Name: דור אורגנויד במוח מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים במיני ביו-רהקטורים תוצרת בית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: למד לייצר אורגנואידים מוחיים מתאי גזע iPSCs באמצעות ביו-ריאקטורים מיני תוצרת בית. שיטה זו מאפשרת ייצור בקנה מידה גדול של רקמת מוח תלת-ממדית לחקר מחלות מערכת העצבים המרכזית ורפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק 075-15-2019-1669 ממשרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית (ניתוח RT-PCR) ועל ידי מענק מס '19-15-00425 מקרן המדע הרוסית (לכל עבודה אחרת). המחברים מודים גם לפאבל בליצ'קוב על עזרתו בעריכת הווידאו. דמויות בכתב היד נוצרו עם BioRender.com.

הערה: השתמש בטכניקה סטרילית לאורך הפרוטוקול, למעט שלבים 1.2 ו- 1.3. לחמם את כל מדיה תרבותית ופתרונות ל 37 °C (7 °F) לפני החלת על תאים או organoids. לטפח תאים באינקובטור CO2 ב 37 °C ב 5% CO2 על 80% לחות. ערכת הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
1. הפיכת מנות פטרי למיני ביו-ריאקטורים
<ol><li>לחתוך סטרילי 15 mL צינורות צנטריפוגות בטבעות של 7-8 מ"מ גובה; תבודד את הטבעות באופן אוטומטי.</li>
	<li>לשבור דבק נמוך, לא מטופל או מנות פטרי מיקרוביולוגיות לפירורים. ממיסים כ 1 גרם של פירורי פלסטיק ב 10 מ"ל של כלורופורם לילה כדי להכין פלסטיק נוזלי. זהירות: תעבדו במכסה המנוע.</li>
	<li>בדוק כי הפלסטיק הנוזלי המתקבל הוא צמיג מספיק עבור pipetting; הטיפה שלו שומרת על צורה כדורית ואינה מתפשטת על פני השטח. אם הוא נוזלי מאוד, מוסיפים עוד פירורי פלסטיק. אם הוא עבה, ואז להוסיף כלורופורם.</li>
	<li>הכינו ידית פלסטיק במרכז צלחת פטרי סטרילית אולטרה-נמוכה 6 ס"מ. ישנן שתי דרכים מתאימות באותה מידה, כמפורט להלן.<ol>
<li>שים את טבעת הפלסטיק autoclaved על המרכז ושחרר את הפלסטיק הנוזלי לחלק הפנימי של הטבעת.</li>
		<li>ללא טבעת פלסטיק, זרוק את הפלסטיק הנוזלי על מרכז צלחת פטרי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>משאירים את הכלים פתוחים במשך 2-3 שעות במכסה זרימה למינאר עד התייבשות מלאה. לטפל את הכלים היבשים עם קרינה אולטרה סגולה במשך 15-20 דקות.</li>
</ol>2. אינדוקציה של בידול עצבי של IPSCs
<ol><li>לטפח iPSCs במדיום עבור תאי גזע pluripotent עד 75-90% מפגש ב 35 מ"מ פטרי מנות מראש עם מטריצה המורכב חלבונים חוץ תאיים.</li>
	<li>הכן בינוני A-SR. ראה טבלה 1 לקבלת פרטים.</li>
	<li>שאפו את מדיום הטיפוח והוסיפו 2 מ"ל של מדיום A-SR ביום 0 של בידול.</li>
	<li>הכן בינוני A (ראה טבלה 2).</li>
	<li>לטפח תאים בינוני A במשך שבועיים בימים 2-14, מדיום מרענן במנות פטרי כל יומיים.</li>
</ol>3. היווצרות של כדורי מתאי הקדמה נוירו-אפיתל ביום 14
<ol><li>ביום ה-14, הכינו כדוריות מתאי מבשר נוירו-אפיתל באמצעות לוחית תרבית מיוחדת בת 24 בארות המכילה כ-1,200 מיקרווולים בכל באר(איור 2C). בצע את ההליך שניתן להלן. הערה: בשלב זה בידול, צלחת פטרי 35 מ"מ בדרך כלל מכיל 3 - 3.5 x 106 תאי מבשר נוירו-אפיטליאלי. לכן, צלחת פטרי אחת 35 מ"מ עם תאים מקדימים neuroepithelial מספיק עבור 3 - 4 בארות של צלחת תרבית 24-well עם microwells.</li>
	<li>הכן צלחת תרבית 24-well עם microwells: לכל באר, להוסיף 1 מ"ל של בינוני A. צנטריפוגה לזמן קצר ב 1,300 x g במשך 5 דקות רוטור דלי מתנדנד מצויד מחזיק צלחת. שליטה מתחת למיקרוסקופ שאין בועות במיקרווולים.</li>
