Name: הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: חקור את מנגנוני ההתקבצות של EWS-FLI1 על DNA בזמן אמת באמצעות שיטת DNA Curtains. מחקר זה חושף את הקשר בין מוטיבי DNA ליצירת קונדנסטים בסרטן Ewing ומספק כלי לחקר גורמי שעתוק נוספים כמו P53 ו-MED1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NSFC מס '31670762 (Z.Q.).

<ol><li>Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+regulation+of+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organization and regulation of gene transcription.</a> Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+by+histone+methylation%3A+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+ncRNAs+allosterically+modify+RNA-binding+proteins+in+cis+to+inhibit+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription.</a> Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).</li>
<li>Alexander, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+mediates+target+gene+association+with+nuclear+speckles+for+amplified+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).</li>
<li>Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+required+for+accurate+initiation+of+transcription+by+purified+RNA+polymerase-II%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).</li>
<li>Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+and+3D+genome+conformation+in+cell-fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions.</a> Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).</li>
<li>Peng, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+and+super-enhancer%3A+Positive+regulators+in+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Models+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription.</a> Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).</li>
<li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human transcription factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li>
<li>Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-nuclear+mobility+and+target+search+mechanisms+of+transcription+factors%3A+a+single-molecule+perspective+on+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).</li>
<li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids.</a> Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).</li>
<li>Loverdo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+hopping+and+jumping+in+facilitated+diffusion+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins.</a> Physical Review Letters. 102 (18), 188101(2009).</li>
<li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li>
<li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li>
<li>Kim, S., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+interplay+between+transcription+factors+and+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome.</a> Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).</li>
<li>Shrinivas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+features+that+drive+formation+of+transcriptional+condensates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates.</a> Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).</li>
<li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates%3A+organizers+of+cellular+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA-induced+phase+separation+for+transcriptional+repressor+VRN1%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).</li>
<li>Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+binding+between+distant+transcription+factors+is+a+hallmark+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).</li>
<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li>
<li>Qi, Z., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+recombination+intermediates+with+single-stranded+DNA+curtains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains.</a> Methods. 105, 62-74 (2016).</li>
<li>Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics+of+human+RPA+and+RAD51+on+ssDNA+during+assembly+and+disassembly+of+the+RAD51+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li>
<li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+formation+by+HP1+alpha+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547, 236-240 (2017).</li>
<li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491(2021).</li>
<li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains%3A+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li>
<li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li>
<li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+EWS%2FFLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li>
<li>Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ETS+family+of+oncogenic+transcription+factors+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+tension%3A+single-molecule+DNA+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).</li>
<li>Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+C+%22Single-Molecule+Techniques%3A+A+Laboratory+Manual%22">Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual</a>. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001(2017).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים.

מכיוון שגישות של מולקולה בודדת רגישות ביותר לתכולת מערכת התגובה, יש להשקיע מאמץ נוסף כדי להבטיח איכות טובה של כל החומרים והתמיסות במהלך ניסויי וילונות הדנ"א, במיוחד השומנים שהוכנו בסעיפים 1 ו-2 והמאגרים המשמשים בסעיף 5. יש להשתמש בריאגנטים בעלי טוהר גבוה יותר להכנת חוצצים, ומאגרים חייבים להיות מוכנים טריים לבדיקה של מולקולה בודדת
כאשר EWS-FLI1 בעל התווית של 500 ננומטר mCherry נשטף לתוך התא, הופיעו מספר מגנטה פונקטה בדנ"א של למבדה המכיל את רצפי 25× ה-GGAA. שימו לב שהייתה התפלגות לא ספציפית רציפ...

