Name: מערכת אקספלנט למחקרי הדמיה בהילוך מהיר של מכלול מעגלי חוש הריח בדרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: למד הדמיה בזמן אמת של הרכבת מעגל חוש הריח ב-Drosophila ברמת האקסון הבודד. שיטה זו מאפשרת לחקור את הבסיס התאי-ביולוגי של התפתחות המעגל העצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לנ 'אוזל ור' היסינגר על עצתם לגבי תרבות ההסבר; מ. וגנר על העזרה הטכנית של המיקרוסקופיה הדו-פוטונית; D.J. Luginbuhl ליצירת זבובים מהונדסים; ד. פרידמן להצעות לניתוח תוכנה של פיג'י; י. גה לסיוע בעבודה בטיסה; ק. מקלפלין וק.ק.ל. וונג להערות על כתב היד. ל.ל. הוא חוקר במכון הרפואי ע"ש הווארד יוז. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות 1K99DC01883001 (ל- T.L.) ו- R01-DC005982 (ל- L.L.).

1. הכנת ריאגנטים
הערה: כל השלבים בפרוטוקול זה מתבצעים בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס) אלא אם כן הוסבר אחרת.
<ol><li>כדי להכין את צלחת התרבית לשתוק האקספלנט במהלך הדמיית קיטועי הזמן, הניחו את סילגארד בעובי 0.5 ס"מ (ערבבו היטב שני רכיבים נוזליים ביחס של 10:1 לפני השימוש) על המשטח התחתון של צלחת פטרי בגודל 60 מ"מ x 15 מ"מ ותנו לו לרפא למשך 48 שעות בטמפרטורת החדר (איור 2A, המכונה צלחת סילגארד בטקסט הבא).</li>
	<li>כדי להכין מיקרו-פינים לשיתוק אקספלנט על צלחת זו, השתמשו בזוג מלקחיים כדי להדביק מספר פינים זעירים על סרט הדבקה כאשר הקצוות החדים מיושרים בצד אחד (איור 2B). השתמשו בזוג מספריים כדי לחתוך כ-2 מ"מ מהקצוות החדים של פיני המיקרו (איור 2B'). השתמשו במלקחיים כדי להחזיק את סיכות המיקרו החתוכים ולהחדיר לשכבת סילגארד של צלחת סילגארד מוכנה מראש (איור 2C). שני פינים זעירים משמשים לשתוק אקספלנט אחד.</li>
	<li>השתמש במברשת כדי לאסוף גלמים לבנים, היוצרים puparium תוך שעה אחת, של hsFLP, חלוקי נחל-GAL4/+; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 גנוטיפ ולהעביר אותם לבקבוקונים חדשים. הלם חום באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות כדי לגרום לשיבוטי ORN דלילים מסוגים אקראיים. לאחר הלם חום, שים את הבקבוקונים על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 שעות, וכתוצאה מכך הגלמים הזדקנו ב -30 שעות לאחר היווצרות puparium (APF).</li>
	<li>כדי להכין את מדיום התרבות לאקספלנט, הוסיפו 5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) ל-500 מ"ל מדיום דרוזופילה של שניידר. לסנן את המדיום ולעשות 45 מ"ל aliquots ב 50 מ"ל צינורות חרוטיים. ניתן לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 חודשים.</li>
	<li>ביום ההדמיה, קחו צינורית אחת של 45 מ"ל של מדיום דרוזופילה של שניידר והוסיפו 5 מ"ל של סרום בקר עוברי (10% v/v), 125 μL של תמיסת מלאי אינסולין אנושית של 4 מ"ג/מ"ל (ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל), 50 μL של תמיסת מלאי 1 מ"ג/מ"ל 20-הידרוקסיאקדיזון מומסת באתנול (ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל). מערבבים היטב ומעבירים 15 מ"ל של מדיום מלא לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. את שאר המדיום המלא ניתן לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע. סרום בקר עוברי, תמיסת מלאי אינסולין אנושי ותמיסת מלאי 20-hydroxyecdysone הם aliquoted ומאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>חמצן את המדיום המלא של 15 מ"ל על ידי שאיבת בועות חמצן מבלון חמצן מתחת לפני השטח הנוזליים דרך קצה פיפטה סטרילי של 5 מ"ל בקצב של בועה אחת לשנייה למשך 20-30 דקות. השתמש בסרט פרפין כדי לכסות את פתיחת הצינור במהלך תהליך זה.</li>
	<li>לעקר את משטח באר הנתיחה ואת לוחית סילגרד (עם מיקרו פינים מוכנסים על שכבת סילגארד, מוכנסים בשלבים A1 ו- A2) עם 70% אתנול. תנו להם להתייבש לפני השימוש.</li>
</ol>2. דיסקציה אקספלנט
<ol><li>השתמש במברשת כדי להעביר 30 שעות APF (30 שעות לאחר היווצרות puparium) גלמים לרקמת נייר ולייבש את המשטח החיצוני של הגלמים במשך 5 דקות.</li>
