Name: הערכת צריכת חומצות אמינו בתאי עצם מתורבתים ובצירי עצם מבודדים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: למדו הערכת צריכת חומצות אמינו בתאי עצם מתורבתים ובצירי עצם מבודדים באמצעות שיטת סימון רדיואקטיבי. שיטה זו מהירה ורגישה לכימות צריכת חומצות אמינו במחקר ביולוגיית העצם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מעבדת קרנר נתמכת על ידי מענקי R01 של המכון הלאומי לבריאות (AR076325 ו-AR071967) ל-C.M.K.

כל הליכי העכבר המתוארים כאן אושרו על ידי ועדות המחקר בבעלי חיים במרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות'ווסטרן בדאלאס. פרוטוקול הקרינה אושר על ידי הוועדה המייעצת לבטיחות קרינה במרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות'ווסטרן בדאלאס.
1. ספיגת חומצות אמינו בתאים (פרוטוקול I)
<ol><li>צלחת 5 x 104 תאי ST2 בכל באר של צלחת תרבית רקמה 12 בארות. תאי צלחת ב-α-MEM המכילים 10% FBS, 100 U/mL פניצילין ו-0.1 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (Pen/Strep). צלחת בארות נוספות של תאים כדי לכמת את מספר התא לכל תנאי עבור הנורמליזציות בשלב 1.12. דגירה של תאים באינקובטור של תרבית תאים לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.</li>
	<li>תרבית את התאים במשך 2-3 ימים עד למפגש.</li>
	<li>ביום הניסוי, הכינו את הפתרונות הבאים: 1x פוספט תמיסת מלח (PBS), pH 7.4 וחיץ קרבס רינגרס HEPES (KRH), pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-גלוקוז). מחממים ל-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של 1x PBS, pH 7.4. הערה: פרוטוקול זה מתאים גם לחלוקה מהירה של תאים שאינם מתמזגים. במקרה זה, חשוב לנרמל את הרדיואקטיביות למספר תאים מוחלט או לתוכן DNA. בנוסף, שקול להגדיל את גודל צלחת התרבית או בקבוק כדי להגדיל את מספר התא הכולל ואת ערכי cpm. זה חשוב כדי לקבוע אמפירית על בסיס אישי.</li>
	<li>שאפו 1x PBS ושטפו את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל KRH.</li>
	<li>צור 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-מדיה עובדת של גלוטמין על ידי דילול 4 μL של [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-גלוטמין לכל 1 מ"ל של KRH. הערה: לפני השימוש בחומרים רדיואקטיביים, אנא צור קשר עם המשרד לבטיחות קרינה במוסד הבית שלך כדי לקבל אישורים. כל ההליכים הקשורים לקרינה חייבים להתבצע מאחורי מגן הפרספקס.</li>
	<li>דגירה של תאים עם 0.5 מ"ל של KRH המכילים 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-מדיה עובדת גלוטמין במשך 5 דקות.</li>
	<li>לאסוף את המדיום הרדיואקטיבי ולטפטף לתוך מיכל פסולת נוזלית. שטפו את התאים שלוש פעמים לזמן קצר עם KRH קר כקרח כדי לסיים את התגובה. לאסוף ולהשליך את כל השטיפות במיכל פסולת נוזלית רדיואקטיבית.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ"ל של 1% SDS לכל באר וטריטוראט פי 10 כדי לליז ולהומוגניזציה של התאים. העבר את התא lysates ל 1.5 מ"ל צינורות. יש להשליך צלחות תרבית תאים, פיפטות סרולוגיות וקצות פיפטה במיכל הפסולת הרדיואקטיבית המוצקה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב->10,000 x גרם למשך 10 דקות. מעבירים את הסופרנאטנטים לבקבוקוני ה-scintillation המכילים 8 מ"ל מתמיסת ה-Scintillation. מערבבים על ידי ניעור בקבוקוני הנצנוץ במרץ. יש להשליך צינורות וקצות פיפטה במיכל פסולת רדיואקטיבית מוצקה.</li>
	<li>קרא רדיואקטיביות בספירות לדקה (cpm) באמצעות מונה Scintillation. יש להשליך את בקבוקוני ה-Scintillation במיכל פסולת הבקבוקונים של Scintillation.</li>
	<li>טריפסיניזציה, החייאה וספירה של התאים מהלוחות הלא רדיואקטיביים הנותרים של התאים (ראו שלב 1.1) כדי להעריך את מספר התאים בתרביות הרדיואקטיביות המוזנחות. באמצעות המוציטומטר, לספור את מספר התאים לכל באר לא רדיואקטיבית עבור כל מצב ניסיוני. נרמל את ה-cpm משלב 1.11 למספר התא המשוער מהלוחות הלא רדיואקטיביים.</li>
	<li>לאחר השלמת הניסוי, יש לפרק את מכסה המנוע של תרבית התאים, הספסל וכל המכשירים באמצעות תרסיס רדיואקטיבי. לבסוף, בצע בדיקות מחיקה כדי לוודא שאזור העבודה נקי מקרינה.</li>
</ol>2. ספיגת חומצות אמינו ברקמות עצם שבודדו טריות (פרוטוקול II)
