Name: הכנה לדוגמה וכמות יחסית באמצעות מתילציה מופחתת של אמינים למחקרי פפטידומית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: למד שיטה לשימור פפטידים תוך-תאיים באמצעות חימום לכיבוי פרוטאזות, וכימות יחסי בעזרת תיוג איזוטופי ו-LC-MS. מתאים לניתוח דגימות ביולוגיות שונות במחקרי פפטידומית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפיתוח והשימוש בטכניקות המתוארות כאן נתמכו על ידי מענק המועצה הלאומית הברזילאית 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) grants 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) ו-21/01286-1 (MEME). למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף וניתוח הנתונים, ההחלטה לפרסם או הכנת המאמר.

<ol><li>Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+era+of+%27omics+unlimited%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The era of 'omics unlimited.</a> Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).</li>
<li>Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+peptides+and+peptidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Plant peptides and peptidomics.</a> Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).</li>
<li>Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peptidomics+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">The peptidomics concept.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).</li>
<li>Dallas, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+peptidomics%3A+applications%2C+purification%2C+identification%2C+quantification%2C+and+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis.</a> Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).</li>
<li>Chard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+radioimmunoassay+and+related+techniques+%283rd+Ed%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed).</a> FEBS Letters. 238 (1), 223(1988).</li>
<li>Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidomics-based+discovery+of+novel+neuropeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides.</a> Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).</li>
<li>Baggerman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Peptidomics.</a> Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).</li>
<li>Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+irradiation+increases+recovery+of+neuropeptides+from+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues.</a> Peptides. 11, 1191-1197 (1990).</li>
<li>Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+neuropeptidomics+of+microwave-irradiated+mouse+brain+and+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).</li>
<li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+yeast+peptidome+and+comparison+with+the+human+peptidome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome.</a> PLoS One. 11 (9), 0163312(2016).</li>
<li>Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Intracellular+Peptides+from+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain.</a> Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).</li>
<li>Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mouse+brain+peptides+using+mass+spectrometry-based+peptidomics%3A+implications+for+novel+functions+ranging+from+non-classical+neuropeptides+to+microproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins.</a> Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).</li>
<li>Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidomic+analysis+of+human+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Peptidomic analysis of human cell lines.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).</li>
<li>De Araujo, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+peptides+in+cell+biology+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Intracellular peptides in cell biology and pharmacology.</a> Biomolecules. 9, 150(2019).</li>
<li>Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+from+natural+or+rationally+designed+sources+can+be+used+in+overweight%2C+obesity%2C+and+type+2+diabetes+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies.</a> Molecules. 25 (5), 1093(2020).</li>
<li>Sakaya, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidomic+profiling+of+cerebrospinal+fluid+from+patients+with+intracranial+saccular+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms.</a> Journal of Proteomics. 240 (3), 104188(2021).</li>
<li>Fricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+peptidomics%3A+General+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative peptidomics: General considerations.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).</li>
<li>Southey, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+label-free+quantitative+peptidomics+approaches+to+characterize+diurnal+variation+of+peptides+in+the+rat+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).</li>
<li>Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+using+SILAC%3A+Principles%2C+applications%2C+and+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments.</a> Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).</li>
<li>Boonen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+peptidomics+with+isotopic+and+isobaric+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).</li>
<li>Gewehr, M. C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+thimet+oligopeptidase+in+the+regulation+of+energy+metabolism+and+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity.</a> Biomolecules. 10 (2), 321(2020).</li>
<li>Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+profile+of+zebrafish+brain+in+a+6-OHDA-induced+Parkinson+model%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model.</a> Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+peptidomics+using+reductive+methylation+of+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).</li>
<li>Tashima, A. K., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+peptidomics+with+five-plex+reductive+methylation+labels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).</li>
<li>Che, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+neuropeptide+extraction+from+the+mouse+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus.</a> Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).</li>
<li>Lyons, P. J., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidomic+approaches+to+study+proteolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Peptidomic approaches to study proteolytic activity.</a> Current Protocols in Protein Science. , Chapter 18 13(2011).</li>
<li>Udenfriend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescamine%3A+a+reagent+for+assay+of+amino+acids%2C+peptides%2C+proteins%2C+and+primary+amines+in+the+picomole+range%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range.</a> Science. 178 (4063), 871-872 (1972).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEAKS%3A+powerful+software+for+peptide+de+novo+sequencing+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEAKS+DB%3A+de+novo+sequencing+assisted+database+search+for+sensitive+and+accurate+peptide+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).</li>
<li>Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+brain+neuropeptidomics%3A+tissue+collection%2C+protease+inhibition%2C+neuropeptide+extraction%2C+and+mass+spectrometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).</li>
<li>Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+mass+spectrometry-based+peptidomic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).</li>
<li>Ross,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+tags%3A+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).</li>
</ol>