	<li>שים חתיכת סרט דו-צדדי על מגלשת זכוכית. חברו בזהירות את הגלמים המיובשים על המשטח הדביק של הסרט כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. לחצו בעדינות על הגלמים עם מברשת כדי לעזור לצד הגחון של הגלמים להתחבר היטב לקלטת (איור 3A). אין לפגוע בגולם.</li>
	<li>השתמשו בזוג מלקחיים כדי להסיר את נרתיק הפופל החום המכסה את הצד הגבי של הראש (איור 3A,B). הוסיפו קצה חד אחד של המלקחיים בין נרתיק הפופל החום לבין הגלם מהצד הצדדי ושברו בזהירות את נרתיק הפופל החום דרך קו לקצה האחורי של הגלם (איור 3B,C). פתחו את המארז החום של הפופל. השתמש בזוג מלקחיים כדי להחזיק בעדינות את הגלם ולהעביר את הנתיחה היטב עם 1 מ"ל של בינוני מלא מחומצן. הטביעו גלמים צפים על המשטח הבינוני כדי לעזור לו לשקוע לתחתית הבאר (איור 3D). הערה: אין להחדיר את קצה המלקחיים עמוק מדי לתוך נרתיק הפופל החום כדי למנוע פגיעה בגולם עם המלקחיים.</li>
	<li>כדי לנתח את האנטנה-מוח מתוך הגלם, השתמשו במלקחיים כדי להחזיק בעדינות את הגלם ביד אחת והשתמשו בזוג מיקרו-חתכים כדי לחתוך חור קטן מהצד האחורי של הגלם ביד השנייה (איור 3E). חור קטן זה משחרר את הלחץ הגבוה בתוך הגלם.</li>
	<li>חותכים דרך קו האמצע הגחוני של הגלם מהחור עד הצוואר (המבנה הצר שמחבר את הראש ובית החזה) עם המיקרו-חתכים (איור 3F). לאחר מכן, חתכו את היקף הצוואר כדי לנתק את הראש מגוף הגלם (איור 3G). מוציאים את הגוף ומניחים אותו בבאר אחרת. הערה: אין לחתוך את הצוואר ישירות מהצד הגבי/גחוני של הגלם, מה שעלול לסחוט את המוח.</li>
	<li>חותכים את הציפורן השקופה שמכסה את הצד הגבי של המוח (איור 3H). זה יחשוף את הגוף השמן על גבי המוח. שמור על כמה ציפורניים שאליהן הרשתית והאנטנות מתחברות. חזור על אותו הליך לצד הגחוני של המוח. הערה: אל תכניסו את הלהב של המספריים עמוק מדי מתחת לציפורן, שכן הדבר יגרום לניתוק עצבי האנטנה המחברים בין האנטנות למוח (איור 3H').</li>
	<li>השתמשו בפיפטה P10 כדי לשטוף בעדינות את הגוף השמן שמכסה את המוח ואת האנטנות על ידי צנרת המדיום לכיוון האזורים הפתוחים בצד הגבי והגחוני של הראש (איור 3I). הערה: היו עדינים מאוד בעת צנרת המדיום מכיוון שניתן לנתק את המוח בקלות מהציפורן. ודא שכל הגוף השמן מוסר במהלך שלב זה. התפתחות עצורה של אקסונים של ORN נצפתה כאשר הגוף השמן לא ניקה היטב, כנראה בגלל גישה לקויה לחמצן מהמדיום.</li>
	<li>כדי לחקור את האינטראקציה של אקסונים דו-צדדיים של ORN או אקסונים של ORN למיקוד דנדריט PN, נתקו עצב אנטנה אחד או שניים עם המיקרו-חתכים במהלך שלב זה8 (איור 3J). הניחו בזהירות את להבי המספריים בין הציפורן למוח וקטעו את עצבי האנטנה המעוניינים בכך.</li>
	<li>כדי להעביר את האקספלנט המנותח לצלחת סילגארד, הניחו טיפה של תווך מלא מחומצן (כ-200 μL) על פני השטח של סילגארד. מצפים את המשטח הפנימי של קצה פיפטה ברוחב 200 μL עם הגוף השמן מהגזע המנותח (שלב 1.6) על ידי צנרת הגוף השמן מספר פעמים, מה שמונע מהגולשים להדביק את קצה הפיפטה במהלך ההעברה. לאחר מכן, השתמשו בקצה הפיפטה הרחב הזה כדי להעביר את האקספלנט מהניתוח היטב לטיפה הבינונית שעל צלחת התרבית (איור 3K).</li>
	<li>השתמשו במלקחיים כדי להצמיד את האקספלנט לשכבת סילגארד בשתי האונות האופטיות (איור 3L). מקם בזהירות את צלחת Sylgard על תחנת ההדמיה ושיתק את הצלחת עם קלטות. לאט לאט מוסיפים 10 מ"ל של מדיום מלא מחומצן לצלחת Sylgard באמצעות P1000 pipette. הערה: הימנעו משיבוש האקספלנט בעת הוספת המדיום לצלחת Sylgard.</li>
</ol>3. הדמיה חיה מבוססת מיקרוסקופיית שני פוטונים
<ol><li>כדי לבצע הדמיה בהילוך מהיר, השתמש במיקרוסקופ בעל שני פוטונים, לייזר Ti:Sapphire, מטרת טבילת מים פי 20 (1.0 NA) ותוכנת הדמיה. השתמש באורך הגל של העירור ב- 920 ננומטר להדמיית חלבוני GFP. התאם את זמן השהייה של הפיקסל ל- 10 μs.</li>