	<li>הכן את ה- B הבינוני (טבלה 3).</li>
	<li>הסר את המדיום מצלחת פטרי עם תאים מקדימים neuroepithelial; לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של DMEM / F12. עבור ניתוק התא, לטפל בתאים עם 1.5 מ"ל של פתרון EDTA 0.48 mM מוכן PBS. שלוט בניתוק התא מתחת למיקרוסקופ.</li>
	<li>לקצור את התאים לתוך צינור 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של DMEM / F12 בצינור כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות. הסר את תאי supernatant ו resuspend ב 2 מ"ל של B בינוני.</li>
	<li>בדוק את ריכוז התא ואת הכדאיות על ידי טריפן כחול כתמים המוציטומטר. חשב את נפח ההשעיה הדרוש כדי להכיל 1 x 106 תאים קיימא בסך הכל.</li>
	<li>העבר את ההשעיה התא המכיל 1 x 106 תאים לתוך כל באר של צלחת 24-well עם microwells. הוסף B בינוני עד 2 מ"ל לתוך כל באר, בעדינות pipette תאים למעלה ולמטה מספר פעמים, וצנטריפוגה לזמן קצר 100 x g במשך 1 דקות כדי ללכוד תאים ב microwells. הערה: מספר התאים לבאר לא יעלה על 1 x 106. אחרת, כדורי ספירואידים ממיקרווולים שכנים מתמזגים.</li>
	<li>בדוק מתחת למיקרוסקופ שהתאים מופצים באופן שווה במיקרווולים. חזור על צנרת וצנטריפוגה אם התאים מופצים בצורה לא אחידה.</li>
	<li>לדגור את הצלחת בן לילה כדי לאפשר לתאים להצטבר בפרואידים.</li>
</ol>4. השגת וטיפוח של organoids
<ol><li>למחרת בבוקר (יום 15), לבדוק את איכות כדורי מתחת למיקרוסקופ. ודא שהם שקופים וחלקים, אם בריאים(איור 2A,B). בזהירות לאסוף את כדורי מכל באר לתוך צינור 15 מ"ל, להשאיר את כדורי לזרז על ידי כוח המשיכה במשך 2-3 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.</li>
	<li>מוסיפים לספרואידים 2 מ"ל של המטריצה שהופשרה באותו הזמן על קרח. מערבבים בעדינות על ידי צנרת ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.</li>
	<li>כדי לשטוף עודף של המטריצה, להוסיף לצינור 8 מ"ל של בינוני B. Pipette בעדינות, ולאחר מכן צנטריפוגה הצינור במשך 1 דקות ב 100 x גרם. הערה: אל תחרגו מהזמן והמהירות של צנטריפוגה כדי למנוע צבירה בלתי הפיכה של כדוריות.</li>
	<li>הסר את סופר-טבעי. מוסיפים לצינור 2 מ"ל של B בינוני, פיפטה בעדינות. לפצל את ההשעיה כדורית בין שני bioreactors מיני, כל אחד המכיל 4 מ"ל של בינוני B. מניחים את bioreactors מיני לתוך צלחת פטרי 15 ס"מ כדי למנוע אידוי של מים כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>שים את צלחת פטרי עם bioreactors מיני על שייקר מסלולית. לטפח את organoids בקצב סיבוב של 70-75 סל"ד.</li>
	<li>ביום ה -16, להכין בינוני C(טבלה 4).</li>
	<li>מעבירים את האורגנוידים לצינור 15 מ"ל. במשך 5 דקות, תן להם ליפול לתחתית, לשאוף supernatant, להוסיף 5 מ"ל של C בינוני. להחזיר את organoids לתוך bioreactors מיני. הערה: היזהר לא לאבד את כדורי, אשר שקופים ובקושי גלויים.</li>
	<li>מטפחים כדוריות בגודל C בינוני במשך שבועיים, מרעננים את המדיום כל יומיים. בסוף השבועיים האלה, השאירו כ-100 כדורי ספירה למיני ביו-ריאקטור לטיפוח הבא. להקפיא כדוריות מוגזמות במדיום קפוא בחנקן נוזלי.</li>
	<li>ביום 30, הכן בינוני D(טבלה 5).</li>
	<li>שנה את הטיפוח מדיום לבינוני D, שהוא מדיום התבגרות. רענן את המדיום לטיפוח כל 2-3 ימים במשך שלושה שבועות, ולאחר מכן השתמש בינוני D ללא BDNF ו- GDNF.</li>
</ol>

