתון והכפל בהדדיות של גורם הדילול. לפיכך, 10-5 עמודה של מדגם 1 הולך מ 81 לוחות בדילול 10-5 ל 81 לוחות כפול 105.</li>
		<li>לאחר מכן חלק את המספר הזה בנפח (ב- mL) של דילול הנגיף שנוסף לתאים בבאר זו. בהנחה שהנתונים על HSV-1 בטבלה 1 הם מלוח של 12 בארות, 0.2 מ"ל תהיה המדידה המתאימה ביותר. מכאן החישוב משלב 5.3.2 הופך 81 x 105 חלקי 0.2 מ"ל, או 4.0 x 107 PFU / מ"ל של HSV-1.</li>
		<li>חזור על תהליך זה עבור כל הנתונים והממוצעים השימושיים. לפיכך, בצע את החישוב ב 5.3.2-5.3.3 על כל הדגימות בעמודה 10-5, בהנחה שמקורם באותה דגימת וירוס ואת המשכפלים הביולוגיים נערכו כדי לקבל את מדידת titer המדויקת ביותר. במקרה של טבלה 1, ממוצע 4.0 x 107, 2.1 x 107, ו 2.6 x 107 PFU / mL כדי לקבל טיטר ממוצע סופי של 2.9 x 107 ± 0.98 x 107 PFU / mL עבור מדגם זה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDimmock%2C+N+%22Introduction+to+Moden+Virology.+6th+end%22">Introduction to Moden Virology. 6th end</a>. , Wiley-Blackwell. (2007).</li>
<li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahy%2C+B+%22Topley+and+Wilson%27s+Microbiology+and+Microbial+Infections.+9th+edn%22">Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn</a>. 1, Arnold. (1998).</li>
<li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+bacteriophage+particles%3A+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriophage%22%5BJournal%5D)">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li>
<li>Earle, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+malignancy+in+vitro%3B+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).</li>
<li>Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+the+lansing+strain+of+poliomyelitis+virus+in+cultures+of+various+human+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues.</a> Science. 109 (2822), 85-87 (1949).</li>
<li>Enders, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytopathology+of+virus+infections%3A+particular+reference+to+tissue+culture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).</li>
<li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., et al. 1, Wolters Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins. 1823-1897 (2013).</li>
<li>Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+cell+entry+mechanisms%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578(2020).</li>
<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Virus+Research%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Farnham, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+microscopic+plaques+by+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Virology. 6 (2), 317-327 (1958).</li>
<li>Garabedian, G. A., Scott, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+assay+for+herpes+simplex+virus+in+L-929+%28Earle%29+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).</li>
<li>Lancz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+viruses+types+1+and+2.+Type+and+strain+specific+characteristics+affecting+virus+plaque+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).</li>
<li>Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short-term+plaque+assay+for+antiviral+drug+research+on+herpes+simplex+virus+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2.</a> New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).</li>
<li>Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+herpes+simplex+virus+types+1+and+2+by+plaque+appearances+on+semicontinuous+rabbit+lens+epithelial+cells+in+the+clinical+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Kansenshogaku+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory.</a> Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).</li>
<li>Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+plaque+assay+of+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Jouranl+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).</li>
<li>Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+ribosome+in+mouse-hamster+hybrid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+New+Biology%22%5BJournal%5D)">Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells.</a> Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).</li>
<li>Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-based+controlled+release+delivery+of+acyclovir+from+poly-%28ethylene+co-vinyl+acetate%29+rings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Delivery+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings.</a> Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391(2020).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique+and+Specialized+Applications.+7th+edn%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).</li>
<li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52065(2014).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 3, 63(2006).</li>
<li>Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+counter%3A+Automated+quantification+of+in+vitro+virus+replication+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy.</a> Viruses. 8 (7), 201(2016).</li>
<li>Hudu, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Hepatitis+B+e+antigen%3A+A+better+predictor+of+Hepatitis+B+virus+DNA+than+quantitative+Hepatitis+B+surface+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen.</a> Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).</li>
<li>Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-dependent+DNA+polymerase+in+virions+of+RNA+tumour+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses.</a> Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).</li>
<li>Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+dependent+DNA+polymerase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells.</a> Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).</li>
<li>Strick, L. B., Wald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+for+herpes+simplex+virus%3A+is+PCR+the+new+gold+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Jouranl+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li>
<li>Kärber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beitrag+zue+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+pharmakologischer+Reihenversuche%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+for+Experimentelle+Pathologie+und+Pharmakologie%22%5BJournal%5D)">Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche.</a> Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).</li>
<li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Method+of+%27Right+and+Wrong+Cases%27+%28Constant+Stimuli%29+without+Gauss%27s+formula%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Psychology%22%5BJournal%5D)">The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).</li>
<li>Ryu, W. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRyu%2C+W-S+%22Molecular+Virology+of+Human+Pathogenic+Viruses.+1st+edn%22">Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn</a>. , Academic Press. (2017).</li>
<li>Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poliovirus%3A+generation%2C+quantification%2C+propagation%2C+purification%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15H 11 (2013).</li>
<li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+and+titration+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Propagation and titration of influenza viruses.</a> Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).</li>
<li>Baz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+isolation%2C+purification%2C+and+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Zika virus isolation, purification, and titration.</a> Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).</li>
<li>Coleman, C. M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