אין אינטרסים פיננסיים מתחרים קיימים.

ברוב המחקרים פפטידום, אחד הצעדים הקריטיים הוא, ללא ספק, הכנת המדגם כי צריך להתבצע בקפידה כדי למנוע נוכחות של שברי פפטיד שנוצר על ידי פרוטאזים לאחר כמה דקות לאחר המוות. המחקרים הראשוניים על תמציות מוח שהוכנו מדגימות שאינן במיקרוגל הראו מספר רב של שברי חלבון להיות נוכחים 10-kDa microfiltrates. גישות שונות תוארו כדי למנוע ספקטרום פפטיד מהשפלת חלבון: הקרבת בעלי חיים בהקרנת מיקרוגל ממוקדת6,8, ניתוח קריוסטט ואחריו חיץ מיצוי רותח31, וה...

מדעי "Omics" מאופיינים בניתוח עמוק של ערכת מולקולות, כגון DNA, RNA, חלבונים, פפטידים, מטבוליטים וכו '. ערכות נתונים בקנה מידה גדול אלה (גנומיקה, תמלול, פרוטאומיה, פפטידומיקה, מטבולומיה וכו ') חוללו מהפכה בביולוגיה והובילו להבנה מתקדמת של תהליכים ביולוגיים1. המונח פפטידומיקה החל להיות מוצג בתחילת המאה ה -20, וכמה מחברים התייחסו אליו כענף של פרוטאומיקס2. עם זאת, לפפטידוזיקה יש פרטים ברורים, כאשר האינטרס העיקרי הוא לחקור את תוכן הפפטידים שנוצר באופן טבעי במהלך תהליכים תאיים, כמו גם את אפיון הפעילות הביולוגית של מולקולות אלה3,4.
בתחילה, מחקרי פפטיד ביואקטיביים הוגבלו נוירופפטידים ופפטידים הורמונליים באמצעות השפלה אדמן ורדיוימונואסאי. עם זאת, טכניקות אלה אינן מאפשרות ניתוח גלובלי, בהתאם לבידוד של כל פפטיד בריכוזים גבוהים, זמן ליצירת נוגדנים, מלבד אפשרות תגובה צולבת5.
ניתוח פפטידומיקה התאפשר רק לאחר מספר התקדמות בכרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריית מסה (LC-MS) ופרויקטים של גנום שסיפקו מאגרי נתונים מקיפים למחקרי פרוטאומיקה/פפטידומיקה6,7. יתר על כן, פרוטוקול מיצוי פפטיד ספציפי עבור peptidomes היה צריך להיות הוקם כי המחקרים הראשונים שניתחו neuropeptides ברחבי העולם בדגימות המוח הראו כי זיהוי הושפע השפלה מסיבית של חלבונים, אשר מתרחשים בעיקר ברקמה זו לאחר 1 דקות לאחר המוות. נוכחותם של שברי פפטיד אלה הסתירו את אות הנוירופפטיד ולא ייצגו את הפפטידום ב- vivo. בעיה זו נפתרה בעיקר עם היישום של חימום מהיר של פעילות פרוטאזים באמצעות הקרנת מיקרוגל, אשר הפחית באופן דרסטי את נוכחותם של שברי חפץ אלה ואפשר לא רק זיהוי של שברי נוירופפטיד, אלא חשף את נוכחותם של קבוצה של פפטידים מחלבונים ציטוזוליים, מיטוכונדריאליים וגרעין, שונים של degradome6,8,9.