<ol><li>מחממים KRH ל-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להרדים עכבר בן 3 ימים ולהסיר את העור על הזרועות. יש לפרק את ההומרי מהכתף באמצעות מספריים ולנתח את שני ההומרים. הסר את כל הרקמות extemporaneous באמצעות אזמל ומלקחיים. הסר את epiphyses מן העצם. הערה: בנוסף ל- humerii, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לפמורה ילודים, tibiae ו calvariae, כמו גם humerii, פמורה ו tibiae מבודדים מעכברים בני 2 ו -4 חודשים (נתונים שלא פורסמו).</li>
	<li>יש לשטוף את מח העצם מהעצם ולשקול את פירי העצם כדי לנרמל בשלב 2.14.</li>
	<li>מרתיחים הומרוס אחד ב-PBS אחד בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להפוך את העצם לשונה. עצם מבושלת decellularized משמש שליטה שלילית. הערה: כבקרת איכות, פרפין מטמיע את העצמות המבושלות והלא מבושלות לכתמים היסטולוגיים כדי לאשר חזותית שהרתחה הייתה יעילה בדה-צלוליזציה של העצם.</li>
	<li>שיווי משקל הן humeri ב 1 מ"ל של KRH במשך 30 דקות באינקובטור תרבית התא ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>צור פתרון עובד של 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-ארגינין ב-KRH על-ידי דילול 4 μL של 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- מלאי ארגינין לכל 1 מ"ל KRH. הערה: פרוטוקול זה מתאים כדי להעריך את הספיגה של כל חומר מזין עם תווית רדיו שנבחר. L-[2,3,4-3 H]-גלוטמין, L-[14CU]-אלנין ו-L-[2,3-3 H]-פרולין נבדקו עם תוצאות דומות. נתוני ארגינין מוצגים כדי להדגיש את התועלת של פרוטוקול זה. התראה: כל ההליכים באמצעות קרינה חייבים להתבצע מאחורי מגן הפרספקס תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE).</li>
	<li>דגירה הן של עצם הבקרה הניסיונית והן של עצם הבקרה המבושלת בנפרד ב-KRH המכילה 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-ארגינין למשך עד 90 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. הערה: חשוב לקבוע באופן אמפירי את זמני הדגירה עבור תנאים שונים, כולל גיל העכברים, אלמנטים שונים בשלד וסוגי חומצות אמינו radiolabeled על ידי ביצוע קורס זמן. הרוויה מתרחשת לרוב לאחר כ-3-4 שעות. יש להעריך את הקליטה בנקודת זמן בזעם הליניארי של הקליטה.</li>
	<li>יש להסיר את המדיום הרדיואקטיבי ולהשליך למיכל הפסולת הרדיואקטיבית הנוזלית. יש לשטוף את humeri שלוש פעמים באמצעות קור כקרח 1 מ"ל של KRH כדי לסיים את התגובה. יש להשליך את כל השטיפות במיכל הפסולת הרדיואקטיבית הנוזלית.</li>
	<li>מעבירים כל עצם לצינור של 1.5 מ"ל. הוסף 500 μL של מאגר RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8.0); 0.5% NP40 (v/v); 0.5% DOX (w/v); 0.1% SDS (w/v)]. השליכו את לוחות התרבית, הפיפטות הסרולוגיות וקצות הפיפטה במיכל פסולת מוצקה רדיואקטיבית.</li>
	<li>הומוגני את humeri על ידי קיצוץ 100 פעמים עם מספריים במאגר RIPA.</li>
	<li>סוניקט (משרעת: 35%, דופק 1 שניות) העצם ההומוגנית המתקבלת במשך 10 שניות. הערה: סוניקציה ידועה גם כמייצרת אירוסולים. ניתן לבצע צעדי סוניקציה בארון בטיחות ביולוגי. כדי להפחית את היווצרות אירוסול, חשוב לא למלא את הצינורות. סוניקציה של נפחי דגימה קטנים עלולה לגרום לסוניקציה לא שלמה או לאובדן דגימה עקב קצף. אם מתרחשת הקצפה, צנטריפוגה את הדגימה במשך 5 דקות כדי לשקוע.</li>
	<li>להבהיר את הליזאט על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב >10,000 x גרם בטמפרטורת החדר. מעבירים 200 μL של ה-supernatant לבקבוקוני scintillation המכילים 8 מ"ל של תמיסת ה-scintillation. מערבבים על ידי ניעור בקבוקוני הנצנוץ במרץ. השליכו את כל הפסולת הרדיואקטיבית המוצקה (למשל, צינורות משומשים, קצוות פיפטה, צלחות וכו') במיכל הפסולת הרדיואקטיבית המוצקה.</li>
	<li>קרא רדיואקטיביות (cpm) באמצעות מונה Scintillation. יש להשליך בקבוקוני scintillation משומשים במיכל הפסולת הרדיואקטיבית המיועד לבקבוקוני scintillation.</li>
	<li>הפחת את ה- cpm של עצם מבושלת (ערך בסיסי) מה- cpm של עצם ניסיונית. לנרמל את הרדיואקטיביות עם משקל העצם משלב 2.3.</li>
	<li>רססו את מכסה המנוע, המכשירים והספסל של תרבית התאים בחומר מתפרק רדיואקטיביות. בצע בדיקות מחיקה כדי לוודא שאזור העבודה נקי מקרינה.</li>
</ol>