<ol><li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li>
<li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells%3A+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside+out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284(2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+region+specific+organoids+using+mini+bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li>
<li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li>
<li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+hippocampal+neurons+from+self-organizing+human+embryonic+stem+cell+derived+dorsomedial+telencephalic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue.</a> Nature Communication. 6 (1), 8896(2015).</li>
<li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li>
<li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell+platforms+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell platforms for drug discovery.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).</li>
<li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+depletes+neural+progenitors+in+human+cerebral+organoids+through+activation+of+the+innate+immune+receptor+TLR3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).</li>
<li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li>
<li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li>
<li>Di Nardo, P., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Development%22%5BJournal%5D)">Stem cell standardization.</a> Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).</li>
<li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li>
<li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li>
<li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li>
<li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necessity+Is+the+mother+of+invention%E2%80%9D+or+inexpensive%2C+reliable%2C+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Moscow%29%22%5BJournal%5D)">Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+brain+region%E2%80%93specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li>
<li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+of+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li>
<li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned%2C+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820(2021).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%2Fcolonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li>
<li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids%E2%80%94challenges+to+establish+a+brain+prototype%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790(2021).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כולל שני שלבים מכריעים המאפשרים יצירת אורגנוידים באיכות גבוהה בגודל אחיד. ראשית, האורגנוידים גדלים מפרואידים שהם כמעט זהים במספר התא ובבגרות התא. שנית, הביו-ראקטורים תוצרת בית מספקים לכל אורגנויד סביבה אחידה, שבה האורגנוידים אינם מצטופפים או נשארים זה לזה.
איכות התא ומצב הבשלת התא חיוניים לביצוע הפרוטוקול. זה קריטי להתחיל בידול עצבי ב 75-90% מפגש של IPSCs. אם צפיפות התאים נמוכה מדי, ה- iPSCs יכול להבדיל לכיוונים שאינם עצביים. חשוב לא לחרוג משבועיים של אינדוקציה עצבית של IPSCs ...