הליכים מתודולוגיים אלה אפשרו הרחבה של הפפטידום מעבר לנוירופפטידים הידועים, שם זוהו מאות פפטידים תאיים שנוצרו בעיקר על ידי פעולת הפרוטאוזומים בשמרים10, זברה11, רקמות מכרסמים12 ותאים אנושיים13. עשרות פפטידים תאיים אלה הוכחו בהרחבה כבעלי פעילויות ביולוגיות ופרמקולוגיות כאחד14,15. יתר על כן, פפטידים אלה יכולים לשמש סמנים ביולוגיים של מחלות ואולי יש משמעות קלינית, כפי שהוכח בנוזל השדרתי מחולים עם מפרצת תוך גולגולתית16.
נכון לעכשיו, בנוסף לזיהוי רצפי פפטיד, ניתן באמצעות ספקטרומטריית מסה להשיג נתונים של כמות מוחלטת ויחסית. בכמות המוחלטת, רמות הפפטיד במדגם ביולוגי מושוות לתקנים סינתטיים, ואילו בכמות היחסית, רמות הפפטיד משווות בין שתי דגימות או יותר17. כמות יחסית יכולה להתבצע באמצעות הגישות הבאות: 1) "תווית חינם"18; 2) בסימון מטבולי vivo או 3) תיוג כימי. שני האחרונים מבוססים על שימוש בצורות איזוטופיות יציבות המשולבות בפפטידים19,20. בניתוח ללא תוויות, רמות הפפטיד מוערכות על ידי התחשבות בעוצמת האות (ספירות ספקטרליות) במהלך LC-MS18. עם זאת, תיוג איזוטופי יכול להשיג רמות יחסיות מדויקות יותר של פפטידים.
מחקרים פפטידום רבים השתמשו טרימתילאמוניום butyrate (TMAB) תיוג ריאגנטים כמו תיוג כימי, ולאחרונה, מתילציה רדוקטיבית של אמינים (RMA) עם צורות deuteed ולא deuteed של פורמלדהיד ונתרן cyanoborohydride ריאגנטים שימשו11,21,222. עם זאת, תוויות TMAB אינן זמינות מסחרית, ותהליך הסינתזה הוא מייגע מאוד. מצד שני, ב RMA, ריאגנטים זמינים מסחרית, זול בהשוואה תוויות אחרות, ההליך הוא פשוט לביצוע, ואת פפטידים מסומנים יציבים23,24.
השימוש ב- RMA כרוך בהקמת בסיס שיף על ידי מתן אפשרות לפפטידים להגיב עם פורמלדהיד, ואחריו תגובת הפחתה באמצעות ציאנובורוהידריד. תגובה זו גורמת דימתילציה של קבוצות אמינו חינם על N-מסופים ושרשראות צד ליצין ו monomethylates N-מסוף prolines. איך שאריות פרולין הם לעתים קרובות נדיר על N-מסוף, כמעט כל הפפטידים עם אמינים חינם על N-טרמינל מסומנים עם שתי קבוצות מתיל23,24,25.