<ol><li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+%CE%B1-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li>
<li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Krebs+to+clinic%3A+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li>
<li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li>
<li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin%2FIGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li>
<li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712(2013).</li>
<li>Hosios, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+rather+than+glucose+account+for+the+majority+of+cell+mass+in+proliferating+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells.</a> Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).</li>
<li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li>
<li>Sullivan, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+aspartate+biosynthesis+is+an+essential+function+of+respiration+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells.</a> Cell. 162 (3), 552-563 (2015).</li>
<li>Nelsen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+regulate+hepatocyte+proliferation+through+modulation+of+cyclin+D1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).</li>
<li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457(2016).</li>
<li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li>
<li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
<li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li>
<li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sensor+Eif2ak4%2FGCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li>
<li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li>
<li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li>
<li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%2C+Peptides+and+Proteins+in+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li>
<li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Proceedings+of+the+Nutrition+Society%22%5BJournal%5D)">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li>
<li>Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transport+in+adult+diaphyseal+bone%3A+contrast+with+amino+acid+transport+mechanisms+in+fetal+membranous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone.</a> Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).</li>
<li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li>
<li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transporters+revisited%3A+New+views+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין גילויים.

הפרוטוקול המתואר כאן מספק גישה מהירה ורגישה להערכת ספיגת חומצות אמינו בתגובה לתמורות ניסיוניות שונות במבחנה או ex vivo. בהשוואה לערכות הזמינות מסחרית (למשל, גלוטמין וערכת קביעת גלוטמט), שיטה זו הרבה יותר רגישה, מהירה ופחות דורשתעבודה של 16,17,25. בפרוטוקול שלנו, אנו מעריכים קליטה במאגר קרבס רינגרס HEPES. אנו משתמשים במדיה זו מכיוון שהיא נוסחה בסיסית המאפשרת שינויים מהירים וקלים כדי לבחון מגוון רחב של תנאים לאפי...

