Name: דיסוציאציה מכנית ואנזימטית משולבת של רקמת היפוקמפל במוח העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: למד פרוטוקול דיסוציאציה אנזימטית ומכנית משולבת לרקמת היפוקמפל ממוח עכבר C57BL/6J. השיטה מייצרת תלייה תאית בעלת רמת חיות גבוהה לניתוח תפקוד תאי ומנגנוני טיפול במחלות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאיימי רוג'רס על מתן הדרכה מעשית ותמיכה מתמשכת במוצרים. אנו מודים לד"ר אמנדה בורק על פתרון הבעיות וההבהרה המתמשכים של הדיונים. אנו מודים למרדית יוהיים ולקבוצת התקשורת המדעית של UAMS על העריכה והעיצוב הדקדוקיים של כתב יד זה. מחקר זה נתמך על ידי NIH R25GM083247 ו- NIH 1R01CA258673 (A.R.A).

הניסויים נערכו בהתאם לסטנדרטים האתיים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת UAMS. נקבה בת 6 חודשים C57Bl6/J של עכברים מסוג בר נרכשו ושוכנו בקבוצות (4 עכברים לכלוב) תחת מחזור קבוע של 12 שעות של אור/חושך.
1. הכנת ריאגנטים
<ol><li>הכינו תמיסת מלאי כתמים חיים/מתים הניתנת לתיקון. שחזרו את הכתם הפלואורסצנטי עם 20 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO).</li>
	<li>עטפו את הבקבוקון בנייר כסף, תייגו אותו כ-"Reconstituted", ואחסנו אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים.</li>
	<li>מכינים תמיסת מלח של 0.9% עם הפרין. דיללו את תכולתו של בקבוקון אחד של נתרן הפרין (10,000 יחידות USP לכל 10 מ"ל) ב-1 ליטר של מים מזוקקים כפולים (ddH2O).</li>
	<li>הכן מספיק עבור כ 45 מ"ל לכל חיה ולאחסן ב 4 ° C למשך עד שבוע.</li>
	<li>הפוך 1% paraformaldehyde (PFA).<ol>
<li>במכסה אדים, מחממים צלחת חמה ל-50 מעלות צלזיוס. במיקרוגל, מחממים 100 מ"ל של ddH2O בכוס זכוכית לכ-60 מעלות צלזיוס. הוסיפו מוט ערבוב מגנטי והעבירו לפלטה החמה.</li>
		<li>במכסה האדים, שוקלים 1 גרם של PFA ומוסיפים לכוס של ddH2O. מוסיפים 0.1125 גרם של גבישי NaOH ומערבבים עד להמסה (5-10 דקות).</li>
		<li>מוסיפים 0.4 גרם של NaPO4- מונובאסי ומערבבים עד להמסה (2-5 דקות). ואקום מסנן את התמיסה והתאים את ה-pH ל-7.4 עם HCl ו-NaOH.</li>
		<li>מצננים על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני האחסון. הערה: ניתן לאחסן Aliquots של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של -20 °C (75 °F) למשך שנה אחת. הימנעו ממחזורי הפשרה בהקפאה. אם, לאחר ההפשרה, התמיסה הופכת לעכורה או שנוצר משקע, אין להשתמש בתמיסה. אזהרה: רעיל, דליק. תמיד לעבוד עם PFA מתחת למכסה מנוע מאוורר כשהוא לובש ציוד מגן אישי מתאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אנזים ליופילי A עם 1 מ"ל של חיץ A. אל תסובבו את הפתרון. הערה: אנזים A ו-Buffer A, כמו גם Buffers A, Y ו-Z, הם ריאגנטים בערכת הדיסוציאציה המסחרית של המוח למבוגרים17.</li>
	<li>מחלקים את אנזים P לאליקוטים של 50 μL ומחזירים את אנזים A ל-10 μL aliquots. לפי הוראות הערכה, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. הימנעו ממחזורי הפשרה בהקפאה.</li>
</ol>2. יום הניסוי
<ol><li>מצנן את הצנטריפוגה השולחנית ל-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>יש להניח את ה-aliquot(ים) של PFA במקרר להפשרה הדרגתית.</li>
	<li>הניחו את הכתם החי/מת המשוחזר בחושך (למשל, מגירה) כדי להפשיר בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מכינים את מאגר אלבומין בסרום בקר (BSA). הוסיפו 0.5 גרם של BSA ל-100 מ"ל של תמיסה 1x של דולבקו עם מאגר פוספט ללא סידן ומגנזיום (D-PBS), pH 7.2.</li>
	<li>מוסיפים מוט ערבוב ומערבבים על צלחת ערבוב למשך 30 דקות. מעבירים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הערה: השתמש תמיד במאגר BSA שהוכן טרי.</li>
	<li>הכינו דילול עבודה של כתם חי/מת. הוסיפו 1 μL של תמיסת מלאי הכתמים החיים/מתים המשוחזרת ל-360 μL D-PBS ואחסנו אותה בחושך (למשל, מגירה או קופסה) בטמפרטורת החדר. הכן 50 μL של דילול העבודה לכל מדגם.</li>
</ol>3. פרפוזיה
<ol><li>מניחים את תמיסת המלח עם הפרין על הקרח.</li>
	<li>הפעל חמצן, הגדר את כדור מחוון מד הזרימה במערכת אידוי הרדמה של בעלי חיים קטנים ל-1 ליטר לדקה. ודא שיש לחץ חמצן ואיזופלורן מספיקים.</li>
	<li>התאם את חוגת מכשיר האידוי ל-3.5% (לצורך אינדוקציה ותחזוקה).</li>
	<li>הקדמו את קווי משאבת הזלוף בעזרת תמיסת המלח/הפרין. הגדר את המהירות ל- 6 מ"ל לדקה.</li>
	<li>הניחו את העכבר בתא האינדוקציה, הפעילו את מכשיר הנשימה והמתינו מספר דקות עד שהעכבר לא מגיב. לאשר עומק מספיק של הרדמה באמצעות היעדר נסיגה דוושה לצביטה מזיקה.</li>
	<li>הניחו את העכבר על גבו על מגש הנתיחה עם אפו בקונוס האף. בצע אישור משני של הרדמה מלאה באמצעות היעדר נסיגה מדוושה לצביטה מזיקה. הצמידו את כל ארבע כפות הרגליים למגש.</li>
	<li>מרססים את בטנה של החיה ב-20% אתנול.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, לצבוט את הבטן התחתונה ולהרים את העור. השתמש במספריים כדי לחתוך דרך פרווה ועור לתחתית בית החזה.</li>
	<li>בצע שני חתכים אלכסוניים מתחת לכל צלעות לכיוון כל כתף.</li>
	<li>בזהירות לנתח את הסרעפת (הימנעות הריאות והלב). נתחו את הצלעות כדי לחשוף את הלב.</li>
	<li>נתקו בזהירות כל רקמת חיבור סביב הלב. הערה: שלבים 3.10-3.11 הם קריטיים; לבצע במיומנות ובמיומנות.</li>
	<li>השתמש במספריים כדי לחתוך את האטריום הימני (אונה כהה בפינה השמאלית העליונה של הלב). כבה את זרימת האיזופלורן לנשימה.</li>
	<li>החזיקו את הלב יציב עם מלקחיים. כאשר שיפוע מחט הפרפר פונה כלפי מעלה, חודרים את החדר השמאלי תוך שמירה על מפלס המחט ומקביל לחיה.</li>
	<li>החזיקו את המחט במקומה, הפעילו את המשאבה והניחו לפחות 30 מ"ל של תמיסת המלח/הפרין עד שהנוזל היוצא מהלב אטום וצבע הכבד והריאות מחווירים בצבעם. הערה: שלבים 3.13-3.14 הם קריטיים; לבצע במיומנות ובמיומנות.</li>
	<li>כבה את המשאבה, הסר את המחט והעביר את העכבר לאזור הנתיחה.</li>
</ol>4. דיסקציה
<ol><li>באמצעות מספריים כירורגיים גדולים, ערפו את הראש.</li>
	<li>חותכים את הפרווה מהחלק האחורי של הראש עד לעיניים. מקלפים את העור בחזרה כדי לחשוף את הגולגולת.</li>
	<li>גזרו את הגולגולת בין העיניים. בצע שני חתכים בחלק האחורי של הגולגולת, בתנוחות השעה 10 ו-2, ולאחר מכן בצע חתך אחד ארוך (שמור על קצוות למעלה כדי למנוע פגיעה במוח) לאורך הקו האמצעי של הגולגולת עד לחתך המקורי בין העיניים.</li>
	<li>השתמשו במלקחיים כדי לקלף את שני חצאי הגולגולת לצדדים. השתמשו במרית כדי להסיר את המוח ולהכניס אותו לתוך צלחת פטרי מזכוכית בקוטר 60 מ"מ על קרח מלא ב-D-PBS קר (איור 1).</li>