<table><tbody><tr><td>מסנני חיתוך 10 kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Amicon Ultra-4, ממברנת PLGC Ultracel-PL, 10 kDa</td></tr><tr><td>אצטון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1000291000</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>11213</td><td></td></tr><tr><td>טור אנליטי (EASY-Column)</td><td>EASY-Column</td><td>(SC200)</td><td>&nbsp; 10 ס"מ, ID75 ומיקרו; m, 3 ומיקרו; m, C18-A2</td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>פלואורסקמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד-13C, d2, תמיסה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>596388</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד-d2 תמיסה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33015</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים</td><td>Quimis</td><td>Q216</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית - HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>צינורות שימור חלבון LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030108116-100EA</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>תנור מיקרוגל LTQ Velos</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Panasonic</td><td>NN-ST67HSRU</td><td></td></tr><tr><td>n Easy-nLC II nanoHPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC140</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS Studio</td><td>Bioinformatics Solutions Inc.</td><td>גרסה 8.5</td><td></td></tr><tr>מי<td>מלח חוצץ פוספט</td><td>Invitrogen</td><td>3002</td><td>טבליות</td></tr><tr><td>precolumn (EASY-Column)</td> <td>תרמו פישר מדעי</td> <td>(SC001)</td> <td>2 ס"מ, ID100 ומיקרו; m, 5 ומיקרו; m, C18-A1</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>Hermle</td><td>Z326K</td><td>לצינורות חרוטיים</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td></td><td>Vision VS15000CFNII</td><td>למיקרו-צינורות</td></tr><tr><td>עמודי ניקוי שלב הפוך&nbsp; &nbsp; (מחסנית Oasis HLB 1 סמ"ק)</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td>Oasis HLB 1 סמ"ק מחסנית</td></tr><tr><td>נתרן ציאנובורודוטריד - NaBD3CN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190020</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציאנובורוהידריד - NaBH3CN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156159</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td>הערה: 0.2 M PB = 0.1 M מאגר פוספט pH 6.8 (26.85 מ"ל Na2HPO3 1M) בתוספת 0.1 M מאגר פוספט pH 6.8 (23.15 מ"ל של NaH2PO3 1M) עד 250 מ"ל מים</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q55-110</td><td></td></tr><tr>רצף חומצות אמינו<td>פפטיד</td><td>Proteimax</td><td></td> סטנדרטי<td>: מאגר טריאתילאמוניום LTLRTKL</td></tr><tr><td>- TEAB 1 M</td> חומצה טריפלואורואצטית <td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>- TFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>מים מטוהרים במיוחד</td><td>Milli-Q</td><td>Direct-Q 3UV</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגת ואקום</td><td>GeneVac</td><td>MiVac רכז DNA</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>Cientec</td><td>266</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur תוכנה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>OPTON-30965</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה לדוגמה וכמות יחסית באמצעות מתילציה מופחתת של אמינים למחקרי פפטידומית

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

פפטידומיקה יכולה להיות מוגדרת כניתוח איכותי וכמותי של פפטידים במדגם ביולוגי. היישומים העיקריים שלה כוללים זיהוי סמנים ביולוגיים פפטיד של מחלות או מתח סביבתי, זיהוי נוירופפטידים, הורמונים, פפטידים תאיים ביואקטיביים, גילוי פפטידים מיקרוביאליים ו nutraceutical מחלבון הידרוליזטים, וניתן להשתמש בהם במחקרים כדי להבין את התהליכים הפרוטאוליטיים. ההתקדמות האחרונה בהכנת מדגם, שיטות הפרדה, טכניקות ספקטרומטריית מסה וכלים חישוביים הקשורים לרצף חלבונים תרמה לעלייה במספר הפפטידים והפפטידום המזוהים המאופיינים. מחקרים פפטידום לעתים קרובות לנתח פפטידים שנוצרים באופן טבעי בתאים. כאן, פרוטוקול הכנה מדגם המבוסס על אי-פעילות חום מתואר, אשר מבטל פעילות פרוטאז, ומיצוי עם תנאים קלים, כך שאין מחשוף קשרים פפטיד. בנוסף, כמות יחסית של פפטידים באמצעות תיוג איזוטופ יציב על ידי מתילציה מופחתת של אמינים מוצג גם. שיטת תיוג זו יש כמה יתרונות כמו ריאגנטים זמינים מסחרית, זול בהשוואה לאחרים, יציב מבחינה כימית, ומאפשר ניתוח של עד חמש דגימות בריצה אחת LC-MS.

התוצאות המתקבלות מהריצות שבוצעו בספקטרומטר המסה מאוחסנות בקבצי נתונים גולמיים שניתן לפתוח בתוכנת ספקטרומטר המסה. בספקטרום MS, ניתן לצפות בקבוצות שיא המייצגות פפטידים מסומנים על פי ערכת התיוג המשמשת, החל 2-5 תוויות. לדוגמה, באיור 2, זוגות פסגות שזוהו בזמן כרומטוגרפי מיוצגים בניסוי שבו נעשה שימוש בשתי תוויות איזוטופיות בלבד בשתי דגימות שונות באותה ריצה. איור 3 מציג אפשרויות אחרות לתוצאות חיוביות, תוך שימוש ב- 3 ו- 4 תוויות שונות בכל הפעלת LC-MS. בעת שימוש ב- 4 או ...

