Name: זיהוי איdel בעקבות MUtagenesis CRISPR/Cas9 באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה aedes aegypti יתוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: למדו לזהות מוטציות CRISPR/Cas9 ביתוש Aedes aegypti באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מוטנטים תוך שעות ספורות ומתאימה למגוון אורגניזמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

כל הדמויות נוצרו עם Biorender.com תחת רישיון לאוניברסיטת טקסס A&M. עבודה זו נתמכה על ידי כספים מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (AI137112 ו- AI115138 ל- Z.N.A.), מחקר טקסס A&M AgriLife במסגרת תוכנית המענקים למחלות וקטוריות חרקים, והמכון הלאומי למזון וחקלאות של משרד החקלאות האמריקאי, פרויקט האץ ' 1018401.

1. סריקה לאיתור פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNPs), עיצוב פריימר HRMA ואימות פריימר
<ol><li>זיהוי SNP יתושי מושבת מעבדה מסוג בר<ol><li>בחר את אקסון היעד כדי לשבש תרגום פוליפפטיד מתאים. הערה: היעד צריך להיות קרוב לקודון ההתחלה או בין שאריות מפתח הנדרשות לתפקוד החלבון. ככל שהאקסון קצר יותר (למשל, ≤200 בסיסים), כך קשה יותר למקד ולנתח אותו. הימנע עריכה קרוב לגבולות של אקסון, כמו זה מכריח את אחד פריימרים HRMA לחצות אינטרון או להיות intron. זה לא רצוי כי שיעורי SNP נוטים להיות הרבה יותר גדול באזורים אלה.</li>
		<li>עיצוב פריימר<ol>
<li>עבור אל NCBI Blast - אתר האינטרנט של Primer Blast15, העתק והדבק את האקסון הנבחר בתיבה בחלק העליון של הדף | בחר את גודל המוצר PCR (ודא שהוא מקיף את רוב האקסון) | בחר את האורגניזם.</li>
			<li>לחץ על פרמטרים מתקדמים | בחר (עבור Tm מוצר PCR) ולהוסיף 60 (לטמפרטורה אופטימלית של 60 °C (60 °F) | קבל פריימרים. שמור את הפרמטרים האחרים כברירת מחדל.</li>
		</ol></li>
		<li>להשיג DNA גנומי (gDNA) ממושבת המעבדה מסוג בר. מניחים בצד 10 יתושים, מרדים אותם עם CO2, ומניחים אותם בצלחת פטרי על קרח כדי לשמור אותם לא פעילים. הגדר 10 צינורות המכילים 0.5 μL של ריאגנט לשחרור DNA מרקמה ו 20 μL של חוצץ דילול, שניהם מסופקים בערכת שחרור ה- DNA המוצעת בטבלת החומרים.</li>
		<li>הסר רגל אחת מיתוש יחיד באמצעות מלקחיים והצב אותה בצינור מתאים של פתרון מדולל של ריאגנט שחרור DNA (ממשלב 1.1.3), שקוע לחלוטין את הרגל בתמיסה. חזור על שלב זה עם היתושים הנותרים, ניגוב המלקחיים עם 70% אתנול לפני שתמשיך לשלב הבא.</li>
		<li>לדגור על הפתרון המכיל את הרגל בטמפרטורת החדר במשך 2-5 דקות, ולאחר מכן ב 98 °C (70 °F) במשך 2 דקות, ולאפשר לו להתקרר תוך הגדרת תגובת PCR. הערה: לוחות המכילים את gDNA ששוחרר ניתן לאחסן ב -20 °C (70 °F), ואת הפרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה.</li>
		<li>הכן 10 צינורות המכילים 10 μL של 2x PCR מאסטר מיקס, פריימרים לריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר, ומים בדרגה מולקולרית לנפח סופי של 20 μL, ולהעביר 1 μL של המדגם המדולל לכל צינור. בצע PCR בעקבות פרמטרים אלה רכיבה על אופניים: 98 °C 5 דקות, 40 מחזורים של 98 °C (5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s לק kb; הארכה סופית של 72 °C (72 °F) למשך דקה אחת.</li>
		<li>טהרו את מוצרי ה-PCR בעזרת אנזים כדי לבזות את שאריות הפריימרים של PCR ולפרק את ה-dNTPs העודפים או כל ערכת ניקוי טורים. המשך ברצף הדגימות.</li>