	<li>השתמש באזמל או סכין גילוח כדי להפריד כל חצי כדור. לאחר מכן להסיר את נורות חוש הריח ואת המוח הקטן.</li>
	<li>השתמש במלקחיים כדי להסיר את המוח האמצעי עד שההיפוקמפוס נחשף.</li>
	<li>אבטח את המוח באמצעות מלקחיים. באמצעות קבוצה שנייה של מלקחיים, מקניטים בעדינות את ההיפוקמפוס מכל חצי כדור, ומעבירים את שני ההיפוקמפי לצינור 1.5 מ"ל המסומן 1.5 מ"ל המכיל D-PBS קר.</li>
	<li>הניחו את צינור הדגימה המכיל את שני ההיפוקמפי מהעכבר על הקרח.</li>
</ol>5. הכינו תערובת אנזימים 1 ו-2 לכל דגימה
הערה: עבור נפחים הגדולים מ-2 מ"ל, השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מ"ל; עבור נפחים, 200 μL-2 מ"ל, להשתמש פיפטה 1000 μL; עבור נפחים, 21-199 μL, להשתמש פיפטה 200 μL; עבור נפחים, 2-20 μL, להשתמש פיפטה 20 μL; עבור נפחים מתחת ל-2 μL, השתמש בפיפטה של 0-2 μL.
<ol><li>עבור כל דגימה, הפשירו אליקוט אחד לכל אחד מאנזים P ואנזים A בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>עבור תערובת אנזימים 1, שלבו 50 μL של אנזים P ו-1900 μL של Buffer Z בצינור C המסומן (טבלת חומרים).</li>
	<li>עבור תערובת אנזימים 2, הוסיפו 20 μL של Buffer Y ל-10 μL המופשרים של אנזים A.</li>
</ol>6. פרוטוקול דיסוציאציה מוחית למבוגרים17
הערה: בעת עבודה עם דגימות, יש למקם צינורות במדף צינורות בטמפרטורת החדר בעוד BSA ו- D-PBS נשארים על קרח אלא אם כן צוין אחרת.
<ol><li>הפעל את הדיסוציאטור.</li>
	<li>השתמש במלקחיים כדי להעביר את חלקי הרקמה של ההיפוקמפי לצינור C.</li>
	<li>מעבירים 30 μL של תערובת אנזימים 2 לתוך צינור C. סובבו את המכסה עד שהמתח מורגש, ואז התהדקו עד שהוא לוחץ.</li>
	<li>מקם את צינור C הפוך למצב של הדיסוציאטור; לדוגמה יוקצה המצב 'נבחר' (איור 2). אבטחו את התנור מעל צינור C.</li>
	<li>הקש על סמל התיקיה, בחר תיקיית מועדפים , גלול אל ובחר את התוכנית 37C_ABDK_02 . לחץ על אישור כדי להחיל את התוכנית על כל צינורות C שנבחרו, ולאחר מכן הקש על התחל (איור 2).</li>
	<li>סמן צינור חרוטי אחד של 50 מ"ל לכל דגימה.</li>
	<li>הניחו מסננת של 70 מיקרומטר על כל צינור חרוטי של 50 מ"ל ורטובה עם 2 מ"ל של חיץ BSA.</li>
	<li>עם סיום התוכנית, הסר את התנור ואת צינור C מן dissociator.</li>
	<li>הוסף 4 מ"ל של חיץ BSA לדגימה והחיל את התערובת על מסננת התא על הצינור החרוטי 50 מ"ל.</li>
	<li>מוסיפים 10 מ"ל של D-PBS לצינור C, סוגרים אותו ומסובבים את התמיסה בעדינות. יש למרוח אותו על מסננת התאים על הצינור החרוטי 50 מ"ל.</li>
	<li>יש להשליך את מסננת התא ואת צינור C. צנטריפוגה את המתלים ב 300 x g למשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F). לאחר מכן, שאפו והשליכו את הסופרנאטנט.</li>
</ol>7. פינוי פסולת
<ol><li>בצעו החייאה של הכדור עם 1550 μL של D-PBS קר והעבירו את המתלים לצינור חרוטי מסומן של 15 מ"ל.</li>
	<li>הוסיפו 450 μL של תמיסת הסרת פסולת קרה ופיפטה למעלה ולמטה (אין מערבולת). הערה: פתרון להסרת פסולת הוא מגיב בערכת הדיסוציאציה של בריאן למבוגרים המסחרית17.</li>
	<li>שכבו בעדינות 1 מ"ל של D-PBS קר על גבי מתלה התא, והשאירו את הקצה על דופן הצינור החרוטי. חזור על הפעולה עד שהשכבה הכוללת תהיה 2 מ"ל. הערה: שלב זה הוא קריטי; לבצע במיומנות ובמיומנות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 3000 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C עם האצה מלאה ובלם מלא. הערה: אם השלבים אינם מופרדים בבירור, חזור על שלבים 7.2-7.3. צנטריפוגה בפעם האחרונה ב 1000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>המתלים צריכים כעת להיות מורכבים משלוש שכבות נפרדות (איור 3). שאפו לשכבה העליונה ביותר. יש לטאטא את קצה הפיפטה קדימה ואחורה כדי לשאוף לשכבת האמצע הלבנה. הסר כמה שיותר מהשכבה האמצעית מבלי להפריע לשכבה התחתונה ביותר. הערה: שלב זה הוא קריטי; לבצע במיומנות ובמיומנות.</li>
	<li>הוסיפו 2 מ"ל של D-PBS קר ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 1000 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C עם האצה מלאה בלם מלא. לשאוף ולהשליך את ה-supernatant. החזירו את הכדור ב-1 מ"ל של חיץ BSA. הערה: ניתן לבצע שימוש חוזר בתאים במאגר המתאים ולאחר מכן לתייג ולבודד אותם באופן מגנטי כהכנה לריצוף של תא יחיד בשלב זה.</li>
</ol>8. ספירת תאים
<ol><li>בצע ספירת תאים בהתאם לפרוטוקול היצרן של מונה התאים הזמין (אפשרות אחת מצוינת בטבלת החומרים)</li>
</ol>9. כתם חי/מת
<ol><li>צנטריפוגה 900 μL הנותרים (מ 7.7) ב 1000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C עם תאוצה מלאה בלם מלא.</li>
	<li>בזמן שהדגימה מסתובבת, סמן צינור זרימה אחד לכל דגימה ועטף אותו בנייר כסף כדי להגביל את החשיפה לאור.</li>
	<li>לשאוף ולהשליך את ה-supernatant.</li>
	<li>בצעו החייאה של הכדור ב-50 μL של כתם חי/מת מדולל (שהוכן בעבר). הערה: שלב זה אמור להתבצע בתאורה חלשה. כבה את אורות החדר העיליים כדי להשיג זאת.</li>
	<li>מעבירים כל דגימה לצינור הזרימה המסומן המתאים ומדגרים בטמפרטורת החדר למשך 8-10 דקות בחושך (למשל, מגירה או קופסה).</li>
	<li>הוסף 500 μL של בופר BSA וצנטריפוגה ב 1000 x g למשך 10 דקות ב 4 °C עם האצה מלאה ובלם מלא.</li>
	<li>לשאוף ולהשליך את ה-supernatant. הערה: ייתכן שהכדור לא יהיה גלוי; להשאיר כמות קטנה של חיץ מאחור כדי לא לשאוף בלי כוונה את הכדור. ניתן לבצע שימוש חוזר בתאים במאגר המתאים, להיחסם ולהכתים אותם בנוגדנים ספציפיים לתאים בשלב זה. ראה קובץ משלים 1 לפרוטוקול לדוגמה18.</li>
</ol>10. קיבוע (אופציונלי)
<ol><li>בצעו החייאה של הכדור ב-200 μL של 1% PFA (שהוכן בעבר). אינקובציה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשטוף על ידי הוספת 500 μL של D-PBS וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F).</li>
	<li>לשאוף את הסופרנאטנט. הערה: ייתכן שהכדור לא יהיה גלוי; להשאיר כמות קטנה של חיץ מאחור כדי לא לשאוף בלי כוונה את הכדור.</li>
	<li>בצעו החייאה של הכדור ב-200 μL של D-PBS ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים.</li>
</ol>11. ציטומטריית זרימה
<ol><li>סמן את מכסי המסנן בצינורות החדשים.</li>
	<li>באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, פיפטה כל דגימה על מכסה המסנן.</li>
	<li>צנטריפוגה לזמן קצר ב 200 x g ב 4 ° C, רק מאפשר צנטריפוגה להגיע 200 x g לפני עצירת הריצה.</li>
	<li>המשך לזרימה של ליבת ציטומטריה לניתוח במורד הזרם.</li>
</ol>