מאמר זה מתאר שיטת הכנה לדוגמה המבוססת על אי-פעולת חום כדי לשמר פפטידים אנדוגני הימנעות השפלה לאחר המוות, ואחריו כמות יחסית באמצעות תיוג איזוטופי בתוספת LC-MS.

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

כאן, אנו מתארים שיטת הדרכה המבוססת על אי-אקטיביציה מהירה של פרוטאז כדי לשמר פפטידים תאיים טבעיים, למנוע השפלה בתאים וברקמות, ואחריו כמות יחסית של פפטידים באמצעות תיוג איזוטופי. לשיטת תיוג זו יש כל כך הרבה יתרונות. ריאגנטים זמינים מסחרית, זולים, יציבים מבחינה כימית, ומאפשרים ניתוח של עד חמש דגימות בסרום אחד.התחל על ידי טיפוח תאי נוירובלסטומה אנושיים בצלחת 15 ס"מ ב- DMEM המכילה 15% FBS ו 1%פניצילין סטרפטומיצין. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של PBS, לגרד את התאים, ולאסוף אותם לתוך צינור 15 מיליליטר.צנטריפוגות התאים ב 800 פעמים G במשך חמש דקות ולהסיר את supernatant. resuspend הכדור במיליליטר אחד של מים דה-יוניים מטוהרים במיוחד ב 80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר את התוכן של הצינור לצינור מיקרופוגה שני מיליליטר. לאחר אי-פעילות חום של דגי זברה, אסוף את כל המוח בצינור מיקרו-פוגה של שני מיליליטר והקפיא אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח.resuspend דגימת הרקמה במיליליטר אחד של מים דה-יוניים מטוהרים במיוחד ב 80 מעלות צלזיוס sonicate עם בדיקה באמצעות 30 פולסים של שנייה אחת. לדגור על הרקמה הסלולר lysate או הומוגני ב 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, ולאחר מכן לקרר אותו על קרח במשך 10 עד 30 דקות. הוסף 10 מיקרוליטרים של תמיסת ציר חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת עבור כל מיליליטר אחד של נפח המדגם.מערבבים על ידי מערבולת במשך 20 שניות ודגרה על קרח במשך 15 דקות. צנטריפוגט את ליסאט התא או את הרקמה הומוגנית ב 12, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאסוף את supernatant בצינורות microcentrifuge חלבון מחייב נמוך ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.נקה את התקני האולטרה סינון במים וצנטריפוגה ב- 2, 300 פעמים G במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להשליך את המים מהתקן סינון אולטרה. פיפטה הסופר-נט לתוך מסנן חיתוך 10 קילודלטון שטוף מראש ומסתובב בצנטריפוגה בקירור בארבע מעלות צלזיוס. בדוק את רמת ה-pH של הדגימה.שיווי משקל את העמודה עם מיליליטר אחד של 100% acetonitrile, ולאחר מכן לשטוף אותו עם מיליליטר אחד של 5% acetonitrile עם 0.1%חומצה טריפלואורואצטית. לטעון את הנפח המלא של המדגם בעמודה לשטוף את העמודה עם מיליליטר אחד של 5% acetonitrile עם 0.1%חומצה trifluoroacetic. אלימו את הפפטידים מהטור עם 1.8 מיליליטר של 1%acetonitrile עם 0.15%חומצה טריפלואורואצטית לצינורות מיקרוצנטריפוגה בעלי קשירה נמוכה של חלבון.ייבשו את הדגימה לחלוטין בצנטריפוגת ואקום ב-30 מעלות צלזיוס וניטרו את זמן הריכוז המוצג. לאחסן את המדגם במינוס 80 מעלות צלזיוס. resuspend דגימות פפטיד ב 100 עד 200 microliters של מים מטוהרים במיוחד פיפטה 2.5 מיקרוליטרים של ריכוזי פפטיד סטנדרטיים ודגימות על צלחת לבן 96 באר.