ויסות שעתוק הוא צעד מכריע לביטוי גנים מדויק בתאים חיים. גורמים רבים, כגון שינוי כרומוזומלי, גורמי שעתוק (TFs) ורנ"א שאינם מקודדים, משתתפים בתהליך מסובך זה 1,2,3. בין גורמים אלה, TFs תורמים לספציפיות של ויסות שעתוק על ידי זיהוי וקשירה לרצפי DNA ספציפיים המכונים מקדמים או משפרים ולאחר מכן גיוס חלבונים פונקציונליים אחרים להפעלה או לדיכוי שעתוק 4,5,6,7. האופן שבו ה-TFs האלה מצליחים לחפש את אתרי המטרה שלהם בגנום האנושי ולתקשר עם דנ"א המצופה בהיסטונים ובחלבונים קושרי דנ"א שאינם היסטון מבלבל מדענים כבר עשרות שנים. בשנים האחרונות נבנו מספר מודלים קלאסיים למנגנון חיפוש המטרה של TFs כדי לתאר כיצד הם "מחליקים", "קופצים", "קופצים" או "מעבירים אינטרסגמנטים" לאורך שרשרת הדנ"א 8,9,10,11. מודלים אלה מתמקדים בהתנהגות החיפוש בדנ"א של מולקולת TF אחת ויחידה. עם זאת, מחקרים אחרונים מראים כי חלק מה-TFs עוברים הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS) לבד בגרעין או עם קומפלקס מתווך12. הטיפות הנצפות של TFs קשורות לאזורי המקדם או המשפר, ומדגישות את התפקיד של היווצרות עיבוי ביומולקולרי בשעתוק ואת הגנום התלת-ממדי13,14,15. עיבויים ביומולקולריים אלה קשורים לתאים חסרי ממברנה in vivo ו- in vitro. הם נוצרים באמצעות LLPS, שבו ביו-מקרומולקולות מודולריות ואזורים בעלי הפרעה פנימית (IDR) של חלבונים הם שני הכוחות המניעים העיקריים של אינטראקציות רב-ערכיות16. לפיכך, TFs לא רק מחפשים דנ"א אלא גם מתפקדים בסינרגיה בתוך עיבוייםאלה 4,17,18. נכון להיום, התכונה הביופיזית של עיבוי שעתוק אלה על דנ"א עדיין אינה ברורה.
לכן, מחקר זה נועד ליישם שיטה של מולקולה בודדת - DNA Curtains - כדי לדמות ישירות את היווצרות ודינמיקה של עיבוי שעתוק שנוצר על ידי TFs על DNA במבחנה. DNA Curtains, פלטפורמת הדמיה במבחנה בתפוקה גבוהה לחקר האינטראקציה בין חלבונים לדנ"א, יושמה בתיקון דנ"א 19,20,21, חיפוש מטרה22, ו- LLPS 17,23,24. תא הזרימה של וילונות הדנ"א מצופה בדו-שכבתי שומנים ביוטיניליים כדי לעבור את פני השטח ולאפשר לביומולקולות להתפזר על פני השטח. תבניות הזיג-זג הננו-מיוצרות מגבילות את תנועת הדנ"א. מצעי דנ"א למבדה שעברו ביוטינילציה יכולים להתיישר לאורך קצוות המחסום ולהימתח על ידי זרימת החיץ המכוון. אותם רצפי התחלה וסיום של כל המולקולות מאפשרים מעקב אחר החלבון בדנ"א ומתארים את התפלגות המיקום של אירועי הקישור25,26. יתר על כן, השילוב של וילונות DNA עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM) מסייע למזער את רעשי הרקע ולזהות אותות ברמה של מולקולה אחת. לפיכך, וילונות דנ"א יכולים להיות שיטה מבטיחה לחקור את הדינמיקה של היווצרות עיבוי שעתוק על מוטיבים של דנ"א. מאמר זה מתאר את הדוגמה של אונקופרוטאין ממשפחת FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, שנוצר על-ידי טרנסלוקציה כרומוזומלית. דנ"א למבדה המכיל 25× GGAA - רצף הקשירה של EWS-FLI127 - שימש כמצע הדנ"א בניסויי DNA Curtains כדי לבחון כיצד מולקולות EWS-FLI1 עוברות LLPS על דנ"א. כתב יד זה דן בפירוט בפרוטוקול הניסויי ובשיטות ניתוח הנתונים.

<table><tbody><tr><td>488 ננומטר דיודה לייזר מצב מוצק</td><td>קוהרנטי</td><td>OBIS488LS</td><td></td></tr><tr><td>561 ננומטר דיודה לייזר מצב מוצק</td><td>קוהרנטי</td><td>OBIS561LS</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>ראון</td><td>R003215-50 גרם</td><td></td></tr><tr><td>ביוטיניל DOPE</td><td>Avanti</td><td>870273P</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>אמרסקו</td><td>1595C027</td><td></td></tr><tr><td>ציפוי Electra 92</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-PC 5090.02</td><td>ציפוי המגן המוליך</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I בקר</td><td>Sigma</td><td>D5139-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td></td><td>Avanti 850375P</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>תמציות אריזה למבדה</td><td>Epicentre</td><td>MP5120</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>s3014</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>Idex</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NZCYM מרק</td><td>Sigma</td><td>N3643-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-2000 DOPE</td><td>Avanti</td><td>880130P-1G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>אמרסקו</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 200K, אתיל לקטט 4%</td> <td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 649.04</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950K, ANISOLE 2%</td> <td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 672.02</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B מצלמת CMOS</td><td>מדעית PHOTOMETRICS</td><td>Prime95B</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>שקופית זכוכית סיליקה</td><td>G.Finkenbeiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שסתום הזרקה שישה כיוונים</td><td>Idex</td><td>MXP9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>תרמו</td><td>S888</td><td>מדולל עם ddH2O</td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>משאבת מכשיר הרווארד</td><td>11 Elite</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146V</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1 יודיד (491/509)</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td>מדולל עם DMSO</td></tr></tbody></table>

הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי ews-fli1 המורכב על dna

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

גני האיחוי הנובעים מטרנסלוקציה כרומוזומלית נמצאו בגידולים מוצקים רבים או בלוקמיה. EWS-FLI1, השייך למשפחת אונקופרוטאינים מסוג FUS/EWS/TAF15 (FET), הוא אחד מגני האיחוי המעורבים ביותר בסרקומה ע"ש יואינג. חלבוני היתוך אלה ממשפחת FET מכילים בדרך כלל תחום בעל מורכבות נמוכה (LCD) של חלבון FET ב-N-terminus שלהם ותחום קושר דנ"א (DBD) ב-C-terminus שלהם. EWS-FLI1 אושר כיוצר עיבוי ביומולקולרי במוקדי הקישור שלו עקב אינטראקציות LCD-LCD ו-LCD-DBD, ועיבויים אלה יכולים לגייס RNA פולימראז II כדי לשפר את שעתוק הגנים. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד מרכיבים עיבויים אלה באתרי הכריכה שלהם. לאחרונה, שיטת ביופיזיקה של מולקולה אחת - DNA Curtains - יושמה כדי לדמיין את תהליכי ההרכבה האלה של עיבוי EWS-FLI1. כאן נדון פרוטוקול הניסוי המפורט וגישות ניתוח הנתונים ליישום וילונות דנ"א בחקר המעבים הביומולקולריים המרכיבים על דנ"א המטרה.

הסכימה של וילונות דנ"א מוצגת באיור 1A, איור 1B ואיור 1D. רצף המטרה המשוכפל המכיל 25 חזרות רצופות של GGAA נמצא במקדם NORB1 בסרקומה ע"ש יואינג. רצף יעדים זה הוא קריטי לגיוס EWS-FLI128. מולקולות EWS-FLI1 הודגמו על-ידי זיהוי אותות EWS-FLI1 בעלי תווית mCherry שהתקבלו באמצעות לייזר של 561 ננומטר (איור 1C ואיור 1E). לאחר שניסוי ב-DNA Curtains הוקם,...

במאמר זה נתאר את השימוש בשיטת ההדמיה של מולקולה בודדת, DNA Curtains, כדי לחקור את המנגנון הביופיזי של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על דנ"א.

הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

אנו מספקים בדיקה של מולקולה בודדת כדי לבחון את הפרדת הפאזה של גורמי שעתוק על DNA טכניקה זו מאפשרת מימוש בזמן אמת של התהליך הדינמי של גורמי שעתוק המורכבים כטיפה נוזלית על הדנ"א. EWS-FL1 הוא אחד מגני האיחוי המעורבים ביותר בגידולי סרקומה ע"ש יואינג. המחקר שלנו יכול לזהות את הקשר בין מספר מוטיב הדנ"א לבין היווצרות עיבוי EWS-FL1 הקשור לתעתוק גנים עקרים בתאי הגידול, ואולי מועיל לפרוגנוזה.ניתן ליישם שיטה זו כדי לחקור כל עיבוי שעתוק או קומפלקסים במבחנה, כמו P53 ו- MED1. כדי להכין תא זרימה עם מחסומים מפוברקים של ננו-זיגזג לניסוי וילון DNA, חברו את צינורות הקלט והפלט בכיוון הנכון. לאחר מכן לשטוף את תא הזרימה עם 2.5 מיליליטר של מאגר שומנים באמצעות שני מזרקים שלושה מיליליטר, להבטיח שאין בועה בתא הזרימה.מוציאים את המזרק מהפלט ומזריקים מיליליטר אחד מתמיסת הליפוזום שלוש פעמים עם דגירה של חמש דקות בין כל הזרקה. לריפוי, שטפו מחדש את תא הזרימה עם 2.5 מיליליטר של חיץ שומנים באיטיות, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. במהלך הדגירה, הכינו את חיץ BSA כפי שצוין בכתב היד של הטקסט.לאחר מכן לאחר 30 דקות של ריפוי, לשטוף את תא הזרימה עם 2.5 מיליליטר של חיץ BSA מצד הפלט. לאחר מכן, להזריק 800 microliters של חיץ streptavidin לתוך תא הזרימה מצד הקלט בשני שלבים עם דגירה של 10 דקות לאחר כל צעד. לאחר מכן לשטוף את תא הזרימה עם 2.5 מיליליטר של חיץ BSA כדי להסיר את כל מולקולות streptavidin חינם.לאחר מכן, דללו את הדנ"א של ביוטין למבדה עם מוטיבים משובטים באמצעות חיץ BSA והזריקו אותו ארבע פעמים באיטיות במרווחים של חמש דקות. במהלך ההזרקה, הפעל את המיקרוסקופ במערכת המוליכים למחצה המדעית המשלים של תחמוצת המתכת. לאחר מכן שטפו את הצינורות עם 10 מיליליטר מים מזוקקים כפולים ושטפו את המנסרה ואת מחבר הצינורות במים, 2% מנקה קובט נוזלי ו-99% אתנול.לאחר מכן, לשאוב לפחות 20 מיליליטר של מאגר הדמיה לתוך מזרק 30 מיליליטר. הניחו את תא הזרימה על במת המיקרוסקופ וחברו אותו למערכת המיקרופלואידית. באמצעות קצב זרימה של 0.03 מיליליטר לדקה, לשטוף את מולקולות הדנ"א למחסום במשך 10 דקות.לאחר מכן לכבות את המערכת microfluidic לדגור במשך 30 דקות. כאשר הזרימה נעצרת, ומאפשרת לדנ"א להתפזר לרוחב. כדי לדמות את היווצרות העיבוי EWS-FLI1 על וילונות DNA, פתח את תוכנת ההדמיה ומצא וסמן את מיקומן של תשע תבניות הזיגזג תחת שדה בהיר.לאחר מכן הפעל את הזרימה ב 0.2 מיליליטר לדקה כדי להכתים את הדנ"א עם צבע DNA דו-גדילי במשך 10 דקות. לאחר מכן, דללו את החלבון mCherry EWS-FLI1 עם מאגר ההדמיה בריכוז של 100 ננומולים ב-100 מיקרוליטרים. לאחר מכן טען את דגימת החלבון דרך השסתום עם מזרק זכוכית של 100 מיקרוליטר ושנה את קצב הזרימה ל -0.4 מיליליטר לדקה.לאחר הפעלת הלייזר בגודל 488 ננומטר יש לסרוק מראש כל אזור כדי לבדוק את מצב התפלגות הדנ"א ולבחור את האזור שבו מולקולות הדנ"א מתפזרות באופן שווה. לאחר מכן הגדר את עוצמת הלייזר ל-10% עבור הלייזר של 488 ננומטר ו-20% עבור הלייזר של 561 ננומטר. ובאמצעות מד הכוח, למדוד את כוח הלייזר האמיתי ליד המנסרה.התחל להשיג תמונות במרווחים של שתי שניות עם לייזרים של 488 ו- 561 ננומטר בו-זמנית. לאחר מכן שנה את השסתום ממצב ידני למצב הזרקה כדי לאפשר למאגר ההדמיה לשטוף את דגימת החלבון לתוך תא הזרימה לאחר 60 שניות. כדי להסיר את ה-EWS-FLI1 החופשי, המשיכו לשטוף את תא הזרימה עם מאגר ההדמיה למשך חמש דקות כאשר רק הלייזר בגודל 561 ננומטר מופעל.ואז לעצור את הזרימה לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, הפעל את הזרימה במהירות של 0.4 מיליליטר לדקה כדי לאפשר לדנ"א להתרחב ולרכוש תמונות במרווחים של שתי שניות בין מסגרות שונות כדי לקבל נתוני תפוקה גבוהים של היווצרות עיבוי EWS-FLI1. מולקולות EWS-FLI1 הודגמו על ידי זיהוי אותות EWS-FLI1 המסומנים ב-mCherry שהתקבלו באמצעות לייזר בגודל 561 ננומטר.ניתן להמחיש ישירות את היווצרות המבחנה של עיבוי EWS-FLI1 באתר של 25 חזרות GGAA במצע הדנ"א. הספציפיות של mCherry EWS-FLI1 המשמשת בווילונות דנ"א אושרה על ידי בדיקת תזוזת ניידות אלקטרופורטית באמצעות תבנית דנ"א עם ובלי 25 GGAA חוזר בנפרד. כאשר ריכוז ה-EWS-FLI1 עלה מ-20 ל-500 ננומולים, עוצמת ה-EWS-FLI1 עלתה באופן דרמטי.בעוד שהשינוי בעוצמת ה-DBD האחת של FLI היה זניח כאשר החלבונים היו רוויים כדי לכסות את ה-GGAA חוזר, מה שמרמז על כך ש-EWS-FLI1 יצר עיבוי על הדנ"א. ההזרקה צריכה להיות איטית ורכה מאוד, כך שהליפוזום והדנ"א יוכלו להתפזר באופן שווה על תא הזרימה. חשוב לבצע MSA כדי לאשר שגורם שעתוק מטוהר נקשר באופן ספציפי לרצף היעד במבחנה.טכניקה זו מאפשרת לאנשים לחקור אם העיבוי יקל על חיפוש היעד של גורמי שעתוק, והשפעתו על שעתוק.