<ol><li>Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndersen%2C+P+%22The+Hippocampus+Book%22">The Hippocampus Book</a>. , Oxford University Press, Inc. (2007).</li>
<li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+influence+on+neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).</li>
<li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Functional+Implications+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li>
<li>Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult hippocampus.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812(2015).</li>
<li>Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mammalian+neural+stem+cells+and+neurogenesis%3A+Five+decades+later%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later.</a> Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+microglia+on+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Effects of microglia on neurogenesis.</a> Glia. 63, 1394-1405 (2015).</li>
<li>Lee, V. M., Scientist, S., Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neural stem cells. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf">http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf</a> (2015).</li>
<li>Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+in+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Signaling in adult neurogenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).</li>
<li>Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+hippocampus%3A+history%2C+regulation%2C+and+prospective+roles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles.</a> International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).</li>
<li>Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+stem+cells+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of stem cells in the hippocampus.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).</li>
<li>Abbott, L. C., Nigussie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medicine+Series+C%3A+Anatomia+Histologia+Embryologia%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus.</a> Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).</li>
<li>Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+precursors+using+magnetic+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting.</a> Methods in Molecular Biology. 1283, Clifton, N.J. 137-145 (2015).</li>
<li>Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+analysis+of+multiple+surface+markers+expressed+on+rat+neural+stem+cells+using+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays.</a> Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).</li>
<li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).</li>
<li>Volovitz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-aggressive%2C+highly+efficient%2C+enzymatic+method+for+dissociation+of+human+brain-tumors+and+brain-tissues+to+viable+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells.</a> BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).</li>
<li>Reiß, S., Herzig, I., Schmitz, J., Bosio, A., Pennartz, S. Semi-automated tissue dissociation and preserved epitope integrity optimize immunomagnetic sorting of neural cells. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.miltenyibiotec.com">www.miltenyibiotec.com</a> (2021).</li>
<li>Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf">https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf</a> (2020).</li>
<li>Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html">https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html</a> (2021).</li>
<li>Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CytoML+for+cross-platform+cytometry+data+sharing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">CytoML for cross-platform cytometry data sharing.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).</li>
<li>Turaç, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+flow+cytometric+analysis+of+surface+and+intracellular+antigens+reveals+surface+molecule+markers+of+human+neuropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis.</a> PLoS One. 8, 1-14 (2013).</li>
<li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescence+activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537(2015).</li>
<li>Brummelman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((application+and+computational+analysis+of+high-dimensional+fluorescent+antibody+panels+for+single-cell+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry.</a> Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).</li>
<li>Recommended controls for flow cytometry. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry">https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry</a> (2021).</li>
<li>Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf">https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf</a> (2021).</li>
<li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).</li>
<li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109, 11-26 (2021).</li>
<li>Ho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+single-cell+transcriptomics+in+adult+rodent+brain%3A+The+medium+spiny+neuron+transcriptome+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+technologies+in+studying+brain+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Novel technologies in studying brain immune response.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566(2021).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+atlas+of+the+mouse+brain+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).</li>
<li>Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+Surface+markers+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: Surface markers and beyond.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).</li>
<li>O'Connor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+flow+cytometry+for+biochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The relevance of flow cytometry for biochemical analysis.</a> IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized.+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241(2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מספר שלבים בפרוטוקול דיסוציאציה עצבית זו דורשים טכניקה מיומנת ומיומנות – פרפוזיה, שאיפה סופרנאטית והסרת מיאלין. לאורך כל תהליך הזלוף, האיברים הפנימיים חייבים להישאר שלמים (מלבד הסרת הסרעפת וגזירת הלב); זה כולל הימנעות מהחדרים העליונים של הלב עם מחט הפרפר. בעוד שכמות המלח עם הפרין הדרושה משתנה, נוזל שקוף הזורם מהלב מעיד על כך שהתהליך הושלם. המוח חייב להיות חדור לחלוטין ונכון, ואז הוא ייראה מחוץ ללבן (איור 1). עם זלוף, שלב הסרת תאי הדם האדומים הופך להיות חיצוני, ומבטל מניפולציה עודפת של הדגימו...