	<li>התאם את מיקום תחנת ההדמיה כך שהמוציאים יהיו בערך תחת המטרה. השתמשו ב-70% אתנול כדי לעקר את העדשה לפני ההדמיה. לאט לאט הנמיכו את המטרה מתחת למדיום הקרוב למוציאים. בדוק אם יש בועה כלשהי על העדשה של האובייקטיבי.<ol>
<li>אם כן, הרם את המטרה מעל המדיום וחזור על כך עד שהבועה נעלמת. מצאו את הגולשים באמצעות העינית והמרכז אחד בשדה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להבטיח אקספלנט עם כמה ORNs המסומנים בדלילות להדמיית קיטועי זמן, נתחו ~10 explants בכל פעם והתיישרו על ציר y בלוח התרבית. מסננים את כל האקסלנטים על ידי הזזת המטרה לאורך ציר y ובוחרים אקספלנט שבו כמה אקסונים בודדים של ORN הגיעו זה עתה לאונת האנטנה להדמיה (איור 4A).<ol>
<li>זהה את אונת האנטנה לפי צורתה הסגלגלה ואת האקסונים של ORN שמתחילים להקיף אותה. דמיינו אזור של כ-150 מיקרומטר x 150 מיקרומטר במישור xy (זום של 3x עם המטרה של 20x). להעריך את הגבול של שתי אונות האנטנה ולרכז אותן באזור ההדמיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר אזור הדמיה ראשוני לאורך ציר z על-ידי הגדרת החלק התחתון והחלק העליון של הסריקה. הגדר אזור הדמיה לאורך ציר z. הגדר את הקטע העמוק ביותר עם אותות האקסון של ORN כהפעלה הראשונה של ההדמיה ואת ההפעלה 100 מיקרומטר למעלה (הצד השטחי יותר) כפגישת ההדמיה האחרונה (איור 4B). הערה: פעולה זו משאירה חלקים מסוימים בצד העליון (השטחי) של אקסוני ORN ומונעת תזוזה של אקסוני ORN כלפי מעלה מחוץ לאזור ההדמיה עקב צמיחת המוח במהלך התרבית.<ol>
<li>תמונה במרווחים של 2 מיקרומטר. הגדר סריקת הדמיה אוטומטית בתדר של כל 20 דקות באמצעות תוכנת הדמיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הזיזו את אזור ההדמיה 20 μm כלפי מעלה לאורך ציר z לאחר ההדמיה הראשונה של 4 שעות ועוד 20 μm כלפי מעלה לאורך ציר z לאחר הדמיה של 16 שעות. ניתן להשיג זאת על ידי הגדרת סקריפט וערימות z שונות בתוכנת ההדמיה.</li>
	<li>תרבית את האקספלנט לתקופה נוספת לאחר ההדמיה (עד 24 שעות ex vivo) לפני קיבוע וכתם עם N-cadherin, סמן נוירופיל, כדי לחשוף את הזהות הגנטית של כל ORN בודד על ידי הגלומרולוס שאליו הוא מכוון.</li>
</ol>4. עיבוד תמונה
<ol><li>כדי לעבד תמונות z stack מסדרות מקטעים שצולמו בכל נקודת זמן באמצעות תוכנת פיג'י, פתח את סדרת מקטעי התמונות, לחץ על תמונה | ערימות | פרויקט Z [/].</li>
	<li>כדי לתקן סחף רוחבי של המדגם במהלך התרבית, התקן את תוסף TurboReg בפיג'י.<ol>
<li>פתח סדרת תמונות של מחסנית z ותמונת מחסנית z בודדת מהסדרה. פתח את | התוספים | הרשמה טורבו-רג.</li>
		<li>בחר את סדרת התמונות z stack במקור ואת תמונת מחסנית z הבודדת ב- Target | תרגום. לחץ על לחצן אצווה כדי לרשום את כל התמונות מסדרת התמונות z stack שנפתחה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי למקסם את התועלת של דוגמאות עם תמונה, הפרד אקסונים בודדים המסומנים בדלילות בסביבה זה לזה מתמונות z stack לאחר מקטעי תמונה תלת-ממדיים.<ol>
<li>כדי לחלץ אקסונים בודדים של ORN מכמה אקסונים באותה תמונה, פתח את סדרת מקטעי התמונות, לחץ על תוספים | | סגמנטציה עורך סגמנטציה [/]. בחר את כלי המברשת ואת המסיכה המעוניינת ב- ORN axon בחלון העבודה של עורך הסגמנטציה באמצעות הלחצנים בחר "+" או "-" בכל מקטע תמונה.</li>
		<li>לחץ על תהליך | מחשבון תמונה [/]. בחר "תמונה X" בתמונה 1, "הכפל" בפעולה, "תמונה X. תוויות" בתמונה 2, [/]. פעולה זו יוצרת קובץ סדרת תמונות חדש עם האקסון המעוניין בלבד. בצע את שלב 4.1 כדי לעבד את תמונת מחסנית z. חזור על שלב זה עבור כל נקודות הזמן כדי ליצור קובץ תמונה מסדרת זמן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לפסבדו-צבע אקסונים שונים מאותה תמונה, תחילה בצע את שלב 4.3 כדי ליצור את קובץ התמונה של סדרת הזמן של כל אקסון בנפרד. פתח את קבצי התמונה של סדרת הזמן עבור אקסונים בודדים שונים מאותה תמונת נתונים גולמית. לחץ על תמונה | | צבע מיזוג ערוצים. בחר קבצי תמונה שונים מסדרות זמן בערוצי צבעים שונים ולחץ על אישור.</li>
</ol>