single-molecule-imaging-of-ews-fli1-condensates-assembling-on-dna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מציגים שילוב רומן רב עוצמה של nanophotonics (QD-סריג) ו מיקרופלואידיקה לחקור את היווצרות polyplexes polyelectrolyte, אשר צפוי לספק שליטה טובה יותר וסינתזה של polyplexes אחיד להתאמה אישית עבור חומצה מבוססי גרעין עתיד הרפוי.

שילוב QD-סריג ו מיקרופלואידיקה לפקח Nanocomplex DNA הרכבה עצמית בזמן אמת

סרטון וידאו זה מתאר שיטה להמחשת הרכבה של חלבון היתוך מעובה על מולקולות DNA באתרים ספציפיים באמצעות הדמיה של מולקולה יחידה. עיבויים אלה נוצרים כתוצאה מאינטראקציות LCD-LCD ו-LCD-DBD, המאפשרות גיוס של RNA פולימראז II ושעתוק גנים משופר.

הדמיה של מולקולה בודדת להדמיית חלבון היתוך מעבה הרכבה על וילונות DNA

כאן אנו מתארים את המכשור ושיטות לגילוי מולקולות חלבון בודד fluorescently שכותרתו אינטראקציה עם מולקולת DNA חד התלויה בין שני microspheres הלכוד אופטי.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

מחקר זה מציג הליך ניסיון מפורט כדי למדוד דינמיקת לולאות של גדילי הדנ"א כפול באמצעות פלואורסצנטי התהודה העברת אנרגיה מולקולה בודדת (סריג). הפרוטוקול מתאר גם כיצד לחלץ את צפיפות הסתברות הלולאה נקראת גורם J.

לימוד ה-DNA Looping ידי סריג Single-מולקולה

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

ביוכימיה חזותית של מולקולה בודדת הנחקרת באמצעות תאים מיקרופלואידיים מקלה מאוד באמצעות קנה זכוכית, מזרקים אטומים לגז, חיבורים יציבים של צינורות לתאי זרימה, וחיסול בועות על ידי הצבת שסתומי מיתוג בין המזרקים והצינורות. הפרוטוקול מתאר מלכודות אופטיות כפולות המאפשרות הדמיה של עסקאות דנ"א ואינטראקציות בין-מולקולריות.

שימוש בפינצטה אופטית כפולה ומיקרופלואידיקה למחקרי מולקולות בודדות

מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

מאמר זה מציג הליך ניסויי מפורט לבנייה מחדש של קשירי דנ"א המכילים נוקלאוזומים עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוא מתאר גם מספר ניסויים במורד הזרם שניתן לבצע כדי להמחיש את התנהגות הקישור של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם כרומטין, ולנתח שינויים בתכונות הפיזיקליות של נוקלאוזומים.

מכלול נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

חקור את מנגנוני ההתקבצות של EWS-FLI1 על DNA בזמן אמת באמצעות שיטת DNA Curtains. מחקר זה חושף את הקשר בין מוטיבי DNA ליצירת קונדנסטים בסרטן Ewing ומספק כלי לחקר גורמי שעתוק נוספים כמו P53 ו-MED1.

הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA

גלה סרטונים נוספים