ההיפוקמפוס תואר לראשונה על ידי אנטומיסט בולונזי, ג'וליו צ'זארה ארנציו, בשנות ה-1500 שלהמאה ה-15. במתן שם למבנה החדש הזה, ארנציו ככל הנראה קיבל השראה מהדמיון המובהק שלו לסוסון הים של הסוג היפוקמפוס1. ההיפוקמפוס מעורב בתגובות עקה אך ידוע בתפקידו בלמידה ובזיכרון. ליתר דיוק, ההיפוקמפוס אחראי על קידוד ואחזור של זיכרון הצהרתי ומרחבי1.
ההיפוקמפוס, או ההיפוקמפוס עצמו, מחולק לתת-שדות CA1 (cornu ammonis), CA2 ו-CA31. בהשוואה לשאר מערכת העצבים, להיפוקמפוס יש מספר מאפיינים מגדירים ייחודיים, כולל הפלסטיות שלו והפוטנציאל לנוירוגנזה מתמשכת2. נוירוגנזה היא תהליך ההתפשטות וההתמיינות של תאי גזע עצביים, ולאחר מכן השתלבותם ברשת העצבית הקיימת. נוירוגנזה מוגבלת לאזור התת-גרנולרי של הג'ירוס המשונן ולאזור התת-חדרי של החדרים הצדדיים (ונורות חוש הריח)3. בעוד שנוירוגנזה נפוצה באמבריוגנזה, זהו תהליך לכל החיים 3,4. ככזה, דיון זה יתמקד בנוירוגנזה של מבוגרים בהיפוקמפוס.
האזורים התת-חדריים והתת-גרנולאריים הם נישות נוירוגניות המכילות תאים אפנדימליים וסקולריים, כמו גם שושלות לא בוגרות ובשלות של תאי גזע עצביים5. מיקרוגליה תורמת לנישות אלה כתאי מערכת החיסון לווסת את הנוירוגנזה6. תאי אב עצביים הם צאצאים של תאי גזע עצבייםשאינם תאי מערכתם של תאי גזע עצביים 7. שלושה סוגים של אבות עצביים נמצאים באזור התת-חדרי: תאים דמויי גליה רדיאליים מסוג B, אבות מגבירי מעבר מסוג C ונוירובלסטים מסוג A 3,8. תאי האב העצביים מסוג B המתחלקים באיטיות באזור התת-חדרי יכולים להתמיין לתאים מסוג C המתחלקים במהירות8. לאחר מכן, תאים מסוג C מתמיינים לתאים מסוג A8. נוירובלסטים אלה נודדים דרך הזרם הנודד הרוסטרלי אל נורת חוש הריח לפני שהם מתמיינים לאינטרנאורונים או לאוליגודנדרוציטים9. פקעות חוש הריח האלה הן המפתח לזיכרון לטווח קצר של חוש הריח, וללמידה אסוציאטיבית, בעוד שהאוליגודנדרוציטים מיאלינטים אקסונים של קורפוס קלוסום9. רוב הנוירוגנזה הבוגרת מתרחשת באזור התת-גרנולרי של הפיתול המשונן, שם נמצאים אבות עצביים רדיאליים מסוג 1 ו-nonradial Type 23. רוב תאי האב העצביים מיועדים להפוך לנוירונים גרגיריים משוננים ואסטרוציטים10. מחוברים על ידי צמתים מרווחים, אסטרוציטים יוצרים רשתות כדי לווסת את הפלסטיות, הפעילות הסינפטית וההתרגשות העצבית5. כנוירון המעורר העיקרי של הפיתול המשונן, תאי גרגירים מספקים קלט מקליפת המוח האנטורינלית לאזור CA311.
ניתן לבודד אוכלוסיות תאי גזע עצביים באמצעות אסטרטגיות בידוד אימונומגנטיות או אימונופלואורסצנטיות12,13. רקמה עצבית קשה במיוחד לניתוק; מאמצים לעשות זאת גורמים לעתים קרובות לדגימות עם כדאיות תאית ירודה ו/או לא מצליחים לייצר את ההשעיה החד-תאית הדרושה לניתוח במורד הזרם. דיסוציאציה עצבית יכולה להתבצע באמצעות דיסוציאציה מכנית (כגון שימוש במסננים, טכניקות חיתוך או טריטורציה של פיפטה), עיכול אנזימטי, או שילוב של טכניקות14,15. במחקר שהעריך שיטות דיסוציאציה עצבית, הכדאיות והאיכות של דיסוציאציה מכנית ידנית על ידי טריטורציה פיפטה לעומת שילובים של טריטורציה פיפטה ועיכול עם אנזימים שונים הושוו15. האיכות דורגה על סמך כמות גושי התאים והדנ"א או הפסולת התת-תאית בתרחיף המוכן15. השעיות של גידולי גליה שהיו נתונים לדיסוציאציה מכנית ידנית בלבד היו בעלות יכולת נמוכה משמעותית של התאים בהשוואה לטיפולים עם דיספוזה או שילוב של DNase, collagenase ו-hyaluronidase15. Volovitz et al. הכירו בשונות הכדאיות והאיכות בין השיטות השונות והדגישו כי דיסוציאציה לא מספקת עלולה להפחית את הדיוק של ניתוח במורד הזרם15.
במחקר נפרד, המחברים השוו יותר מ-60 שיטות ושילובים שונים של דיסוציאציה של תאי עצב בתרבית14. שיטות אלה כללו שמונה וריאציות שונות של דיסוציאציה מכנית ידנית על ידי טריטורציה של פיפטה, השוואה של דגירה עם חמישה אנזימים בודדים בשלושה מרווחי זמן שונים, ושילובים שונים של דיסוציאציה מכנית עם עיכול אנזימטי או שילוב של שני אנזימים14. אף אחת מהשיטות המכניות לא הניבה השעיה חד-תאית14. ארבעה מהטיפולים באנזים יחיד, עשרה מהטיפולים האנזימטיים המשולבים וארבעה מהשילובים של דיסוציאציה מכנית עם עיכול אנזימטי הניבו תרחיף חד-תאי14. עיכול אנזימטי עם TripLE ואחריו Tripsin-EDTA ביעילות היעילה ביותר ניתוק דגימות14. אגב, דגימות שטופלו ב-TrypLE ו/או ב-Trypsin-EDTA נטו ליצור גושים ג'לטיניים14. בעוד שמחקר זה בוצע על תאים בתרבית, הוא מדבר על החסרונות של טריטורציה פיפטה או עיכול אנזימטי בלבד.
חסרות השוואות זו לצד זו של דיסוציאציה מכנית ידנית לעומת אוטומציה. עם זאת, קבוצה אחת הפעילה ציטומטריית זרימה כדי להשוות דיסוציאציה מכנית ידנית ואוטומטית למחצה של מוחות עכברים שלמים בשילוב עם ערכות דיסוציאציה אנזימטיות מסחריות של פפאין או טריפסין16. עיבוד עם הדיסוציאטור הניב באופן עקבי יותר תאים בני קיימא16. בעקבות הדיסוציאציה, החוקרים בודדו גם תאי פרומינין-1, תאים מקדימים עצביים ומיקרוגליה16. עבור שתיים מתוך שלוש אוכלוסיות התאים המבודדים, טוהר התאים המבודדים היה מעט גבוה יותר כאשר הדגימות עובדו עם הדיסוציאטור, בהשוואהל-16 באופן ידני. Reiß et al. ציינו כי השתנות מאדם לאדם בטכניקת הצינורות מעכבת את יכולת השכפול של תפוקת אוכלוסיית התאים בת-קיימא בדיסוציאציה של רקמות16. החוקרים הגיעו למסקנה כי דיסוציאציה מכנית אוטומטית מתקננת עיבוד דגימות16.
