ייצור חלקיקי שומנים טעונים siRNA באמצעות מכשיר מיקרופלואידי
22 במרץ 2022
מיקרופלוידי מבוסס שומנים ננו חלקיקים (LNP) שיטות הייצור משכו תשומת לב במערכות אספקת תרופות (DDSs), כולל אספקת RNA. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, ייצור LNP (siRNA טעון LNP) ותהליכי הערכת LNP באמצעות המכשיר המיקרופלואידי המקורי שלנו בשם iLiNP.
גודל חלקיקי השומנים משפיע על הייחוס הביולוגי, אפקט אנטי הגידול, וביצועי השתקת גנים. לכן, שיטת בקרת גודל LNP היא טכניקה יעילה לייצור תרופות ננו, כולל מערכות אספקת RNA. מכשיר מיקרופלואידי מקורי זה, בשם מכשיר iLiNP, היה מסוגל לשלוט בגודל LNP הנע בין 20 ל 100 ננומטר במרווחי 10 ננומטר.
מכשיר iLiNP יכול לייצר לא רק LNPs טעון siRNA, אלא כל mRNA טעון LNPS, ו ribonucleoprotein טעון LNPs. כדי להתחיל, לקחת את פתרונות האתנול השומנים ולהפיק את siRNA טעון LNPs על ידי ערבוב DOTAP, DSPC, כולסטרול ופתרונות DMG-PEG2k ביחס טוחן של 50 כדי 10 כדי 38.5 כדי 1.5. התאם את ריכוז השומנים הכולל לשמונה מילימולר.
לאחר מכן לקחת את הפתרונות מימיים של 154 מילימולרי תמיסת מלח ו 25 מילימולר אצטט חוצץ ב pH 4 ולסנן אותם דרך מסנני קרום 0.2 מיקרומטר או מסנני מזרק. הכן את פתרון מאגר siRNA על ידי המסת 70 מיקרוגרם של siGL4 לתוך מיליליטר אחד של 25 מילימולר מאגר אצטט. מלא מזרקי זכוכית מיליליטר אחד עם שומנים בדם ופתרונות מימיים, בהתאמה.
חבר את מזרקי הזכוכית אל נימי השיא באמצעות מחברי מזרק, ולאחר מכן הגדר את קצב הזרימה של השומנים ואת פתרונות מימית ולהציג את השומנים ואת פתרונות מימית בנפרד לתוך המכשיר iLiNP באמצעות משאבות מזרק. לאסוף את ההשעיות LNP במיקרו-צינור מהשקע של מכשיר iLiNP. Dialyze ההשעיה LNP באמצעות קרום דיאליזה של 12 עד 14 קילודלטון קיצוצים במשקל מולקולרי בארבע מעלות הוא צלזיוס לילה נגד מלוחים או DPBS עבור POPC LNPs ו- SIRNA טעון LNPs, בהתאמה.
לאסוף את ההשעיות LNP שעברו דיאליזה במיקרו-צינוריות ולאחר מכן לשפוך 20 עד 30 מיקרוליטרים של ההשעיה LNP לתא מיקרו קוורץ. לבסוף, למדוד את גודל LNP, התפלגות גודל LNP ומדד פיזור פולי על ידי פיזור אור דינמי. התפלגות גודל POPC LNP המיוצרת בתנאי זרימה שונים, כגון קצב הזרימה הכולל ויחסי קצב הזרימה מוצגים כאן.
גדלי LNP מדויקים הנעים בין 20 ל 100 ננומטר ניתן לשלוט באמצעות מכשיר iLiNP זה. LNPs בגודל קטן נוצרים בתנאי קצב זרימה כולל גבוה. בנוסף, גדלי ה- LNP הנוצרים ב- FRR 5 קטנים מאלה של FRR 3, ללא קשר לקצב הזרימה הכולל.