<ol><li>Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+molecules+of+neuronal+wiring%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).</li>
<li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+smell+and+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of smell and taste in Drosophila.</a> Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).</li>
<li>Hong, W., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+wiring+specificity+in+the+fly+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system.</a> Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).</li>
<li>Bentley, D., Caudy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneer+axons+lose+directed+growth+after+selective+killing+of+guidepost+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells.</a> Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).</li>
<li>Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+axon+divergence+in+the+optic+chiasm%3A+dynamics+of+growth+cone+behavior+at+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline.</a> Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).</li>
<li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+axons+with+and+without+their+somata%2C+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos%3A+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li>
<li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, 10721(2015).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+olfactory+circuit+assembly+revealed+by+systematic+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging.</a> Cell. 184, 5107-5121 (2021).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>Liu, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+the+cell+in+its+native+state%3A+Imaging+subcellular+dynamics+in+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms.</a> Science. 360 (6386), (2018).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+adaptive+optical+recovery+of+optimal+resolution+over+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes.</a> Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).</li>
<li>Kohl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+tissue+staining+with+chemical+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Ultrafast tissue staining with chemical tags.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).</li>
<li>Sutcliffe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-Generation+Drosophila+Chemical+Tags%3A+Sensitivity%2C+Versatility%2C+and+Speed%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed.</a> Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).</li>
<li>Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Janelia+Fluor+HaloTag+and+SNAP-Tag+Ligands+and+Their+Use+in+Cellular+Imaging+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments.</a> Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