מודלים אנושיים נגזר iPSC נמצאים בשימוש נרחב במחקרים של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות1. במהלך העשור האחרון, מודלים של רקמת מוח תלת-ממדית, מה שמכונה organoidsהמוח, השלימו למעשה תרביות עצביות 2D מסורתיות . האורגנוידים מסכמים במידה מסוימת את הארכיטקטורה התת-ממדית של המוח העוברי ומאפשרים מידול מדויק יותר. פרוטוקולים רבים מתפרסמים עבור הדור של organoids המייצגים אזורי מוח שונים: קליפת המוח3,4,5, המוח הקטן6, המוח האמצעי, המוח הקדמי, ההיפותלמוס7,8,9, והיפוקמפוס10. היו דוגמאות רבות לשימוש באורגנוידים כדי לחקור מחלות מערכת העצבים האנושית11. כמו כן, organoids יושמו בתגליות סמים12 ושימש במחקרים של מחלות זיהומיות, כולל SARS-Cov-213,14.
האורגנוידים במוח יכולים להגיע לקוטר של עד כמה מילימטרים. לכן, האזור הפנימי של האורגנויד עלול לסבול מהיפוקסיה או מתת תזונה ובסופו של דבר להפוך לנמק. לכן, פרוטוקולים רבים כוללים bioreactors מיוחדים8, שייקרים, או מערכות microfluidic15. התקנים אלה עשויים לדרוש כמויות גדולות של מדיה יקרה של תרבית תאים. כמו כן, העלות של ציוד כזה היא בדרך כלל גבוהה. כמה bioreactors מורכבים חלקים מכניים רבים שהופכים אותם קשה לעקר לשימוש חוזר.
רוב הפרוטוקולים סובלים "אפקט אצווה"16, אשר מייצר שונות משמעותית בין organoids המתקבלים iPSCs זהה. שונות זו מעכבת בדיקות סמים או מחקרים פרה-קליניים הדורשים אחידות. התשואה הגבוהה של organoids מספיק כדי לבחור organoids בגודל אחיד עשוי לפתור חלקית בעיה זו.
גורם הזמן הוא גם בעיה משמעותית. Matsui ואח ' (2018) הראה כי organoids המוח דורשים לפחות שישה חודשים כדי להגיע לבגרות17. Trujillo ואח ' (2019) גם הוכיח כי פעילות אלקטרופיזיולוגית התרחשה organoids רק לאחר שישה חודשים של טיפוח18. בשל זמן ההתבגרות האורגנויד הארוך, החוקרים לעתים קרובות להשיק בידול חדש לפני השלמת הקודם. תהליכים מקבילים מרובים של בידול דורשים הוצאות נוספות, ציוד ושטח מעבדה.
לאחרונה פיתחנו מיני bioreactor זה פותר בעיקר את הבעיות שהוזכרו לעיל19. ביו-ריאקטור ביתי זה מורכב מהדבקה נמוכה במיוחד או צלחת פטרי לא מטופלת עם ידית פלסטיק במרכז. ידית פלסטיק זו מונעת צפיפות של organoids ואת conglutination שלהם במרכז צלחת פטרי, אשר נגרמת על ידי סיבוב של שייקר. מאמר זה מתאר כיצד ביו-רקטור מיני זול ופשוט תוצרת בית זה מאפשר לייצר אורגנוידים במוח באיכות גבוהה בכמויות גדולות.

<table><tbody><tr><td>מתקדם DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>DMEM/F-12</td></tr><tr><td>AggreWell400</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>34425</td><td>צלחת תרבית 24 בארות עם מיקרווולות</td></tr><tr><td>תוסף B-27</td><td>תוסף Gibco</td><td>17504044</td><td>תוסף עצבי B</td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>200 מ"מ L-alanyl-L-גלוטמין</td></tr><tr><td>BDNF אנושי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-285</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2 אנושי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-839</td><td></td></tr><tr><td>GDNF אנושי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-290</td><td></td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>החלפת סרום</td></tr><tr><td>mTESR1</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>85850</td><td>מדיום תאי גזע פליפוטנטי</td></tr><tr><td>N2 תוסף</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>17502001</tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>מדיום בזאלי לתחזוקת תאי עצב</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>פלסמוצין</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt-1</td><td>אנטי מיקרוביאלים</td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>EMD Millipore</td><td>540220</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS Y27632</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-538</td><td>Y27632</td></tr><tr><td>StemMACS Dorsomorphin</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-466</td><td>Dorsomorphin</td></tr><tr><td>StemMACS LDN-193189</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-540</td><td>LDN-193189</td></tr><tr><td>StemMACS SB431542</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-543</td><td>SB431542</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Versen solution</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td>0.48 מ"מ EDTA ב-PBS</td></tr> <tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

דור אורגנויד במוח מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים במיני ביו-רהקטורים תוצרת בית