שיטת הדיסוציאציה המתוארת בכתב יד זה היא שילוב של דיסוציאציה מכנית אוטומטית לחלוטין ועיכול אנזימטי, תוך שימוש בתמיסות המלוות בערכת דיסוציאציה מסחרית של המוח הבוגר17. בניגוד לפרוטוקולים סטנדרטיים, פרוטוקול מותאם זה מפחית מניפולציה של דגימות, מניב תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר ומיועד לעיבוד כמויות מינימליות של רקמת התחלה.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-682-003</td><td>Basix, צבע מגוון</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות בז</td><td>בקטון דיקינסון מעבדה אירופה</td><td>352009</td><td>פוליסטירן</td></tr><tr><td>25 מ"ל צנרת סרולוגית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-955-235</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגול</td><td>פלקון</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>500 מ"ל מסנן ואקום/אחסון מערכת בקבוקים</td><td>קורנינג</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; מסננת תאים m</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>ערכת דיסוציאציה למוח למבוגרים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>&nbsp; 130-107-677</td><td>מכיל אנזים P, מאגר Z, מאגר Y, אנזים A, מאגר A, תמיסת הסרת פסולת</td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ACSA-2-PE-Vio770, עכבר, שיבוט REA969</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-116-246</td><td></td></tr><tr><td>חלבון בסיסי נגד מיאלין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3821-100UG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSA-NCAM-PE, אדם, עכבר וחולדה, שיבוט 2-2B</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-117-394</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRמוצר</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-VioBlue, עכבר, שיבוט REA592</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-810</td><td></td></tr><tr><td>CD31 נוגדן</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-541</td><td></td></tr><tr><td>קרמיקה פלטה חמה בוחש</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11-100-100SH</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פארמקו מאת Greenfield Global</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>זלוף</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD</td><td></td> <td>(v10.7.0)</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator עם מחממים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1X)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-555-25A</td><td></td></tr><tr><td>הפרין נתרן</td><td>Fresenius Kabi</td><td>504011</td><td></td></tr><tr><td>LIVE / DEAD ניתן לתיקון ערכת כתמי תאים מתים</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>מגנטי לערבב בר</td><td>פישר מדעי</td><td>14-513-51</td><td></td></tr><tr><td>Noyes מספריים אביב</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>15012-12</td><td>דיסקציה</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>441244-3KG</td><td>פריל, 95%</td></tr> <tr><td>קצות פיפטה GP LTS 20 ומיקרו; L 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389270</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטות GP LTS 250 ומיקרו; L 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389277</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטות RT LTS 1000 ומיקרו; L FL 768A/8</td><td>Rainin</td><td>30389213</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 &mu; L)</td> <td>Rainin</td><td>30386597</td><td></td></tr><tr><td>RBXMO FITC XADS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16167</td><td></td></tr><tr><td>דלי קרח עגול עם מכסה</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-129</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תחתונים עגולים עם מכסה מסננת תאים</td><td>Falcon</td><td>100-0087</td><td></td></tr><tr><td>S1 מילוי פיפט</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>9541</td><td></td></tr><tr><td>מרית & כלי</td><td>בדיקה מדעיים עדינים</td><td>10090-13</td><td>דיסקציה & </td></tr><tr><td>סט עירוי מכונף Perfusion Surflo 23 גרם x 3/4 אינץ'</td> <td>Termuno</td><td>SV-23BLK</td><td></td></tr><tr><td>מתלה מבחנת</td> מחט פרפר <td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-809-37</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Legend XTR צנטריפוגה</td><td>ThermoFisher</td><td>הופסק</td><td>או צנטריפוגה סטנדרטית אחרת על השולחן</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית בזרימה משתנה</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>דגם זרימה נמוכה</td></tr><tr><td>ערכת התחלה של VetFlo לעכברים</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>VetFlo-MSEKIT</td><td>מסכת הרדמה, צינורות, תא אינדוקציה, מיכלי פחם</td></tr><tr><td>VetFlo וופורייזר מערכת הרדמה חד ערוצית</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>VetFlo-1210S</td><td>0.2&ndash; 4 LPM</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR מנתח כדאיות תאים</td><td>בקמן קולטר מדעי החיים</td><td>731196</td><td>ספירת תאים</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR 4 שקיות של בקבוקוני דגימה</td><td>בקמן קולטר מדעי החיים</td><td>383721</td><td>ספירת תאים</td></tr></tbody></table>