התפלגות גודל של רכיבי LNPs נטענים של siRNA מוצגת כאן. siRNAs הם encapsulated לתוך LNPs על ידי אינטראקציה אלקטרוסטטית בין DOTAP השומנים הקטיוניים siRNAs טעון שלילית. מכשיר iLiNP ייצר 90 ננומטר siRNA טעון LNPs קטיוני עם התפלגות צרה.
יעילות אנקפסולציה siRNA היה 95% בגלל האינטראקציה האלקטרוסטטית בין השומנים הקטיוניים לבין siRNAs טעון שלילית. ציטוטוקסיות ופעילות השתקת הגנים של 19 ננומטר siRNA טעון LNPs הוערכו. siRNA טעון LNPs הראה ציטוטוקסיות במינון של 10 עד 100 siRNA ננומולרי.
רמת הביטוי של לוציפראז ירדה בהתאם לריכוז siRNA. ה- LNPs הטעון siRNA הדחיק 80% ביטוי לוציפראז במינון של 100 siRNA ננומולרי. מיטובים של תנאי הזרימה הם השלבים החשובים ביותר בפרוטוקול כדי להשיג את LNPs בגודל הרצוי.
שיטת הייצור LNP המבוססת על מיקרופלואידים, כולל התקן iLiNP, אינה דורשת הליך מסובך וצפויה להיות מועסקת כשיטת הייצור הסטנדרטית של LNP.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להפקה של ננו-חלקיקים ליפידיים (LNPs) טעונים ב-siRNA באמצעות התקן מיקרו-פלואידי הנקרא iLiNP. שיטה זו מאפשרת בקרה מדויקת על גודל ה-LNP, דבר שהוא קריטי למערכות יעילות למסירת תרופות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מערכות להולכת תרופות
- ננו-חלקיקי ליפידים
- מיקרופלואידיקה
רקע
- גודלן של ננו-חלקיקים ליפידיים משפיע על הפיזור הביולוגי ועל היעילות הטיפולית.
- בקרת גודל ה-LNP חיונית לאופטימיזציה של הובלת RNA.
- מכשיר ה-iLiNP מאפשר בקרת גודל מ-20 עד 100 ננומטרים.
- אינטראקציות אלקטרוסטטיות מקלות על כליאת siRNA בתוך LNPs.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להפקה של LNPs טעונים ב-siRNA.
- הערכת ההשפעה של גודל ה-LNP על יעילות השתיקה הגנטית.
- אופטימיזציה של תנאי הזרימה להשגת מאפייני LNP רצויים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסות ליפידיות ומימיות לייצור LNP.
- שימוש במכשיר ה-iLiNP לערבוב ויצירת LNP.
- דיאליזה של תרחיפי LNP להסרת חומרים עודפים.
- פיזור אור דינמי (Dynamic light scattering) למדידת גודל והתפלגות ה-LNP.
תוצאות עיקריות
- מכשיר ה-iLiNP ייצר LNPs טעונים ב-siRNA בגודל של 90 nanometers וביעילות כליאה של 95%.
- LNPs קטנים נוצרו תחת תנאים של סביב זרימה כולל גבוה.
- LNPs טעונים ב-siRNA הפגינו ציטוטוקסיות והשתקה גנטית יעילה.
- תנאי זרימה אופטימליים היו קריטיים להשגת גדלי ה-LNP הרצויים.
מסקנות
- השיטה המיקרופלואידית המשתמשת במכשיר ה-iLiNP מפשטת את ייצור ה-LNP.
- גישה זו צפויה להוביל לסטנדרטיזציה של ייצור LNP במחקר.
- מחקרים עתידיים יכולים לבחון את יישום שיטה זו במערכות הובלה שונות של RNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בקרה מדויקת של גודל ננו-חלקיקים שומניים (LNP) היא קריטית לאופטימיזציה של הפיזור הביולוגי, היעילות הטיפולית וביצועי השתיקה הגנטית במערכות להולכת תרופות מבוססות RNA. התקן המיקרופלואידי iLiNP מאפשר ייצור הדיר של LNPs עם גודל שניתן לכיוונון בין 20 ל-100 ננומטרים, ובכך תומך בזרימות עבודה של תיקוף מטרות וזיהוי מועמדים (lead identification) בשלבים מוקדמים. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי הפחתת השונות בביצועי הננו-חלקיקים, גורם מפתח בהפחתת סיכונים בהקדמה טרנסלציונית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של פעילות ביולוגית התלויה בגודל עבור LNPs טעונים ב-siRNA במבחני תיקוף מטרה.