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

האורגנויד המוחי שמקורו ב- iPSC הוא טכנולוגיה מבטיחה למידול במבחנה של הפתולוגיות של מערכת העצבים והקרנת סמים. טכנולוגיה זו התפתחה לאחרונה. הוא עדיין בחיתוליו ויש לו כמה מגבלות שעדיין לא נפתרו. הפרוטוקולים הנוכחיים אינם מאפשרים להשיג organoids להיות עקבי מספיק לגילוי סמים ומחקרים פרה קליניים. ההתבגרות של organoids יכול לקחת עד שנה, דוחף את החוקרים להשיק תהליכי בידול מרובים בו זמנית. היא מטילה עלויות נוספות עבור המעבדה מבחינת שטח וציוד. בנוסף, אורגנוידים במוח לעתים קרובות יש אזור נמק במרכז, אשר סובל ממחסור בחומרים מזינים וחמצן. לפיכך, רוב הפרוטוקולים הנוכחיים להשתמש במערכת במחזור עבור מדיום תרבות כדי לשפר את התזונה.
בינתיים, אין מערכות דינמיות זולות או bioreactors לטיפוח organoid. מאמר זה מתאר פרוטוקול לייצור אורגנוידים במוח במיני-רה-קטרים ביתיים קומפקטיים וזולים. פרוטוקול זה מאפשר קבלת organoids באיכות גבוהה בכמויות גדולות.

ערכת הפרוטוקול מוצגת באיור 1. הפרוטוקול כלל חמש מדיה שבה IPSCs נבדלו לאורגנואידים במוח במהלך חודש אחד לפחות. ההבחנה החלה ואז IPSCs הגיעו למפגש של 75-90%(איור 2A,B). הסימנים הראשונים של בידול כלפי נוירונים נצפו בימים 10-11 של טיפוח iPSC במצב בינוני A כאשר תאים החלו להתקבץ לתוך "rosettes" (איור 2C). בימים 14-15, IPSCs נבדל לאבות נוירו-אפיתל. 99% מהתאים היו חיוביים על סמן נוירו-אפיתל SOX1 ולא הביעו סמני תאים פלוריפוטנט...

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנוידים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (IPSCs). כדי להשיג אורגנוידים במוח בכמויות גדולות ובאיכות גבוהה, אנו משתמשים ביו-רה-קטרים מיני תוצרת בית.