בעוד שבדיקות פלאק ישנות כמעט כמו תרבות התאים של היונקים עצמה, נראה שלכל מעבדה יש מערכת פרוטוקולים משלה לביצוע בדיקה בסיסית זו5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 . אף על פי שההוראות בכל גרסה שפורס...

ראשיתם של בדיקות פלאק וירוס לחזור לתגליות הראשונות של וירוסים בשנות ה -18901. נגיף פסיפס הטבק היה מבודד לראשונה והועבר על עלי טבק, שם ניתן לזהות ולכמת כתמי זיהום בודדים שמקורם בישות וירוס חיה אחת2, שזוהתה מאוחר יותר כ- virion2. מחקרים ראשוניים מאוחרים יותר עם חיידקים ובקטריופאג'ים שיכללו את הטכניקות המשמשות לפלייק של וירוסים אלה, כולל חיידקים בשלב אמצע היומן של הצמיחה, דילול סדרתי של דגימות בקטריופאג ', ואגר העליון עם הדמיה מאוחרת יותר של חורים מילוליים (הנקראים פלאקים) במדשאה החיידקית3.
הפלקה של וירוסים מן החי פיגרה במחקר המרגש שנערך עם בקטריופאג'ים, בעיקר משום שהשיטות הנדרשות לגידול תאי יונקים בתרבית לא פותחו עד שנות ה-40 של המאה ה-20. עם זאת, הופעתם של תאי מורין גדלים בהיעדר האורגניזם המארח כולו4 הולידה עידן חדש ביכולת לתרבות ולספור וירוסים. עבודה זו הורחבה עבור התפשטות וכמות של וירוס אנצפלומליטיס סוס מערבי בתאי עוף ופוליו וירוס בתאים אנושיים5,6. ככל שתחום תאי היונקים הפולחניים התרחב, החבורה של תאים מארחים שונים לזיהומים ויראליים שונים העניקה לעולם שפע של אפשרויות לחקור כל מיני וירוסים7. זה כלל את ההתפשטות והכימות של הרפס-וירוסים אנושיים, במיוחד וירוס הרפס סימפלקס-1 (HSV-1) ו -2 (HSV-2), הגורמים נגעים mucocutaneous8. חשוב לציין, כל בדיקות הפלאק תלויות בקיומם של נגיפים חיים, שיכולים להיכנס לתאים מארחים באופן בתיווך קולטן במדגם9. ללא קשר בכל מקום ושפע של פרסומים על ביצוע בדיקות פלאק5,10,11,11,12,13,14,15,16, שיטות אלה עבור HSV-1/-2 הן תערובת של אמנות ומדע; אי אפשר לנהל את הבדיקה ללא תשומת לב ראויה לכל פרט בפרוטוקול, וגם לא ניתן לבצע בדיקה מוצלחת ללא עין קרטית לעידון בתהליך. כתב יד זה מתאר את אחת השיטות הניתנות לשחזור באופן עקבי ביותר עבור בדיקות פלאק HSV-1/-2, עם פרטים מדויקים כלפי אמנות הבדיקה שנדונים לעתים רחוקות.
פרוטוקול נוכחי זה מקבל ספירות יחידות יוצרות פלאק חי (PFU) עבור HSV-1 ו- -2 באופן אמין. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות באמצעות תאי Vero (תאי אפיתל כליות קוף ירוק אפריקאי שעברו טרנספורמציה) במעבר נמוך (מתחת למעבר מספר 155) וגדלים באופן שגרתי באלפא-MEM17 בתוספת סרום עגל עוברי 10% (FCS), L-אלניל-L-גלוטמין, ותערובת אנטיביוטית/אנטי-מיקרוטית18. תאי Vero מופצים באופן סטנדרטי במדיום זה פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע בדילול של 1/5 בכל פעם.