- ערך תפעולי: מספק פורמולציות LNP סטנדרטיות להפחתת רעשים בסריקות פנוטיפיות ובמחקרים להסרת סיכונים מכניסטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יצירת siRNA-LNPs מונו-דיספרסיים עם גודל מוגדר ויעילות הכנסה (encapsulation) של 95% להערכה אמינה של תרכובות.
- ערך תפעולי: תמיכה בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות בקרת גודל LNP הניתנת לשחזור, על ידי כיוון קצב הזרימה במכשיר ה-iLiNP.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר להקים קשר בין גודל ה-LNP לבין יעילות השתקת הגנים והציטוטוקסיות במערכות הרלוונטיות למחלה.
- ערך תפעולי: מאפשר ייצור ניתן להרחבה של LNPs טעונים ב-mRNA, siRNA וריבונוקלאו-פרוטאין לצורך רצף פרה-קליני.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטת המיקרופלואידיקה iLiNP משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד לפיתוח פרה-קליני, ובמיוחד עבור תרופות מבוססות RNA שבהן למסירה התלויה בגודל יש השפעה על היעילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות באמצעות אפשור שינוי שיטתי של גודל ה-LNP כדי להעריך את ההשפעה על קליטה תאית ומעורבות מטרה.
- סריקה: מספקת פורמולציות LNP מוכנות לבדיקה עם התפלגות גודל עקבית ואנקפסולציה גבוהה של siRNA לצורך סריקה רב-חזורת של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת פלטי גודל כמותיים, פולידיספרסיות ופוטנציאל זטא באמצעות פיזור אור דינמי כדי לספק מידע לקבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go).
- מחקר תרגומי: מקשרת בין אופטימיזציית LNP בשלב הגילוי להערכה פרה-קלינית באמצעות ננו-תרופות סטנדרטיות בעלות בקרת גודל.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה רב-פעמית לייצור של LNPs שונים טעוני RNA (siRNA, mRNA, RNP) במסגרת פרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון ביעד על ידי קישור תכונות פיזיקו-כימיות של LNPs לתוצאות תפקודיות, כגון השתקת גנים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של ייצור LNPs באמצעות דיוק מיקרופלואידי.
- ערך אסטרטגי: מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות להסרת סיכונים מוקדמת של ביצועי כלי ההגשה.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתיעדוף מותאם-סיכון של מועמדים לטיפולים מבוססי RNA על בסיס יעילות ההגשה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפורמולציה של ליפידים, טיפול במיקרופלואידיקה וטעינה של חומצות גרעיניות.
- תלוי במשאבות מזריקים, מזרקי זכוכית ותשתית דיאליזה לטיהור LNP.
- מחייב סטנדרטיזציה של יחסי קצבי זרימה ותנאי זרימה כוללים בין הצוותים.
- כולל שיקולי התאמה בעת שינוי הרכבי ליפידים או סוגי מטען RNA.
- מוגבל על ידי הצורך בדיאליזה לאחר הייצור ובפיזור אור דינמי (DLS) לצורך בקרת איכות.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of Lipid Solutions and the siRNA/ Buffer Solution
1:58
Set-Up of the iLiNP Device and Production of LNPs
2:35
Dialysis of the LNP Suspension and LNP Size Measurement
3:24
Results: POPC LNP Size Distributions Produced by the iLiNP Device at Different Flow Rate Ratios and Characterization and Cytotoxicity of siRNA-Loaded LNPs
5:22
Conclusion