האקספלנט המוחי של אנטנות Drosophila שומר על מיקוד תקין של מעגל חוש הריח. שמנו לב שההתפתחות איטית פי 2 ב-ex vivo בהשוואה ל-in vivo. צוין כי מערכת ההסבר אינה שומרת על מישוש מקסילרי, המארח שישה סוגים של ORNs. כדי להבטיח שהתפתחות תקינה תחזור על עצמה ex vivo, יש להימנע ממתיחה של עצבי האנטנה במהלך כריתת אקספלנט. במהלך תרבית ex vivo גידול חיידקים בדרך כלל גורם להתפתחות עצורה של מעגל חוש הריח. לכן, יש חשיבות לעיקור יסודי של תבשיל התרבית והסיכות לפני ההדמיה ושמירה על חדר ההדמיה נקי ומב...

נוירונים מחוברים זה לזה במדויק כדי ליצור מעגלים החיוניים לתפקוד תקין של המוח. במשך יותר מ-100 שנה, מדעני מוח מנסים להבין כיצד נויריטים מתרחבים לעבר המטרות הבינוניות והסופיות שלהם בדיוק רב. כתוצאה מכך, הם זיהו גנים חשובים המקודדים רמזי הנחיה לפיתוח תהליכים עצביים1. מערכת חוש הריח Drosophila מספקת מודל מצוין לחקר התהליך הזה, שכן נוירונים של קולטני חוש הריח (ORNs, הנוירונים החושיים העיקריים) מקרינים 50 גלומרולי הניתנים לזיהוי עם גודל, צורה ומיקום יחסי סטריאוטיפיים, שם הם יוצרים קשרים סינפטיים עם דנדריטים מ-50 סוגים של נוירוני הקרנה מסדר שני (PNs), שכל אחד מהם שולח דנדריטים לאחד מ-50 הגלומרולי2 (איור 1A ). לכן, קל יחסית לזהות פנוטיפים מוטנטיים ברזולוציה סינפטית (גלומרולרית) במערכת חוש הריח הזבובית. זה הוביל לתגליות של גנים חשובים המווסתים את הרכבת מעגלי חוש הריח3.
ההרכבה של מעגל חוש הריח הזבובי מסתמכת על תהליכים התפתחותיים מתואמים זמנית ומרחבית3. ORNs ו- PNs רוכשים גורלות תאים מובחנים, אשר מגדירים את התוכנית עבור ספציפיות החיווט שלהם. לאחר מכן, דנדריטים של PN מקדימים את אונת האנטנה (איור 1B). לאחר מכן, האקסונים של ה-ORNs מקיפים את אונת האנטנה האיפסילטרלית וחוצים את קו האמצע של המוח כדי להגיע לאונת האנטנה הקונטרה-צדדית. לאחר מכן, אקסונים של ORN פולשים הן לאונות אנטנה ipsi והן לאונות אנטנה קונטרלטרליות ויוצרים סינפסות עם דנדריטים של PNs השותפים שלהם בגלומרולי ספציפי. מודל גס זה להרכבת מעגלי חוש הריח הוצע על סמך אפיון דגימות קבועות מנקודות זמן ביניים במהלך הפיתוח. הרזולוציה הטמפורלית הירודה וחוסר היכולת לעקוב אחר אותם תהליכים עצביים לאורך ההתפתחות מרקמה קבועה מגבילים את ההבנה המכניסטית של תהליך הרכבת המעגלים.
זה מאתגר מבחינה טכנית לצלם בשידור חי תהליכי ORN ו- PN in vivo מכיוון שתהליך החיווט מתרחש במחצית הראשונה של שלב הפופל כאשר אונת האנטנה מוקפת בגוף שומן אטום בתוך מארז הפופל. לכן, אי אפשר לדמות ישירות את מעגל חוש הריח המתפתח מגלמים שלמים. רקמות מנותחות בתרבית ex vivo יכולות לעקוף את אטימות הרקמות ושימשו בהצלחה לחקר ההתפתחות העצבית 4,5,6. האתגר של שימוש באסטרטגיה דומה של תרבית ex vivo explant כדי לחקור חיווט עצבי במוח הפופל הוא האם הוא משחזר את מיקוד הנוירונים המדויק במצב תרבית. בהתבסס על מצב תרבית ex vivo שדווח בעבר עבור קומפלקס העין-מוח זבוב7, פותח לאחרונה אקספלנט המכיל את כל המוח הפופלי, האנטנות ועצבי האנטנה המחברים ללא פגע, אשר שומר על מיקוד מדויק של מעגל חוש הריח וניתן להכפיף אותו להדמיה חיה מבוססת מיקרוסקופיית שני פוטונים למשך עד 24 שעות בתדר של כל 20 דקות8 . כאן מתואר פרוטוקול מפורט של תרבות ההסבר וההדמיה. מערכת ההסבר מספקת שיטה רבת עוצמה לחקר הרכבה של מעגלי חוש הריח ואולי גם מעגלים אחרים במוח המרכזי.

<table><tbody><tr><td>20-hydroxyecdysone</td><td>Sigma</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>זיקית Ti: לייזר</td><td>ספיר קוהרנטי</td><td>קוהרנטי MRU X1</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו פישר 10082147</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אינסולין אנושי</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>הדמיה תוכנה</td><td>ערבה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו מספריים</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>צילינדר חמצן</td><td>Praxair</td><td>OX M-E</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>שניידר' s Drosophila Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 סיליקון אלסטומר</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה דו-פוטונית</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מים לטבול מטרה (20X)</td><td>Zeiss</td><td>421452-9800-000</td><td></td></tr></tbody></table>