דיסוציאציה מכנית ואנזימטית משולבת של רקמת היפוקמפל במוח העכבר

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

פרוטוקול דיסוציאציה עצבית זה (התאמה של הפרוטוקול המלווה בערכת דיסוציאציה מסחרית של המוח הבוגר) מייעל את עיבוד הרקמות כהכנה לניתוח מפורט במורד הזרם כגון ציטומטריה של זרימה או ריצוף של תא בודד. דיסוציאציה עצבית יכולה להתבצע באמצעות דיסוציאציה מכנית (כגון שימוש במסננים, טכניקות חיתוך או טריטורציה של פיפטה), עיכול אנזימטי או שילוב שלהם. האופי העדין של תאי העצב יכול לסבך את המאמצים להשיג את ההשעיה החד-תאית האמיתית, בעלת הכדאיות הגבוהה ביותר, עם פסולת תאית מינימלית הנדרשת לניתוח של תאים בודדים. הנתונים מראים כי שילוב זה של דיסוציאציה מכנית אוטומטית ועיכול אנזימטי מניב באופן עקבי תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר (>90%), תוך התגברות על הקשיים הנ"ל. בעוד שכמה מהשלבים דורשים מיומנות ידנית, שלבים אלה מפחיתים את הטיפול בדגימות ואת אובדן התא הפוטנציאלי. כתב יד זה מפרט כל שלב בתהליך כדי לצייד מעבדות אחרות כדי לנתק בהצלחה כמויות קטנות של רקמות עצביות כהכנה לניתוח במורד הזרם.

הדגימות עובדו באמצעות ציטומטר זרימה במתקן ליבה, והנתונים שהתקבלו הוערכו באמצעות חבילת תוכנה לניתוח זרימה. בעבר נותחו בקרות פיצויים - הכתם החי/מת והשליטה השלילית. אם נעשה שימוש במספר פלואורוכרומים, יש להכין בקרות פלואורסצנטיות מינוס אחת (FMO) ובקרות של כתם יחיד עבור כל נוגדן. הפיצוי על החפיפה הספקטרלית של דגימות הניסוי חושב על סמך הפקדים שנותחו. לצורך זיהוי אוכלוסיית התאים, נעשה שימוש באסטרטגיית גידור היררכית. השער הראשי לא כלל פסולת בחלקת הפיזור הקדמי (גודל התא) לעומת הפיזור הצדדי (גרעיניות)19,20<...