<table><tbody><tr><td>צלחות 12 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>אלפא-MEM</td><td>לונזה</td><td>12169F</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה/אנטי-פטריית</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>קריסטל סגול</td><td>אלפא אסאר</td><td>B2193214</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>PBS (ללא Mg++ או Ca++)</td> <td>של Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>Millipore-Sigma</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>GS07F161BA</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>מתיל צלולוז</td><td>Millipore-Sigma</td><td>27-441-0</td><td></td></tr><tr><td>סוכן רבעוני (Lysol I.C.)</td><td>תרמו פישר</td><td>NC9645698</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>קורנינג</td><td>25900CI</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>ציטיבה</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>תאי ורו</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr></tbody></table>

הפלקה של וירוסי הרפס סימפלקס

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

ישנם פרוטוקולים רבים שפורסמו עבור וירוסים plaquing, כולל הפניות בתוך הספרות הראשית למתודולוגיה. עם זאת, וירוסים plaquing יכול להיות קשה לביצוע, הדורשים התמקדות מפרטים שלה עידון. זוהי שיטה מאתגרת להפליא עבור תלמידים חדשים לשלוט, בעיקר משום שהיא דורשת תשומת לב קפדנית לפרטים הקטנים ביותר. הדגמה זו של וירוסים הרפס סימפלקס plaquing צריך לעזור לאלה שנאבקו עם לדמיין את השיטה, במיוחד הניואנסים שלה, לאורך השנים. בעוד שכתב יד זה מבוסס על אותם עקרונות של מתודולוגיית הפלקה הסטנדרטית, הוא שונה בכך שהוא מכיל תיאור מפורט של (1) כיצד לטפל בצורה הטובה ביותר בתאים מארחים כדי למנוע הפרעה במהלך התהליך, (2) מדיום צמיג שימושי יותר מאשר אגרוז כדי להגביל את פיזור הוויריונים, ו - (3) הליך קיבעון והכתמה פשוט המייצר תוצאות ניתנות לשחזור אמינות. יתר על כן, הסרטון המצורף מסייע להדגים את ההבחנות העדינות בתהליך, אשר לעתים קרובות חסרים כאשר מנחים אחרים על ביצוע בדיקות פלאק.

טבלה 1 מציגה ניסוי בעל תוצאות מיטביות. כל הדילולים פי 10 באים בעקבות ירידה של פי 10 בספירת הפלאק. נתונים מסוג זה ניתן לראות גם באיור 2, בדיקת פלאק בפועל שבה מספר הלוחות הניתן לספירה נפל בטווח של 10-4 עבור כל שלושת המשכפלים. אותו הדבר ניתן לראות באיור 3, השורה העליונה, שבה מספר הלוחות הניתן לספירה היה בדילול של 10-3 .
עם זאת, איור 3, השורה התחתונה, מציג תוצאה שונה לחל...

הפלקה היא שיטה שגרתית המשמשת לכימות וירוסים חיים באוכלוסייה. למרות שהפלקה נלמדת לעתים קרובות בתוכניות לימודים מיקרוביולוגיות שונות עם חיידקים ובקטריופאג'ים, הפלקה של וירוסים יונקים מורכבת יותר וגוזלת זמן רב יותר. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים המתפקדים באופן אמין לעבודה רגילה עם וירוסי הרפס סימפלקס.