מערכת אקספלנט למחקרי הדמיה בהילוך מהיר של מכלול מעגלי חוש הריח בדרוזופילה

An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila

~נוירונים מחוברים זה לזה במדויק כדי ליצור מעגלים החיוניים לתפקוד תקין של המוח. מערכת חוש הריח Drosophila מספקת מודל מצוין לחקור את התהליך הזה מכיוון ש-50 סוגים של נוירונים של קולטני חוש הריח (ORNs) מהאנטנות והפלפים המקסילריים מקרינים את האקסונים שלהם ל-50 גלומרולי הניתנים לזיהוי באונה האנטנה ויוצרים קשרים סינפטיים עם דנדריטים מ-50 סוגים של נוירוני הקרנה מסדר שני (PNs). מחקרים קודמים התמקדו בעיקר בזיהוי מולקולות חשובות המווסתות את המיקוד המדויק במעגל חוש הריח באמצעות רקמות קבועות. כאן מתוארת מערכת הסברים של אנטנה-מוח המשחזרת אבני דרך התפתחותיות מרכזיות של הרכבת מעגלי חוש הריח בתרבית. באמצעות ניתוח הקוטיקולה החיצונית וניקוי גופי שומן אטומים המכסים את המוח הפופל המתפתח, ניתן לאסוף תמונות באיכות גבוהה של נוירונים בודדים ממוחות חיים באמצעות מיקרוסקופיה של שני פוטונים. זה מאפשר הדמיה בהילוך מהיר של מיקוד אקסון ORN יחיד מרקמה חיה. גישה זו תסייע לחשוף הקשרים ותפקודים ביולוגיים חשובים של תאים של גנים חשובים שזוהו בעבר ולזהות מנגנונים העומדים בבסיס התהליך הדינמי של הרכבת מעגלים.

אקסונים של ORN מגיעים לאונת האנטנה בין 18 שעות ל-36 שעות APF. לאחר מכן הם מנווטים את אונת האנטנה, חוצים את קו האמצע ומעצימים את הגלומרולי. סרטון 1 הוא סרטון מייצג המציג את כל התהליך עבור מספר אקסונים הניתנים לזיהוי בנפרד, שצולמו בתדירות של כל 20 דקות במשך 24 שעות. לפני ההרשמה באמצעות TurboReg, האקסונים מפגינים סחף רוחבי מסוים ככל שהמוח מתפתח (המחצית הראשונה של הסרטון). לאחר ההרשמה, הסחיפה מתוקנת (המחצית השנייה של הסרטון).
כדי להפריד בין כמה אקסונים של ORN לבין אותו אקספלנט, מו...

פרוטוקול זה מתאר את הליך הנתיחה, מצב התרבית וההדמיה החיה של מערכת אקספלנט של אנטנות-מוח לצורך חקר מכלול מעגלי חוש הריח.

~Neurons are precisely interconnected to form circuits essential for the proper function of the brain. The Drosophila olfactory system provides an ...