פרוטוקול דיסוציאציה של תאים עצביים זה מיועד לדגימות עם כמות נמוכה של חומר התחלתי ומניב תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר לניתוח במורד הזרם, עם שלבי קיבוע וצביעה אופציונליים.

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

ניתוק מוצלח של כמויות קטנות של רקמות עצביות יכול לצייד את המעבדות כדי לקבל תובנות ספציפיות למבנה לגבי יעילות הטיפול, תפקוד התאים, כמו גם מנגנוני פעולה של מחלות וטיפול. פרוטוקול דיסוציאציה עצבית זה מניב באופן עקבי תרחיף חד-תאי ממשי וממשי ביותר. בנוסף, אנו יכולים לעבד דגימות שהן רק חלק קטן מאלו שהערכות המסחריות מיועדות להן.תכנון והכנה נכונים הם המפתח לתוצאה מוצלחת עבור טכניקה זו. הפעלת מספר סבבי תרגול כדי להכיר את הפרוטוקול תועיל. לאחר המרדים עכבר C57BL/6J בן שישה חודשים, צובטים את הבטן התחתונה ומרימים את העור באמצעות מלקחיים.לאחר מכן באמצעות מספריים, לחתוך דרך הפרווה והעור לתחתית הצלעות. בצע שני חתכים אלכסוניים המתחילים מתחת לצלעות ונעים לכיוון כל כתף. לאחר מכן לנתח בזהירות את הסרעפת ואת הצלעות כדי לחשוף את הלב.לאחר הסרה קפדנית של כל רקמת חיבור סביב הלב, השתמש במספריים כדי לחתוך את האטריום הימני. לאחר מכן כבו את זרימת האיזופלורן אל מכשיר הנשימה. החזקת הלב יציב עם מלקחיים ועם שיפוע מחט הפרפר הפונה כלפי מעלה, חודרים את החדר השמאלי תוך שמירה על רמת המחט ומקבילה לחיה.לאחר מכן, מחזיקים את המחט במקומה, מפעילים את המשאבה ומנקבים לפחות 30 מיליליטרים של תמיסת המלח או הפרין עד שהנוזל היוצא מהלב אטום והכבד והריאות מחווירים בצבעם. לאחר הזלפה, כבו את המשאבה, הסירו את המחט והעבירו את העכבר לאזור הנתיחה. לאחר העריפה, חתכו את הפרווה מהחלק האחורי של הראש עד לעיניים וקלפו את העור בחזרה כדי לחשוף את הגולגולת.לאחר מכן, גזרו את הגולגולת בין העיניים ובצעו שני חתכים בחלק האחורי של הגולגולת בתנוחות של 10 ו-2. לאחר מכן בצע חתך אחד ארוך לאורך הקו האמצעי של הגולגולת עד לחתך המקורי בין העיניים. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים, לקלף את שני חצאי הגולגולת לצדדים.לאחר מכן השתמשו במרית כדי להסיר את המוח והניחו אותו בצלחת פטרי 60 מילימטרים מזכוכית מלאה ב-DPBS קר ונשמרת על קרח. באמצעות אזמל או סכין גילוח, להפריד כל חצי כדור ולהסיר את נורות חוש הריח ואת המוח הקטן. לאחר מכן מסירים את המוח האמצעי עד שההיפוקמפוס נחשף.לאחר מכן, אבטח את המוח עם מלקחיים. לאחר מכן, בעזרת סט שני של מלקחיים, הקניטו בעדינות את ההיפוקמפוס מכל חצי כדור. מעבירים את שני ההיפוקמפי לצינור 1.5 מיליליטר המסומן בכיסא המכיל DPBS קר ומניחים את הצינור על קרח.באמצעות מלקחיים, מעבירים את חלקי הרקמה של ההיפוקמפי לצינור C ומוסיפים 30 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים 2 לצינור. לאחר סיבוב הכובע והידוק עד שהוא לוחץ, מניחים את הצינור בדיסוציאטור ומפעילים את התוכנית המתאימה. בזמן שהתוכנית פועלת, הרטיבו מראש מסננת של 70 מיקרון על גבי צינור חרוטי של 50 מיליליטר עם שני מיליליטרים של מאגר BSA.לאחר השלמת תוכנית הדיסוציאציה, הוסיפו ארבעה מיליליטרים של חיץ BSA לרקמה המנותקת וסננו את התערובת דרך מסננת התאים בצינור החרוטי 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטרים של DPBS לצינור C. לאחר מכן סגרו את הצינור, סובבו את התמיסה בעדינות, וסננו אותה דרך מסננת התאים בצינור החרוטי 50 מיליליטר.צנטריפוגה של תרחיף התא המסונן, השליכו את ה-supernatant מבלי להפריע לכדור ואחסנו את הכדור. להסרת פסולת, יש להחיות את הכדור עם 1, 550 מיקרוליטרים של DPBS קר ולהעביר את ההשעיה לצינור חרוטי מסומן של 50 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 450 מיקרוליטרים של תמיסת הסרת פסולת קרה ופיפטה למעלה ולמטה.מכסים בעדינות את מתלה התא במיליליטר אחד של DPBS קר, ושומרים את הקצה על דופן הצינור החרוטי. חזור על ההליך עד שהכיסוי הכולל הוא שני מיליליטרים. לאחר מכן, צנטריפוגה המתלים ב 3, 000 פעמים G במשך 10 דקות עם האצה מלאה הפסקה מלאה.שאפו לשכבה העליונה ביותר, ואז טאטאו את קצה הפיפטה קדימה ואחורה כדי לשאוף לשכבת האמצע הלבנה. הסר כמה שיותר מהשכבה האמצעית מבלי להפריע לשכבה התחתונה ביותר. לאחר מכן, מוסיפים שני מיליליטרים של DPBS קר ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.לאחר מכן צנטריפוגה את המתלים ב 1, 000 פעמים G במשך 10 דקות עם האצה מלאה הפסקה מלאה. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והחזירו את הכדור למאגר BSA מיליליטר אחד. לאחר ספירת התאים, צנטריפוגה של תרחיף התא הנותרת והחזרת הכדור ב-50 מיקרוליטרים של כתם חי מדולל.לאחר מכן מעבירים את הדגימה לצינור זרימה מסומן ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 8 עד 10 דקות בחושך. לאחר הדגירה, הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר BSA וחזור על שלב הצנטריפוגה. לאחר מכן להשליך את supernatant, משאיר כמות קטנה של חיץ בצינור.השער הראשי לא כלל פסולת בחלקות הפיזור הקדמי לעומת פיזור הצד, והתאים המתים לא נכללו לאחר מכן. השער השני לא כלל תאים חיוביים לחלבון הבסיסי של המיאלין. ומבין התאים הנותרים נוצרו חלקות צפיפות של תאים חיוביים לכל פלואורוכרום.התדירות של כל אוכלוסיית תאי עצב חושבה מתוך השער השלישי. דגימות שעובדו עם דיסוציאציה מכנית ידנית ועיכול אנזימטי הניבו אוכלוסייה נמוכה משמעותית של תאים בעלי עניין, בעוד שדגימות טריות וקבועות כאחד שעובדו עם דיסוציאציה מכנית אוטומטית ועיכול אנזימטי הראו אוכלוסייה גבוהה פי כמה של תאים בעלי עניין. בעוד ששלבי הזלוף ופינוי הפסולת יכולים להיות מאתגרים בתחילה, שמירה על יד חלקה ויציבה יכולה לעזור להבטיח הצלחה.