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

עד כה, האורגנוידים המוחיים המובחנים מתאי גזע פלוריפוטנטיים הם מודל 3D במבחנה הקרוב ביותר לרקמת המוח האנושית המקומית. בנוסף, אורגנוידים מוחיים מתאימים באותה מידה למידול פתולוגיות שונות של מערכת העצבים המרכזית, לבדיקת חומרים פעילים פרמקולוגית, וגם לשימוש ברפואה רגנרטיבית. בינתיים, טכנולוגיה זו עדיין נמצאת בשלב הראשוני של הפיתוח.הפרוטוקול יכול להיות מחולק לשתי קבוצות בהתאם לשיטת קבלת אגרגטים ואת הטיפוח נוסף עם בידול. הראשון כולל פרוטוקול ומזימות של בידול, שונה בזמן הטיפוח ומעוררי בידול עם הבשלה מאוחרת יותר של organoid בשייקר במכשירים מיוחדים של הידבקות נמוכה כמו צינורות שוק או צלחות. קבוצה נוספת כוללת שימוש ביו-רה-קטרים מיוחדים.ניתוח של פרוטוקולים שונים הראה כי organoids צריך להיות מעובד בתנאים עם מדיום מיזים במחזור. עם זאת, היעדר מערכות פשוטות וזולות להשגת organoid עם גודל סטנדרטי ומורפולוגיה דורשים פיתוח של מכשירים כאלה כדי לשנות את קנה המידה של התהליך. בעבודה זו, אנו מתארים את השיטה שלנו לקבלת ובדיקה של ביו-רהקטורים מיני פשוטים וזולים המאפשרים להשיג כמויות גדולות של organoids באיכות גבוהה.חותכים את צינורות צנטריפוגות סטרילי 15 מיליליטר לתוך הטבעות, 7 או 8 מילימטרים גובה. תבודד את הטבעות. לשבור אגרגציות נמוכות על מנות פטרי מטופלות או מיקרוביולוגיות לפירורים.ממיסים כ 1 גרם של פירורי פלסטיק ב 10 מיליליטר של כלורופורם לילה כדי להכין פלסטיק נוזלי. הפוך ידית פלסטיק במרכז של סטרילי אולטרה הידבקות נמוכה 6 ס"מ צלחת פטרי. ישנן שתי דרכים מתאימות באותה מידה.הראשון, לשים את autoclave בטבעת פלסטיק על מרכז ולהחיל חצי מיליליטר של פלסטיק נוזלי לחלק הפנימי של הטבעת. השני, ללא טבעות פלסטיק טיפה חצי מיליליטר של פלסטיק נוזלי על מרכז צלחת פטרי. השאירו את הכלים פתוחים במשך 2 או 3 שעות במכסה המנוע של זרימה למינאר עד ליובש מוחלט.לטפח תאי גזע pluripotent המושרה במדיום עבור תאי גזע pluripotent, עד 75 או 90% מפגש בצלחות פטרי 35 מילימטר, מצופה מראש עם מטריצה מומסת דלבקו שונה נשר מדיום, ופישר-12 בינוני. הכן תחליף בינוני A פלוס סרום. לטפח תאי גזע פלוריפוטנטים המושרה במשך יום אחד במדיום עם החלפת סרום.החלף מדיום לתאי גזע פלוריפוטנטים למדיום החלפת סרום ביום האפס של בידול. הכן A.Change את בינוני עד בינוני A ביום 2 של בידול. לטפח תאים בינוני A במשך 2 שבועות, מרענן מדיום במנות פטרי כל 2 ימים.ביום 14, להתחיל את היווצרות של כדורי באמצעות צלחת תרבות מיוחדת 24-well המכיל כ 1, 200 microwells בכל באר. הכינו צלחת תרבית של 24 באר עם מיקרווולים. מוסיפים לכל באר 1 מיליליטר של בינוני A, צנטריפוגה לזמן קצר ב 1, 300 גרם במשך 5 דקות ברוטור דלי מתנדנד מצויד מחזיק צלחת.שליטה מתחת למיקרוסקופ שאין בועות במיקרווולים. מכינים את ה-B. מוציאים את המדיום מצלחת הפטרי. עבור ניתוק התא, לטפל בתאים עם 1.5 מיליליטר פתרון EDTA מוכן על PBS.שלוט בניתוק התא מתחת למיקרוסקופ. לקצור את התא לתוך צינור 15 מיליליטר. הוסף 5 מיליליטר מעורב דולבק ופישר מדיום בצינור לכיוון התאים.צנטריפוגה ב-200 גרם ל-5 דקות. הסר את תאי supernatant ולהשעות מחדש ב 2 מיליליטר של B. העבר את השעיית התאים המכילים 1 מיליארד תאים לתוך כל באר של צלחת 24 באר עם microwells. בעדינות pipette תאים עד ומטה מספר פעמים צנטריפוגה לזמן קצר 100 גרם במשך 1 דקה כדי ללכוד תא ב microwells.