פרוטוקול זה מציג שיטה לתמונה חיה, להעיף מכלול מעגלי חוש הריח ברמת אקסון יחיד ממוח מתפתח. דיסקציה כדי לנקות את הרקמה המכסה את המוח המתפתח, אנו יכולים לאסוף תמונות באיכות גבוהה מהמוח הפנימי. שיטה זו מספקת תובנות חשובות על הבסיס הביולוגי של התא של פיתוח מעגלים.זה יכול להיות שונה בקלות כדי ללמוד את הפיתוח של מעגלים אחרים גם כן. לוקח זמן עד שאדם מבצע שליטה ידנית יציבה במיקרו-דיסקציה. תרגול נוסף יעזור.כדי להתחיל, הכינו את צלחת התרבית לגיוס האקספלנט במהלך הדמיה בהילוך מהיר על ידי הנחת סילגארד בעובי 0.5 ס"מ על המשטח התחתון של צלחת פטרי ותנו לו לרפא במשך 48 שעות בטמפרטורת החדר. כדי להכין פיני מיקרו לשתוק האקספלנט על לוח זה באמצעות מלקחיים, הדביקו מספר פינים זעירים על סרט הדבקה כאשר הקצוות החדים מיושרים בצד אחד וחתכו שני מילימטרים של קצוות חדים במספריים. לאחר מכן באמצעות המלקחיים, הכנס את סיכות המיקרו החתוכים לשכבת סילגארד של צלחת סילגארד מוכנה מראש.באמצעות מברשת, לאסוף גלמים לבנים, אשר יוצרים puparium בתוך שעה ולהעביר אותם בקבוקון חדש. דגירה של הגלמים באמבט המים הממוזגים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות כדי לגרום לשיבוטי ORN דלילים מסוגים אקראיים. לאחר הלם חום, מניחים את הבקבוקון על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 שעות וכתוצאה מכך הגלמים מזדקנים 30 שעות לאחר היווצרות הגוריום.לאחר מכן הכינו את מדיום התרבות לאקספלנט כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס. ביום ההדמיה, הוסיפו סרום בקר עוברי, תמיסת מלאי אינסולין אנושית ו-20 תמיסת ציר הידרוקסיאקדיסון מתמוססת באתנול לבקבוקון 50 מיליליטר המכיל 45 מיליליטרים של מדיום דרוזופילה של שניידר. מערבבים היטב ומעבירים 15 מיליליטרים של המדיום המלא לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר ומאחסנים את שאר המדיום המלא בארבע מעלות צלזיוס למשך שבוע.לאחר מכן מכסים את פתח הצינורות המכילים מדיום מלא עם סרט פרפין ומחמצנים את המדיום על ידי שאיבת בועות חמצן מתחת לפני השטח הנוזליים דרך קצה פיפטה סטרילי של חמישה מיליליטר בקצב של בועה אחת לשנייה למשך 20 עד 30 דקות. לאחר מכן, לעקר את משטח באר הנתיחה והוכן בעבר צלחת Sylgard עם 70% אתנול ולתת להם להתייבש לפני השימוש. השתמש במברשת כדי להעביר 30 שעות גולם APF לנייר טישו לייבוש המשטח החיצוני של הגלם במשך חמש דקות.לאחר מריחת סרט דו-צדדי על מגלשת זכוכית, חיבר בזהירות את הגלם המיובש למשטח הדביק של הסרט כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. לחץ בעדינות על הגלם עם מברשת כדי לחבר כראוי את הצד הגחוני לסרט מבלי לפגוע בגולם. מכניסים קצה חד אחד של המלקחיים בין נרתיק הפופל החום לגולם מהצד הצדדי ושוברים בזהירות את נרתיק הפופל החום דרך קו לקצה האחורי של הגלם.לאחר פתיחת מארז הפופל החום, באמצעות המלקחיים, החזיקו בעדינות את הגלם והעבירו אותו לבאר הנתיחה המכילה מיליליטר אחד של מדיום מלא מחומצן. הטביעו את הגלם במדיום להטבעתו לתחתית הבאר. כדי לנתח את מוח האנטנה מהגלמים, החזיקו בעדינות את הגלם באמצעות מלקחיים ביד אחת ובאמצעות זוג מיקרו-חתכים, צרו חור קטן מהצד האחורי של הגלם, אשר משחרר לחץ גבוה בתוך הגלם.החל מהחור, חתכו דרך קו האמצע הגחוני עד הצוואר, ואז חתכו את היקף הצוואר כדי לנתק את הראש מגוף הגלם ולהניח את הגוף בבאר אחרת. לאחר מכן, חותכים את הציפורן השקופה המכסה את הצד הגבי של המוח כדי לחשוף את הגוף השמן על גבי המוח, ומבטיחים לשמור על הציפורן שאליה מתחברות הרשתית והאנטנה ובאופן דומה, לחתוך את הציפורן מהצד הגחוני של המוח. פיפטה את המדיום לכיוון האזורים הפתוחים בצד הגבי והגחוני של הראש באמצעות פיפטה P10 כדי לשטוף בעדינות את הגוף השמן המכסה את המוח והאנטנה.כדי לחקור את האינטראקציה של אקסונים דו-צדדיים של ORN או אקסונים של ORN למיקוד דנדריט PN, נתקו את עצב האנטנה במהלך השלב על ידי הצבת הלהבים של המיקרו-חתכים בין הציפורן למוח וניתוק עצב האנטנה המעוניין. להעברת האקספלנט המנותח לצלחת סילגארד, הניחו כ-200 טיפות מיקרוליטרים של המדיום המלא המחומצן על פני השטח של סילגארד. פיפטה הגוף השמן נגזר מהגזע המנותח מספר פעמים דרך קצה פיפטה 200 מיקרוליטר לציפוי המשטח הפנימי כדי למנוע מהמוציאים להידבק לקצה הפיפטה במהלך ההעברה מבאר הנתיחה אל הטיפה הבינונית שעל צלחת סילגארד.השתמשו במלקחיים כדי להצמיד את האקספלנט לשכבת סילגארד בשתי האונות האופטיות, ואז מיקמו בזהירות את לוחית סילגארד על תחנת ההדמיה, שיתקו את הצלחת בקלטות, והוסיפו באיטיות 10 מיליליטרים של המדיום המלא המחומצן לצלחת סילגארד באמצעות פיפטה P1000. האקסונים של ORN מגיעים לאונת האנטנה בין 18 שעות ל-36 שעות APF ואז מנווטים באונה האנטנה, חוצים את קו האמצע ומחדשים את הגלומרולי. לפני הרישום, האקסונים הפגינו סחף רוחבי מסוים ככל שהמוח התפתח, ולאחר הרישום, הסחף תוקן.הזהויות הגלומרולריות של האקסונים של ORN שחולצו נחשפו על ידי חיסון של סמן נוירופיל וקדהרין. על ידי השוואה למפת האונה הפנימית, ניתן היה לקבוע את זהותו של כל גלומרולוס. במהלך תרבית ex vivo, צמיחת חיידקים גורמת בדרך כלל להתפתחות נחה של מעגל חוש הריח.לכן, יש צורך לעקר ביסודיות את המנה התרבותית והסיכות לפני ההדמיה ולשמור על חדר ההדמיה נקי ומבודד. להשגת רזולוציה טמפורלית מרחבית גבוהה יותר, ניתן לצלם את מערכת ההסבר הזו באמצעות מיקרוסקופ מתקדם יותר, מיקרוסקופ אור הסריג של האופטיקה האדפטיבית. אף על פי שהתפתחות מעגלי מפעל הוצגה כאן כדוגמה, ניתן להרחיב מערכת זו למחקרים של מעגלים אחרים ותהליכי התפתחות במוח המרכזי המתפתח.