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

הפרוטוקול מסייע לתלמידים לזהות זיהומים בודדים בבירור ולבצע את הבדיקה בקלות, מה שהופך אותו ליעיל יותר לכמת טיטר ויראלי. פרוטוקול זה משלב הליך קיבעון והכתמה פשוט המפיק תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הדיוק והיעילות של טיפולים אנטי-ויראליים נגד מחלות.המשוכות הקשות יותר של פרוטוקול הפלקה הזה הן ספירת התאים עבור זריעת לוחות, מוודאים שהתאים אינם צפופים, מתייבשים או נשרטים לאורך כל התהליך. אפשר גם למצוא קושי באופי הקפדני הכולל של פרוטוקול זה. עם זאת, בפועל הוא תורם מרכזי של ההצלחה של ניסוי זה.כדי להתחיל, להשלים את דילול המדגם בתוספת של וירוס לתאים במושב מעבדה אחד. לדלל באופן סדרתי כל דגימת וירוס להיות פלאק ב- PBS. בדרך כלל יש להשתמש בדילולים של פי 10 למעקב המדויק ביותר.שמור את כל הדילולים הנגיפיים על הקרח עד שיהיה מוכן להוסיף את דגימות הנגיף המדוללות האלה לתאים. הסר את מדיום תרבית התאים מבאר אחת או שתיים באמצעות פיפטה. הוסף בזהירות את דגימת הווירוס המדוללת טיפה לכל חד שכבתי של תאים dropwise דרך הצד של כל באר.חזור על התהליך עבור כל באר אחת או שתיים עד הצלחת כולה מתמלאת עם דגימות וירוס להיות פלאק. רוק בעדינות את הצלחת כולה ביד. ואז לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי לאפשר את ספיחת הנגיף.לאחר כל 10 דקות, להסיר את הצלחת מן האינקובטור, בעדינות לטלטל אותו שוב כדי להפיץ את הנגיף באופן שווה יותר על פני כל באר, ולאחר מכן למקם אותו בחזרה באינקובטור. כדי להפחית את האפשרות של ספירה בשוגג של inoculum unabsorbed, להסיר את דגימת הנגיף מן הבארות באמצעות קצה פיפטה 1000 מיקרוליטר ולהשליך את המדגם בכוס פסולת. מניחים 2.5 מיליליטר של כיסוי מתילצלולוז על הצלחת, ומחזירים אותו לאינקובטור.לחטא את הפסולת, בדרך כלל עם תוספת של אקונומיקה, יודופר, או וירוקסיד דומה, לפני הסרתו מארון הבטיחות הביולוגית. לאחר הדגירה בת היומיים, הסירו את שכבת היתר של מתילצללוז מבאר אחת או שתיים בכל פעם באמצעות פיפטה, והניחו אותה בכוס פסולת. הוסף כשני מיליליטר של 1% סגול קריסטל ב 50% אתנול לכל באר.לדגור על הצלחת עם כל הבארות מלאות בכתם במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בשלב זה, לחטא את הפסולת כפי שהוכח בעבר. לשטוף את הצלחות במרץ עם מי ברז עד נגר ברור.ודא שיש הבדלים של פי 10 במספר הלוחות בכל סדרת דילול. האיור מתאר ירידה של פי 10 בספירת הלוחות שבהם מספר הלוחות הניתן לספירה ירד בטווח של 10 עד מינוס 4 עבור כל שלושת המשכפלים. שלוש התמונות הראשונות באיור מתארות לוחות בדילול של 10 עד מינוס שלוש.עם זאת, השורה התחתונה מציגה תוצאות כאשר בדיקת פלאק אינה מתנהלת היטב. ישנם מעט מאוד לוחות הנראים מכל דילול באזורים הנראים לעין סביב החלק העליון שבו תאי Vero הוסרו לחלוטין מן המצע. באופן דומה, נתון זה מראה בעיות עם תאים מתייבשים או טיפול לקוי במהלך בדיקת פלאק.עם זאת, נתון זה מראה באופן ביקורתי זריעת תאי Vero עניים. כל באר מראה כתמים סגולים כהים יותר, המעידים על תאים שאינם מתפשטים היטב על פני הבאר ונערמו זה על גבי זה באשכולות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ודא שהנגיף מתפשט באופן אחיד על פני הצלחת כדי למנוע לוחות מגובשים בדיקות פלאק יעילים יותר מאשר שיטות כמותיות אחרות כי זה סופר רק וירוס חי.בדרך זו, יעילות אנטי ויראלית אמיתית ניתן לבסס. בנוסף, טכניקה זו אפשרה לנו לכמת נוכחות ויראלית על fomites ולחקור את האפקטיביות של אספקת תרופות ממכשירים רפואיים חדשניים בתוך המגזר שלנו של מחקר וירוס הרפס.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

במאמר זה יתאר וידאו השימוש...