combined-mechanical-enzymatic-dissociation-mouse-brain-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים aggitation רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi Dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת nerual הוא הסביר.

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

סרטון זה מדגים פרוטוקול להשגת תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר מההיפוקמפוס במוח העכבר באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית אוטומטית ותערובת של אנזימים כדי לסייע בעיכול אנזימטי.

השגת תרחיף חד-תאי מרקמת ההיפוקמפוס של העכבר

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחילוץ תאי מיקרוגליאה מנגעים דה-מיאלינציה במוחות עכברים באמצעות מיון תאים מגנטיים. הפרוטוקול כולל ניתוח רקמת המוח הפגועה המכילה תאי מיקרוגליה, טיפול ברקמה עם אנזימים ספציפיים לקבלת תרחיף חד-תאי, ושימוש בחרוזים מגנטיים ספציפיים לקולטן מיקרוגליה כדי לבודד את תאי המיקרוגליה.

בידוד מיקרוגליה מנגעי דה-מיאלינציה במוח עכבר באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד תאים מהיפוקמפי חולדה, כולל נוירונים, אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה.

קבלת אוכלוסיות תאים עצביים שונות מהיפוקמפוס של חולדה

סרטון זה מדגים הקלטה של פעילות רשת עצבית קצבית, הידועה גם בשם תנודות תטא, בהיפוקמפוס מבודד. אלקטרודות מוכנסות לשכבות שונות ולמיקומים מרחביים שונים כדי לזהות ולנתח תנודות תטא. זה מראה את ההרכבים העצביים הייחודיים ואת הקישוריות של הרשת העצבית על פני שכבות שונות של ההיפוקמפוס.

הקלטה חוץ גופית של תנודות תטא בהיפוקמפוס העכבר

תרביות עצביות עובריות מנותקות ראשוניות בהיפוקמפוס שימושיות לחקירת מנגנוני האיתות המעורבים במוות נוירונים. מין העוברים לפני הבידוד והדיסוציאציה של ההיפוקמפוס מאפשר הכנה של תרביות זכר ונקבה נפרדות, מה שמאפשר לחוקר לזהות ולחקור איתות תאים ספציפיים למין.

תרביות עצביות מרובדות מין לחקר מסלולי מוות של תאים איסכמיים

מתואר פרוטוקול ליצירת מערכת תרבית משותפת המורכבת מתאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), נוירונים ראשוניים בקליפת המוח ואסטרוציטים. מערכת קו-תרבית זו מאפשרת לזהות היווצרות של מגעים ומעגלים סינפטיים בין נוירונים חדשים שמקורם ב-iPSC לבין נוירונים קיימים בקליפת המוח המבטאים channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

פרוטוקול זה מתאר את הכנת פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-סנטורינאלית האופקית (HEC) מעכברים המציגים פעילות אדווה ספונטנית של גל חד. פרוסות מודגרות בתא החזקת ממשק פשוט והקלטות מבוצעות בתנאים שקועים עם נוזל שדרתי מלאכותי זורם במהירות כדי לקדם חמצון רקמות ואת הופעתה הספונטנית של פעילות ברמת הרשת.

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול שיטתי כדי להשיג פרוסות מוח היפוקמפוס אופקי בעכברים. מטרת מתודולוגיה זו היא לשמר את השלמות של מסלולי סיבים בהיפוקמפוס, כגון הנתיב המחורר ודרכי הסיבים הטחובים להערכת תהליכים נוירולוגיים הקשורים לgyrus.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

כאן, אנו מדגימים כיצד לשלב טרנספקציה של נוירונים מכרסמים ראשוניים בהיפוקמפוס עם הדמיה קונפוקלית של תאים חיים כדי לנתח השפעות פתולוגיות המושרות על ידי חלבונים על הובלה אקסונלית ולזהות מסלולים מכניסטיים המתווכים השפעות אלה.

שימוש בדימות תאים חיים כדי למדוד את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבודד ולטהר מיקרוגליה ראשונית בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים, ואחריו הוראות לביצוע הקלטות טלאי-מהדק של תאים שלמים על תאים מבודדים אלה באופן חריף.

בידוד ורישום Patch-Clamp של תא שלם של מיקרוגליה בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים

למד פרוטוקול דיסוציאציה אנזימטית ומכנית משולבת לרקמת היפוקמפל ממוח עכבר C57BL/6J. השיטה מייצרת תלייה תאית בעלת רמת חיות גבוהה לניתוח תפקוד תאי ומנגנוני טיפול במחלות נוירולוגיות.

דיסוציאציה מכנית ואנזימטית משולבת של רקמת היפוקמפל במוח העכבר

גלה סרטונים נוספים