an-explant-system-for-time-lapse-imaging-studies-olfactory-circuit

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Mesoscopic הקרינה טומוגרפיה פועלת מעבר לגבולות חדירה של מיקרוסקופיה רקמות חתך פלואורסצנטי. הטכניקה מבוססת על תאורה השלכה רב ותיאור תחבורה פוטון. אנו להדגים ב-vivo כל הגוף 3D להדמיה של המורפוגנזה ה-GFP-לבטא דיסקים דמותי האגף...

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של...

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

סרטון זה מדגים את הנתיחה וההרכבה של צמחי מוח מזחלי דרוזופילה. מערכת העצבים המרכזית (CNS), המחוברת לדיסקי עיניים, מופקת מהזחלים ולאחר מכן מורכבת על מגלשת זכוכית בתמיסת מלח פיזיולוגית.

דיסקציה והרכבה של זחלי זבוב פירות צמחי מוח

מקור: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. הדמיית זמן-lapse של ארבוריזציה עצבית באמצעות תיוג דליל של וירוסים הקשורים לאדנו. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להמחיש דינמיקה דנדריטית בצמחי רשתית של עכבר חי. הוא מתאר את השלבים לייצוב הרשתית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, ביצוע הדמיה אפיפלואורסצנטית כדי לדמיין אינטרנוירונים אמקריניים של התפרצות כוכבים, ולכידת תמונות תלת מימד בהילוך מהיר כדי לנטר שינויים במורפולוגיה דנדריטית אמקרינית.

הדמיה קונפוקלית של דינמיקה דנדריטית עצבית באקספלנטים של רשתית עכבר

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

פרוטוקול זה מיועד הדמיה וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים ואת צמיחת רקמות בתוך הבטן הדרוזולה epithelia כמו זבוב הפרי עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן ניתנת להחלה על חקר שלבים, רקמות ומבנים תת-סלולאריים שונים בדרוזופילה או באורגניזמים אחרים במודל.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו מועסקים התמונה המרצפת הדנדריטי מאוד בהכנה חיה של המוח הזחל Drosophila ילה , ואת הפרוטוקול שפיתחנו לכמת זמן קפיצה 3d מערכות הדמיה עבור הערכות כמותית של דנדט דינמיקה בפיתוח נוירונים.

זמן פקיעה הדמיה חיה הקוונפיקציה של הענף הדנדריטים המהירה בפיתוח של דרוזופילה נוירונים

כאן אנו מציגים פרוטוקול שבו ניתן לדמיין את הסידן הטרום ו/או הפוסט-סינפטיות בהקשר של למידה וזיכרון של דרוזוהילה . בשנת הדמיה vivo סידן באמצעות synaptically חיישנים סידן מקומי משולב עם הפרדיגמה הקלאסית מיזוג ריח כגון הפלסטיות הסינפטית הבסיסית בבסיס סוג זה של למידה אסוציאטיבית עשוי להיקבע.

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

אנו מציגים פרוטוקולי הדמיית סידן עבור נוירון ריח של זחל דרוזופילה, באמצעות דבק רקמות מקומי לקיבוע. שיטה זו משפרת את היציבות, ומאפשרת ניסויים אמינים in vivo ו-ex-vivo. סקריפטים מותאמים אישית של R מנתחים אותות סידן, ומספקים פלטפורמה יעילה למחקר נוירופיזיולוגי מפורט.

הדמיית סידן in vivo ו-ex-vivo של נוירון במעגל הריח בזחל Drosophila melanogaster בכוכב השלישי

למד הדמיה בזמן אמת של הרכבת מעגל חוש הריח ב-Drosophila ברמת האקסון הבודד. שיטה זו מאפשרת לחקור את הבסיס התאי-ביולוגי של התפתחות המעגל העצבי.

מערכת אקספלנט למחקרי הדמיה בהילוך מהיר של מכלול מעגלי חוש הריח בדרוזופילה

גלה סרטונים נוספים