דגם גופיים Organotypic הקרני של הרפס סימפלקס סוג אפיתל החריף וירוס אני זיהום

הפרוטוקול מתאר את מערכת מודל יעיל לשחזור ללמוד הרפס סימפלקס סוג הנגיף 1 (HSV-1) ההשהיה מחדש. Assay מעסיקה הומוגניות תרבויות נוירונים אוהדים ומאפשר לנתיחה מולקולרית של וירוסים נוירונים אינטראקציות באמצעות מגוון של כלים, כולל התערבות RNA וביטוי של חלבונים רקומביננטיים.

תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

רוב המחקרים של מחלת קרנית herpetic משתמשים במודל זיהום עיקרי. עם זאת, זיהום ראשוני עם HSV-1 אינו בדרך כלל להוביל למחלות אנושיות. כאן אנו מתארים מודל חוזר של מחלה בקרנית herpetic, אשר באופן הדוק יותר מחקה מחלות אנושיות.

Keratitis חוזר herpetic סטרומה בעכברים, מודל ללימוד HSK אנוש

סרטון זה מתאר את בדיקת רובד הנגיף של נגיף הרפס סימפלקס מדבק או HSV. החלקיקים הנגיפיים המדוללים מחוסנים לשכבה החד-שכבתית של תאי אפיתל. עם הדגירה, הנגיף יוצר פלאקים ונספר חזותית כדי לקבוע את titer הנגיף זיהומיות.

בדיקת פלאק וירוס: טכניקה למדידת וירוס הרפס סימפלקס זיהומי באמצעות כימות של רבדים שנוצרו בשכבה אחת של תאים נגועים בנגיף

סרטון זה מדגים את השיטה לביצוע בדיקת פלאק באמצעות וירוס המתקבל מקרנית חזיר נגועה. קרנית החזיר משמשת לבדיקת היעילות האנטי-ויראלית של תרופות ניסיוניות.

קביעת יעילות אנטי-ויראלית של תרופות ניסיוניות באמצעות בדיקת פלאק

הקמנו ניאון בפרוטוקול הכלאה באתרו לצורך זיהוי של גנום נגיף ה-DNA מתמשך בתוך סעיפי רקמות של מודלים של בעלי חיים. פרוטוקול זה מאפשר לימוד תהליך זיהום על ידי codetection של הגנום הנגיפי, מוצרי RNA שלו, וחלבונים נגיפיים או סלולריים בתוך תאים בודדים.

איתור של הגנום והתמלילים של וירוס ה-DNA מתמיד ברקמות עצבית על ידי פלורסנט באתרו הכלאת שילוב עם Immunostaining

העור הוא רקמת מטרה אחת של הפתוגן האנושי הרפס סימפלקס וירוס סוג 1 (HSV-1). כדי לחקור את מסלול הפלישה של HSV-1 לרקמה, הקמנו מודל זיהום ex vivo של יריעות אפידרמיס של עכברים המייצגות את שכבת העור החיצונית ביותר.

זיהום Ex Vivo של Murine אפידרמיס עם סוג וירוס הרפס סימפלקס 1

אנו מתארים את השימוש בקרנית חזירית כדי לבדוק את היעילות האנטי ויראלית של תרופות ניסיוניות.

רקמת קרנית חזירית Explant ללמוד את היעילות של וירוס הרפס סימפלקס-1 אנטי ויראלי

בכתב יד זה, אנו מתארים שיטה פשוטה של צמיחה, טיהור, ו titration של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי לשימוש פרה-קוליני.

צמיחה, טיהור, ו Titration של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי

המאמר הנוכחי מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לבודד ולאפיין RNA פולימראז גרסאות נאמנות RNA של וירוסים וכיצד להשתמש בתדר נתונים מוטציה כדי לאשר את השינויים נאמנות בתרבית רקמה.

בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

למדו שיטת הפלקה לכימות וירוסי הרפס סימפלקס בתאי יונקים. פרוטוקול זה משלב תהליכי קיבוע וצביעה פשוטים לתוצאות אמינות וחוזרות, ומסייע בהערכת יעילות טיפולים אנטי-ויראליים.

הפלקה של וירוסי הרפס סימפלקס

גלה סרטונים נוספים