חומצות אמינו הן תרכובות אורגניות המכילות קבוצות פונקציונליות של חומצות אמינו (-NH2) וקרבוקסיל (-COOH) עם שרשרת צדדית משתנה הספציפית לכל חומצת אמינו. באופן כללי, חומצות אמינו ידועות כמרכיב הבסיסי של חלבון. לאחרונה הובהרו שימושים חדשים ותפקודים של חומצות אמינו. לדוגמה, חומצות אמינו בודדות יכולות לעבור מטבוליזם כדי ליצור מטבוליטים ביניים התורמים לביו-אנרגיה, מתפקדים כקופקטורים אנזימטיים, מווסתים מיני חמצן תגובתי או משמשים לסינתזה של חומצות אמינו אחרות 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . מחקרים רבים מראים כי חילוף חומרים של חומצות אמינו הוא קריטי עבור פלוריפוטנטיות, שגשוג והתמיינות של תאים בהקשרים שונים 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
אוסטאובלסטים הם תאים מפרישים המייצרים ומפרישים את מטריצת העצם החוץ-תאית העשירה בקולגן מסוג 1. כדי לשמור על שיעורים גבוהים של סינתזת חלבונים במהלך היווצרות העצם, אוסטאובלסטים דורשים אספקה מתמדת של חומצות אמינו. כדי לענות על דרישה זו, osteoblasts חייב לרכוש באופן פעיל חומצות אמינו. בהתאם לכך, מחקרים אחרונים חושפים את החשיבות של ספיגת חומצות אמינו וחילוף חומרים בפעילות אוסטאובלסטים וביצירת עצם 15,16,17,18,19,20.
אוסטאובלסטים רוכשים חומצות אמינו תאיות משלושה מקורות עיקריים: סביבה חוץ-תאית, פירוק חלבונים תוך-תאיים וביוסינתזה של חומצות אמינו דה-נובו. פרוטוקול זה יתמקד בהערכת ספיגת חומצות אמינו מסביבה חוץ-תאית. השיטות הנפוצות ביותר למדידת ספיגת חומצות אמינו מסתמכות על חומצות אמינו בעלות תווית רדיו (למשל, 3שעות או 14מעלות צלזיוס) או על איזוטופים כבדים המסומנים (למשל, 13מעלות צלזיוס). מבחני איזוטופומרים כבדים יכולים לנתח ספיגת חומצות אמינו וחילוף חומרים בצורה יסודית ובטוחה יותר, אך לוקח להם זמן רב יותר להשלים מספר ימים מכיוון שלוקח יום להכין ולהפיק דגימות ומספר ימים לנתח בספקטרומטר המסה בהתאם למספר הדגימות21,22. לשם השוואה, מבחני ספיגת חומצות אמינו מסומנים ברדיו אינם אינפורמטיביים לגבי חילוף החומרים במורד הזרם, אך הם זולים ומהירים יחסית, וניתן להשלים אותם תוך 2-3 שעות מתחילת הניסוי23,24. כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי הניתן לשינוי בקלות, שנועד להעריך קליטת חומצות אמינו בתרבית או בקווי תאים במבחנה או בצירי עצם בודדים ex vivo. ניתן להרחיב את היישום של שני פרוטוקולים אלה לחומצות אמינו אחרות המסומנות ברדיו ולסוגי תאים ורקמות אחרים הקשורים לעצמות.

<table><tbody><tr><td>0.25% טריפסין</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 12 בארות</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>BD דיוק</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30G מחט</td><td>BD דיוק</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>ארגינין מונוהידרוכלוריד L-[2,3,4-3H]-, 1mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1123001MC</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS6500 מונה נצנוץ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>כולין כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>C7077</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-תמיסת גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לכלי</td><td></td><td></td> דיסקציה<td>, מספריים, סקייפלס</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית</td><td>סיגמא</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(1M)</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>L-[3,4-3H(N)]-גלוטמין</td><td>Perkinבקבוקוני</td><td></td> סינטלציה נוזליים NET551250UC <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>Z190535</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ליתיום כלוריד, 8M</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MEM&alpha;</td><td>צינור מיקרוצנטריפוגה Gibco</td><td>12561</td><td></td></tr>, <tr><td>15 מ"ל</td><td>ביוטיקס</td><td>89511-256</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>סיגמא</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>סיגמא</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonic& חומרים:</td><td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>648311</td><td></td></tr><tr><td>Ultima Gold (תמיסת נצנוץ)</td><td>PerkinElmer</td><td>6013329</td><td></td></tr><tr><td>&-(Methylamino), חומצה איזובוטירית</td>, <td>Sigma</td><td>M2383</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת צריכת חומצות אמינו בתאי עצם מתורבתים ובצירי עצם מבודדים

Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

התפתחות העצם וההומאוסטזיס תלויה בהתמיינות ובפעילות של אוסטאובלסטים יוצרי עצם. התמיינות אוסטאובלסט מאופיינת ברצף על ידי התפשטות ואחריה סינתזת חלבונים ובסופו של דבר הפרשת מטריצת עצם. התפשטות וסינתזת חלבונים דורשות אספקה מתמדת של חומצות אמינו. למרות זאת, מעט מאוד ידוע על צריכת חומצות אמינו באוסטאובלסטים. כאן אנו מתארים פרוטוקול רגיש מאוד שנועד למדוד צריכת חומצות אמינו באמצעות חומצות אמינו מסומנות ברדיו. שיטה זו מותאמת לכימות שינויים בספיגת חומצות אמינו הקשורים להתרבות או התמיינות של אוסטאובלסט, טיפולים תרופתיים או גורמי גדילה, או מניפולציות גנטיות שונות. חשוב לציין שניתן להשתמש בשיטה זו לסירוגין כדי לכמת את צריכת חומצות האמינו בקווי תאים בתרבית או בתאים ראשוניים במבחנה או בפירי עצם מבודדים ex vivo. לבסוף, השיטה שלנו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי למדוד את ההובלה של כל חומצות האמינו, כמו גם גלוקוז וחומרים מזינים אחרים radiolabeled.

הובלת חומצות אמינו מווסתת על ידי מובילי חומצות אמינו רבים הקשורים לממברנה אשר סווגו למערכות הובלה נפרדות המבוססות על מאפיינים רבים, כולל ספציפיות מצע, קינטיקה, כמו גם תלות יונים ו- pH25. לדוגמה, ספיגת גלוטמין יכולה להיות מתווכת על ידי מערכות ההובלה התלויות Na+ A, ASC, γ+L ו- N או מערכת L הבלתי תלויה ב- Na+-. המערכות התלויות ב-Na+ נבדלות על ידי היכולת להחליף את Li+ ב-Na+ (מערכת N) או ברגישות לחומצה האנלוגית 2-(מתילאמינו)איזובוטירית (MeAIB) (מערכת A)....

פרוטוקול זה מציג בדיקת ספיגת חומצות אמינו עם תווית רדיו, אשר שימושית להערכת צריכת חומצות אמינו בתאים ראשוניים או בעצמות מבודדות.