שליטה מתחת למיקרוסקופ שהתא מופץ באופן שווה במיקרווולים. לדגור את הצלחת לילה עבור צבירת תאים בפרואידים. למחרת בבוקר, יום 15, לבדוק מתחת למיקרוסקופים את איכות כדורי, שהם שקופים וחלקים אם בריאים.בזהירות לאסוף את כדורי מכל באר לתוך צינור 15 מיליליטר, להשאיר את כדורי לזרז על ידי כוח המשיכה במשך 2 ו 3 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. מוסיפים לכדורואידים 2 מיליליטר של המטריצה, מופשרים ואקס טמפור על קרח. מערבבים בעדינות על ידי צנרת ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.כדי לשטוף עודף של מטריצה, להוסיף לצינור 8 מיליליטר של B.Pipette בינוני בעדינות, ולאחר מכן צנטריפוגה הצינור במשך 1 דקות ב 100g. הסר את סופר-טבעי. מוסיפים לצינור 20 מיליליטר של B בינוני, פיפטה בעדינות, ואז לפצל את ההשעיה כדורית בין bioreactors מיני.לאחר מכן מניחים את bioreactors מיני לתוך צלחת פטרי 15 ס"מ, אשר מונע אידוי של מים וזיהום. שים את צלחת פטרי עם bioreactors מיני על שייקר מסלולית. לטפח את organoids בקצב סיבוב 70, 75 סל"ד.ביום 16, להכין בינוני C.Transfer organoid לתוך צינור 50 מיליליטר. במשך 5 דקות, תן להם ליפול לתחתית. שאפו את הסופר-נט והוסיפו 5 מיליליטר של C.Re. הבינוני להצטרף האורגנוידים במיני bioreactors.לטפח כדוריות בינוני C במשך 2 שבועות, מרענן את המדיום כל 2 ימים. במהלך שבועיים אלה, בחר כ -100 כדורי כל מיני bioreactors לטיפוח הבא. ביום 30, להכין בינוני D.Change טיפוח בינוני עד בינוני D, שהוא מדיום התבגרות.רענן את המדיום כל 2 או 3 ימים במשך 3 שבועות. לאחר מכן השתמש ב- D הבינוני המומס ב- F וב- GDNF. לאחר חודש של טיפוח רצופים בינוני A ו- B, organoids מתוקננת בגודל ומורפולוגיה מתקבלים.ככל שהוא גדל, הם צריכים לשנות את המדיום לעתים קרובות יותר, עד 4 פעמים בשבוע גם עולה. לאחר חודשיים של טיפוח, הם מגיעים לקוטר של 4 ו-5 מ"מ. ואחרי עוד חודש, 5 ו-6 מ"מ והצמיחה נעצרת.האיור מראה את המראה של אנזים organoid, קטעים ברורים צבועים המטוקסילין ו אאוזין. ניתוח אימונוהיסטוכימי במשך חודש אחד מראה את נוכחותם של אשכולות חיוביים SOX2 של תאי אבות, כולל בתוך החלק המרכזי. בפריפריה של האורגנוידים, חלבון חומצי פרברילי גליה, חלבון הקשור למיקרוטובול 2, והידרולסה תיאזין חיובית.תאים מרוכזים, אשר מתאים צורה בוגרת של נוירונים. במקרים מסוימים, אשכולות של לבנים על שטח נמק נוצרים בחלק המרכזי. זה מציין את המגבלה של פרוטוקול זה לקבלת organoids גדול יותר.סביר להניח, הגורם המגביל של הצמיחה הוא קצב דיפוזיה של חומרים מזינים וחמצן. אמצעי התקשורת והתאים השונים של כדוריות ובדיקת המערכת שלנו עבור סוגים מסוימים של organoids. הרבה מוח ורשתית, אורגנוידים משולבים מתאי קרצינומה בכבד ותאי גזע מזנכימליים, אורגנוידים משולבים משיחות גזע מזנכימליות בפיצוץ הבירה והבחנה בין תאי גזע המטופויים לתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים ואורגנואידים במעיים.האם זה היה משתנה בהרכב הראשוני של תאים? גורמי בידול, תרבות, מטריצה בינונית, חוץ תאית, ואולי גם הרכב תערובת הגז, קצב סיבוב האסדה ופרמטרים אחרים. ניתן יהיה להשיג organoid עם אותה צורה, גודל, או מודל מורפולוגיה באיברים ורקמות שונים.השימוש במיני ביו-קטרים המוצעים לעבודה זו.