הוסף 25 מיקרוליטרים של 0.2 חוצץ פוספט טוחן ו 12.5 מיקרוליטרים של פלואורסצמין. הומוגניזציה בעדינות במשך דקה אחת על המסובב מסלולית. לאחר מכן, להוסיף 110 microliters של מים כדי לעצור את התגובה.כוונן את ההגדרות על הספקטרופלואורומטר ולאחר מכן קרא את הצלחת. הוסיפו נפח 1/10 של טרימתילמוניום ברומיד טוחנת אחד לכל דגימת פפטיד עם עד 25 מיקרוגרם של הפפטיד. ודא כי ה- pH הוא בין חמש לשמונה, התאמה עם חומצה הידרוכלורית או נתרן הידרוקסיד, במידת הצורך.הוסף ארבעה מיקרוליטרים של פורמלדהיד לא מפורסמים, מפורסמים או פחמן-13 מפורלדהיד מפורקטים. מערבבים במשך חמש שניות על ידי מערבולת. הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של נתרן ציאנובורוהידריד או נתרן ציאנובורוהידריד מפורק לדגימת הפפטיד.ואז לערבב את המדגם במשך חמש שניות על ידי מערבולת. לדגור על דגימת הפפטיד במכסה המנוע במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מערבולת כל 30 דקות. חזור על התוספת של לא deuterated, deuterated, או פחמן-13 מפורלדהיד מפורלדהיד נתרן ציאנובורוהידריד או נתרן deuterated ציאנובורוהידריד, מערבולת לאחר כל תוספת.לדגור את הדגימות במכסה המנוע האדים לילה בטמפרטורת החדר. מוסיפים 16 מיקרוליטרים של אמוניום ביקרבונט ומערבבים על ידי מערבולת. מניחים את הדגימה על קרח.הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של 5% חומצה ומערבולת לחמש שניות נוספות. שלב את דגימות הפפטיד, להתאים את ה- pH בין שתיים לארבע, ולאחר מכן להתפלת הדגימות המשולבות על עמודות ניקוי פאזה הפוכות באמצעות acetonitrile וחומצה trifluoroacetic כפי שתואר בעבר. יבשו את המדגם כולו בצנטריפוגת ואקום ב-30 מעלות צלזיוס, ואז אחסנו אותה במינוס 20 מעלות צלזיוס.הפפטידים המסומנים נצפים באמצעות ספקטרום מסה. חצים אדומים מצביעים על נוכחות של זוגות שיא של פפטידים שונים המסומנים בשתי צורות איזוטופיות, L1 ו- L5, להשוואה בין שתי דגימות שונות S1 ו- S2 בהתאמה. ספקטרום המסה של פפטיד הנמצא בשלוש דגימות שונות, S1, S2 ו- S3, המסומן בתגי L1, L3 ו- L5 בהתאמה מוצג כאן.בוצע תיוג מרובע. דגימות בקרה S1 ו- S3 סומנו עם L1 ו- L3 בהתאמה בהשוואה לשתי דגימות ניסיוניות, S2 ו- S4 המסומנות ב- L2 ו- L4.No נצפתה הבדל משמעותי. תיוג איזוטופי שימש להצגת מצעים במוצרים במבחנה עבור פרוטאז נתון או פפטידאז.פפטיד שאינו משתנה בנוכחות האנזים הנוירוליסין מוצג כאן. פפטידים שנעלמים או מפחיתים בנוכחות האנזים הם מצעים, ואילו אלה הגדלים נחשבים למוצרים. האיור הוא דוגמה לזיהוי רצף פפטיד המבוצע על ידי מנוע חיפוש של מסד נתונים המסומן בשלוש צורות שונות של תגים.לפני שהוא מוגדר, ודא המדגם הוא מגניב לחלוטין כדי למנוע שבירת קשרים פפטיד שנגרם על ידי החמצה קשה. בנוסף, ניקוי של התקני סינון אולטרה הוא חיוני. ספקטרומטריית מסה היא שיטה מצוינת לכמת פפטידים בין תנאי ניסוי שונים לניתוח מחקרים על ידי זיהוי מצעים פפטידג.

sample-preparation-relative-quantitation-using-reductive-methylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מתוארות שתי שיטות להקצאת אותות התהודה המגנטית הגרעינית של α ו-ε-dimethylamine של ליזין N-terminal 13C-methylated. שיטה אחת משתמשת בסלקטיביות הנגרמת על ידי pH של תגובת המתילציה הרדוקטיבית, והשנייה משתמשת באמינופפטידאז כדי להסיר באופן סלקטיבי את הליזין הטרמינלי N.