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

ספיגת חומצות אמינו וחילוף חומרים חיוניים למפרט אוסטאובלסט, התמיינות ויצירת עצם. פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ורגישה להערכת ספיגת חומצות אמינו. הפרוטוקול שלנו משתמש בחומצות אמינו מסומנות ברדיו כדי לכמת את ספיגת חומצות האמינו.זוהי שיטה זולה, רגישה ומהירה אשר ניתן לשנות בקלות עבור תנאים שונים. פרוטוקול זה יכול להשתנות בקלות כדי להעריך את ספיגתם של חומרים מזינים אחרים עם תווית רדיו כמו גלוקוז וחומצות שומן במגוון רקמות, כמו גם תאים ראשוניים או טרנספורמטיביים. כדי להתחיל קליטת חומצות אמינו צלחת בדיקה חמש פעמים 10 לתאי ST2 הרביעי בכל באר של צלחת תרבית רקמה 12 באר במדיום אלפא MEM בתוספת FBS, פניצילין וסטרפטומיצין.צלחת בארות נוספות של תאים כדי לכמת את מספר התא לכל תנאי עבור הנורמליזציות. לאחר מכן, דגירה של תאים בחממה של תרבית תאים לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך יומיים-שלושה עד למפגש. לאחר הדגירה לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS ב pH 7.4.לאחר מכן שאפו את ה- PBS לפני שטיפת התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של קרבס-רינגר HEPES או KRH. דגירה של תאים עם 0.5 מיליליטר של KRH מוכן טרי המכיל ארבע מיקרוקוריות למיליליטר L34 טריטמין מדיה עובד במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, לאסוף את המדיום הרדיואקטיבי כדי לזרום לתוך מיכל פסולת נוזלית.לאחר מכן לשטוף את התאים שלוש פעמים עם KRH קר כקרח כדי לסיים את התגובה. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של 1% נתרן דודציל סולפט לכל באר triturate את התערובת 10 פעמים כדי lyse ו homogenize התאים. לאחר מכן להעביר את התא lysates לצינור 1.5 מיליליטר ולהבהיר את ליזאט על ידי צנטריפוגה במהירות מינימלית של 10, 000 G במשך 10 דקות.מעבירים את הסופרנאטנט לבקבוקון scintillation המכיל שמונה מיליליטר של תמיסת ה-Scintillation, וקוראים את פעילות הרדיו ואת הספירות לדקה באמצעות מונה ה-scintillation. מתוך שאר הצלחות הלא רדיואקטיביות של התאים, טריפסיניזציה, החייאה וספירת התאים כדי להעריך את מספר התאים בתרביות הרדיואקטיביות המזוהמות. באמצעות המציטומטר, לספור את מספר התאים לכל באר לא רדיואקטיבית עבור כל מצב ניסיוני.כדי לקבוע ספיגת חומצות אמינו, יש לשטוף את המח מהעצם לפני שקילת פיר העצם. כדי לנטרל את העצם, מרתיחים הומרוס אחד ב-PBS ב-100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שיווי משקל הן humeri חי מבושל במיליליטר אחד של KRH במשך 30 דקות באינקובטור תרבית תאים ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, דגרו את עצמות הבקרה הניסיוניות והמבושלות בנפרד ב-KRH שהוכן זה עתה, המכילות ארבע מיקרו-קורי למיליליטר L234 טריגינין למשך עד 90 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת המדיום הרדיואקטיבי, לסיים את התגובה על ידי שטיפת humerus שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של KRH קר כקרח. מעבירים כל עצם לצינור של 1.5 מיליליטר עם 500 מיקרוליטר של RIPA Buffer.לאחר מכן הומוגניים של ההומרוס וחיץ RIPA על ידי חיתוך 100 פעמים עם מספריים, ולאחר מכן סוניקציה באמפליטודה של 35% ופעימה של שנייה אחת למשך 10 שניות. הבהיר את הליזאט על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10, 000 פעמים G בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, העבירו 200 מיקרוליטרים של הסופר-נטנט לבקבוקוני ה-Scintillation המכילים שמונה מיליליטרים של תמיסת ה-Scintillation.קרא את פעילות הרדיו באמצעות מונה הסינטילציה. תכונות קינטיות של ספיגת גלוטמין משולשת במבחנה L34 ותאי ST2 מקבילים הוערכו בנוכחות או בהיעדר נתרן מתיל אמינו איזובוטירי חומצה או ליתיום. הסרת הנתרן הובילה לירידה של 90% בספיגת גלוטמין.נוכחות ליתיום הגדילה את ספיגת הגלוטמין ב-2% בהשוואה למצב ללא נתרן. ואילו חומצה איזובוטירית מתיל אמינו לא השפיעה על ספיגת הגלוטמין. אחוז התרומות של מערכת A, N, L או ASC וגמא פלוס L הצביע על כך שרוב ספיגת הגלוטמין מתווכת על ידי מערכות ASC וגמא בתוספת L.System N אחראית לספיגת גלוטמין תלוית נתרן בערך 2%.ומערכת א' הראתה 0% תרומה וספיגה. X-VIVO L34 טריטיזציה ספיגת ארגינין בהאמרי ילודים מבושלים וחיים נותחה במשך זמן של שעתיים. ספיגת הארגינין עלתה באופן ליניארי במהלך הניסוי והומרי חי.ההומרי המבושל לא הפגין עלייה דינמית בספיגת ארגינין בניסוי. הניתוח המייצג מראה את ספיגת הארגינין המנורמלת והמתוקנת. חשוב להרתיח את העצם הקונטרלטרלית כבקרה פעילה.שלב זה חיוני מכיוון שמטריצת העצם עלולה לספוג חומצות אמינו רדיואקטיביות, וכתוצאה מכך תוצאות לא מדויקות. הפרוטוקול אפשר לנו לאשר קינטיקה של ספיגת חומצות אמינו הן במבחנה והן ב- in vivo.

evaluation-amino-acid-consumption-cultured-bone-cells-isolated-bone

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

ספריה התצוגה phage שימש לזהות רצפי פפטיד כי עצם היעד. המטרה היתה לחקור את ההשפעה של פפטידים אלו על התמיינות תאים mesenchymal ולקבוע את השפעתם על התחדשות העצם.