brain-organoid-generation-from-induced-pluripotent-stem-cells-home

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הסרטון מדגים שיטה ליצירת אורגנואידים במוח אנושי מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. זה מראה כיצד הנוירוספירה יוצרת שכבה neuroectodermal, אשר מדכא את היווצרות של שכבות נבט אחרות. הנוירוספרות משובצות במטריצת ג'ל תלת ממדית ויוצרות ניצנים נוירואפיתליאליים. כאשר מודגרים עם מדיה אורגנואידים, ניצנים נוירואפיתליאליים אלה מתמיינים לאזורי מוח ספציפיים, וכתוצאה מכך נוצרים אורגנואידים בוגרים במוח.

שיטת מבחנה ליצירת אורגנואידים אנושיים במוח

סרטון זה מדגים בדיקה ליצירת אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ליצירת גופים עובריים (EBs). ה- EBs מתורבתים על פיגום פולימרי באמצעות מדיום אינדוקציה, המקדם התמיינות לתאי גזע עצביים, תאי אב ונוירונים לא בוגרים. לבסוף, EBs מוטמעים במטריצה ומועברים למדיום תחזוקה ליצירת אורגנואידים מוחיים.

יצירת אורגנואידים מוחיים פלוריפוטנטיים המושרים שמקורם בתאי גזע

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת אורגנואידים צרבלריים בוגרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות ביוריאקטור תלת-ממדי חד-פעמי. הביוריאקטור מאפשר יצירת אגרגטים iPSC, אשר לאחר מכן עובר טיפול עם סדרה של מדיה תרבית מועשרת בגורמי גדילה וכימוקינים המביאים להתמיינות של אגרגטים iPSC לאורגנואידים צרבלריים בוגרים. לאחר מכן, האורגנואידים נקצרים ונשמרים בהקפאה לניתוח נוסף.

יצירת אורגנואידים צרבלריים בוגרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים באמצעות ביוריאקטורים חד-פעמיים

Organoids מוחי לייצג מערכת מודל חדש לחקור מוקדם המוח האנושי לפיתוח במבחנה. מאמר זה מספק את המתודולוגיה מפורט לייצר ביעילות organoids הומוגנית מסוג הקדמי הגבי מתאי גזע pluripotent המושרה האנושי כולל שלבים קריטיים איפיון ואימות.

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

פרוטוקול זה נוצר כאמצעי לייצר אורגנואידים המוח באופן פשוט, עלות נמוכה ללא גורמי צמיחה אקסוגני או מטריקס קרום המרתף תוך שמירה על מגוון של סוגי תאי המוח ותכונות רבות של ארגון הסלולר.

שיטת בימוי עצמי סטטי ליצירת אורגנואידים המוח מתאי גזע האדם העובריים

פרוטוקול זה מתאר מערכת תרבות דינמית כדי לייצר אגרגטים גודל מבוקר של תאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ולעורר עוד יותר בידול באורגנואידים המוח הקטן תחת תנאים מוגדרים כימית ונטול מאכיל באמצעות bioreactor חד-שימוש.

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

פרוטוקול זה מאפשר התמיינות של תאים פלוריפוטנטיים אנושיים לאורגנואידי מעיים. הפרוטוקול מחקה התפתחות אנושית תקינה על ידי התמיינות תאים לאוכלוסייה של אנדודרם סופי, אנדודרם של המעי האחורי ולאחר מכן אפיתל מעיים. זה הופך את הפרוטוקול למתאים לחקר התפתחות מעיים כמו גם יישומי מידול מחלות.

יצירת אורגנואידי מעיים שמקורם ב-hiPSC עבור יישומים התפתחותיים ומידול מחלות

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

כאן מתוארות שיטות מפורטות לייצור, תחזוקה ואפיון של אורגנואידים במעי הדק ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. שיטות אלו נועדו לשפר את יכולת השחזור, להרחיב את המדרגיות ולהפחית את זמן העבודה הנדרש לציפוי ומעבר של אורגנואידים.

ייצור, תחזוקה ואפיון של אורגנואידים במעי ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנוידים לב אנושי רלוונטיים להתפתחות (hHOs) ביעילות באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים על ידי ארגון עצמי. הפרוטוקול מסתמך על הפעלה רציפה של רמזים התפתחותיים ומייצר רקמות לב אנושיות מורכבות ורלוונטיות מאוד מבחינה תפקודית.

יצירת אורגנוידים של לב אנושי המורכבים בעצמם המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים

פרוטוקול זה מציג שיטה ליצירת אורגנואידים וסקולריים באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

יצירת אורגנואידים וסקולריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם

למד לייצר אורגנואידים מוחיים מתאי גזע iPSCs באמצעות ביו-ריאקטורים מיני תוצרת בית. שיטה זו מאפשרת ייצור בקנה מידה גדול של רקמת מוח תלת-ממדית לחקר מחלות מערכת העצבים המרכזית ורפואה רגנרטיבית.

דור אורגנויד במוח מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים במיני ביו-רהקטורים תוצרת בית

גלה סרטונים נוספים