שיטות לזיהוי תהודת ה-NMR של 13C-dimethyl N-terminal אמין על חלבונים שעברו מתילציה רדוקטיבית

תיוג איזוטופ יציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא אסטרטגיה מהירה וזולה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה מדויקת כמותית. כאן אנו מדגימים שיטה חזקה לעריכה ולניתוח של תערובות חלבון באמצעות הגישה רדה שניתן ליישם כמעט כל סוג מדגם.

פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע בדיקות כימות מוחלטות של חלבוני מטרה בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות באמצעות ניטור תגובה נבחר. הוא שימש לכימות מדויק של חלבונים של מסלול האיתות הכימוטקסיס של מקרופאגים בעכבר. בחירת פפטיד יעד, פיתוח בדיקה ובדיקות איכותיות וכמותיות מתוארים בפירוט.

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

תיוג מבשר איזוטופים בשילוב ותיוג isobaric (cPILOT) הוא אסטרטגית פרוטאומיקה כמותית המשפר יכול ריבוב מדגם של תגי isobaric. פרוטוקול זה מתאר את היישום של cPILOT לרקמות מתוך שולטת מודל עכבר מחלת אלצהיימר ו wild-type.

לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

כאן אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול של דחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית באורך ארוך אינטראקציה-טנדם כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה (LERLIC-MS / MS) שיטה. זוהי שיטה חדשנית המאפשרת כימות לראשונה ואפיון של isoforms deamidation גלוטמין ו asparagine ידי פרוטאומיקה רובה.

LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun

תיוג איזוטופי משולב ותיוג איזובארי (cPILOT) היא אסטרטגיית מולטיפלקס מדגימה משופרת המסוגלת להגדיל את מספר הדגימות שניתן לנתח בו-זמנית עם תגיות איזובריות זמינות. התאגדות של פלטפורמה רובוטית הגדילה מאוד את התפוקה הניסיונית, הרבייה והדיוק הכמותי.

מולטיפלקס לדוגמה אוטומטי באמצעות תיוג איזוטופי משולב מקדים ותיוג איסוברי (cPILOT)

הפרוטוקול נועד להציג את השימוש בספקטרומטר מסה מרובע משולש לניטור תגובה מרובה (MRM) של חלבונים מדגימות קליניות. סיפקנו זרימת עבודה שיטתית החל מהכנת מדגם לניתוח נתונים עבור דגימות קליניות עם כל אמצעי הזהירות הדרושים שיש לנקוט.

זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית

ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי נרחב המווסת מסלולים ביולוגיים מרובים. ספקטרומטריית מסות היא הטכנולוגיה הטובה ביותר ליצירת פרופיל עולמי של R-מתיל-פרוטאום, כאשר היא משולבת לגישות ביוכימיות להעשרת פפטידים מותאמים. תהליך העבודה המיועד לזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה גלובלית של R בתאים אנושיים מתואר כאן.

גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ומדידה כמותית של ארגינין חופשי וקשור לחלבון ומתיל-ארגינינים על ידי ספקטרוסקופיית H-NMR 1.

חקר ארגינין מתילום על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

למד שיטה לשימור פפטידים תוך-תאיים באמצעות חימום לכיבוי פרוטאזות, וכימות יחסי בעזרת תיוג איזוטופי ו-LC-MS. מתאים לניתוח דגימות ביולוגיות שונות במחקרי פפטידומית.

הכנה לדוגמה וכמות יחסית באמצעות מתילציה מופחתת של אמינים למחקרי פפטידומית

גלה סרטונים נוספים