פפטידים מהספרייה תצוגה phage לווסת את ביטוי הגנים בתאים mesenchymal ו להגביר Osteogenesis ב פגמים עצם Unicortical

בסרטון זה אנו מתארים שיטה לזיהוי משקעי סידן המופרשים על ידי אוסטאובלסטים באמצעות צבע אניוני, Alizarin Red S. האוסטאובלסטים המתורבתים מוכתמים תחילה ולאחר מכן מחזירים את הצבע לצורך כימות קולורימטרי של משקעי סידן או מידת מינרליזציה של אוסטאובלסט.

בדיקת מינרליזציה חוץ גופית: שיטה קולורימטרית לכימות משקעי סידן אוסטאובלסטים על תחליף שתל עצם על ידי צביעה ומיצוי של Alizarin Red S

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה להערכת ספיגת חומצות אמינו על ידי תאי סטרומה שמקורם במח עצם. מובילי חומצות אמינו תלויי Na+ מתווכים את ספיגת חומצות האמינו המסומנות בקרינה בתוך התאים, והספיגה התאית נאמדת על ידי מדידת הרדיואקטיביות.

בדיקת ספיגת חומצות אמינו עם תווית רדיופונית לכימות ספיגה תאית של חומצות אמינו

אנו מתארים כאן כיצד להכין מדיום מיזוג עצם (BCM) ולבדוק את פעילותו במבחנה.

בינוני אוויר עצם: הכנה ומבדק

אורניום ידוע להשפיע על מטבוליזם העצם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמטרתו לחקור את ההשפעה של חשיפה אורניום טבעי על הכדאיות את הבידול, את הפונקציה של osteoclasts, התאים האחראי על ספיגת עצם.

שיטות ניתוח ההשפעות של אורניום טבעי על במבחנה Osteoclastogenesis

אנו מציגים פרוטוקול כדי להשוות את המצב של מינרלים שלפוחית שפורסמו על ידי שתי שורות תאים עצמות אנושיות: hFOB 1.19 ו- Saos-2. הפרופילים שלהם מינרליזציה נותחו על ידי Alizarin אדום-S (AR-S) מכתים, ויזואליזציה אור אולטרה סגול (UV), הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) הדמיה, אנרגיה ואנליזת רנטגן microanalysis (EDX).

ניתוח של מינרלים המיוצר על ידי hFOB 1.19 ואלקטרון Saos-2 תאים באמצעות שידור עם אנרגיה ואנליזת רנטגן Microanalysis

כאן, אנו מציגים שיטה עבור תרבות vivo ex של עצמות murine ארוך בשלבים העוברי והיילוד, מתאים לניתוח העצם ופיתוח הסחוס הומאוסטזיס בתנאים מבוקרים תוך לכידה בתהליך vivo.

Culturing ומדידת עוברי והיילוד מורנה עצמות ארוכות

בדיקת שטף מטבולי של תאים בזמן אמת מודדת את קצב צריכת החמצן ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית, המתאים לייצור אדנוזין טריפוספט מיטוכונדריאלי וגליקוליטי, באמצעות חיישני pH וחמצן. כתב היד מסביר שיטה להבנת מצב האנרגיה של אוסטאובלסטים ואפיון ופרשנות של המצב הביו-אנרגטי התאי.

שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט

כאן אנו מציגים הליך בדיקה פשוט ויעיל לבדיקות בור ספיגה באמצעות לוחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט.

פרוטוקול בדיקת בור פשוט להדמיה וכימות של ספיגה אוסטאוקלסטית במבחנה

פרוטוקול זה מתאר את ייצור מבני העצם התלת-ממדיים באמצעות אוסטאוציטים אנושיים המוטמעים בהידרוג'לים של ג'לטין מתקרילט (GelMA) בתוספת מטריצה חוץ-תאית מפורקת תאים. השיטה זולה, ניתנת להרחבה ותואמת לציוד מעבדה בסיסי, ומספקת פלטפורמה תרגומית לחקר תהליכי מחלות שריר-שלד.

פלטפורמת תרביות עצם תלת-ממדית המשתמשת באוסטאוציטים אנושיים ובמטריצה חוץ-תאית מנותקת למידול מחלות שריר-שלד

למדו הערכת צריכת חומצות אמינו בתאי עצם מתורבתים ובצירי עצם מבודדים באמצעות שיטת סימון רדיואקטיבי. שיטה זו מהירה ורגישה לכימות צריכת חומצות אמינו במחקר ביולוגיית העצם.

הערכת צריכת חומצות אמינו בתאי עצם מתורבתים ובצירי עצם מבודדים

גלה סרטונים נוספים