		<li>נתח כל אלקטרופרוגרמה לנוכחות של פסגות כפולות/בסיסים מעורפלים, והתאם את קריאות הבסיס באופן ידני בכל רצף באמצעות קוד הבסיס המנוון המתאים. הערה: שלב זה חייב להתבצע לפני יישור רצף מרובים כפי שהוא נפוץ עבור תוכנת שיחות הבסיס לבחור את הפסגה הבולטת יותר כמו שיחת הבסיס "האמיתי", נותן את הרושם השגוי של היעדר SNPs.</li>
		<li>בצע יישור רצף מרובה באמצעות תוכנת היישור, SeqMan Pro, המפורטת בטבלת החומרים או בתוכנות יישור קוד פתוח אחרות, כגון ClustalW16 או T-Coffee17.<ol>
<li>פתיחת תוכנת היישור | לחץ על הוספת רצפים | בחר את הרצפים הרצויים ולחץ על הוסף | לאחר בחירת כל הרצפים, לחץ על סיום.</li>
			<li>לחץ על הרכב כדי לבצע את היישור. כדי לפתוח את היישור, לחץ על Contig 1 וניתח את היישור וזיהה את ה- SNPs (איור 1). הערה: כחלופה לשלבים 1.1.3-1.1.6, ניתן לבצע PCR מדנ"א גנומי מבודד המתקבל מדגימות בתפזורת (נגזר מ- >10 אנשים). אמפליקונים רציפים ניתן לנתח ישירות עבור נוכחות של SNPs המופיעים כמו פסגות כפולות ב electropherogram, אם כי SNPs נדיר יהיה קשה יותר לזהות.</li>
		</ol></li>
		<li>עצב 3-5 RNAs של מדריך יחיד (sgRNAs), הימנעות מאזורים המכילים כל SNP שזוהה לעיל, בעקבות הפרוטוקול המתואר ב- 18.</li>
	</ol></li>
	<li>עיצוב פריימר HRMA<ol>
<li>בדוק את רצף האקסון להיווצרות אפשרית של מבנים משניים במהלך PCR באמצעות mFold19.<ol>
<li>עבור אל שרת האינטרנט של UNAFold | לחץ על mFold | בתפריט הנפתח, לחץ על יישומים | צורת קיפול דנ"א.</li>
			<li>הזן את שם הרצף בתיבה והדבק את האקסון.</li>
			<li>לשנות את טמפרטורת הקיפול ל 60 °C (60 °F); בתנאים היוניים, לשנות [Mg++] ל 1.5 ועל יחידות לעבור mM; לחץ על Fold DNA.</li>
			<li>בפלט, מתחת למבנה 1, לחץ על PDF כדי לפתוח את התוויות המבנה המעגלי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>עבור אל NCBI Blast - פריימר Blast15 לעיצוב פריימר.</li>
		<li>העתק והדבק את רצף האקסון שנבחר שנקבע על-ידי רצף בשלב 1.1 (הרצף המכיל את המספר הנמוך ביותר של SNPs או ללא SNPs) בתיבה בחלק העליון של הדף.</li>
		<li>השתמש בסימן < > כדי לסמן ולא לכלול רצפים המכילים SNPs, אתר היעד ואזורים עם היווצרות אפשרית של מבנה משני.</li>
		<li>בחר את גודל המוצר PCR להיות בין 80 ל 150 bp ולבחור את האורגניזם. הערה: ניתן להשתמש בהצלחה בגדלי קטעים גדולים יותר (כ- 300 bp). עם זאת, אמפליקולים ארוכים יותר עשויים להפחית את הרגישות בין רצפים שונים בזוג בסיס אחד או רק כמה.</li>
		<li>לחץ על קבל פריימרים. בחר 2-3 זוגות פריימרים לבדיקה (באופן אידיאלי, אתרי פריימר נמצאים במרחק של ≥20-50 bp מאתרי יעד CRISPR).</li>
	</ol></li>
	<li>אימות פריימר<ol>
<li>ביצוע PCR הדרגתי באמצעות gDNA מאדם יחיד.<ol>
<li>הכן תערובת ראשית והסר דוגמה אחת עבור הפקד שאינו תבנית (NTC) בצינור נפרד. מוסיפים את התבנית לתערובת האב הנותרת ואת aliquot לצלחת 96-well.</li>
			<li>בצע את הפרמטרים רכיבה על אופניים: 98 °C 30 s, 34 מחזורים של 98 °C (50 °F) עבור 10 s, 55-65 °C (30 °F), 72 °C (72 °F) 15 s; הארכה סופית של 72 °C (72 °F) למשך 10 דקות.</li>
			<li>צור פרופילי התכה תרמית בעקבות הפרמטרים: שלב denaturation 95 °C במשך 1 דקות, חישול 60 °C (5 °F) במשך 1 דקות, להמיס זיהוי עקומת בין 75 °C (75 °F) ב 0.2 °C (55 °F) במרווחים של 0.2 °C ,עם זמן אחיזה של 10 מעלות צלזיוס בכל טמפרטורה. הערה: יש להשתמש רק בטמפרטורות חישול עם פרופיל המסה תרמית יחיד.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>המשך ליצור את הקווים המוטנטיים עם זריקות עובר כמתואר ב -12.</li>
</ol>2. הכנת דנ"א גנומי מרגלי יתושים
<ol><li>הפרד את יתושי G1 על ידי סקס בשלב הגפיים, כך שהם לא להזדווג לפני genotyping, ולוודא כי גיל מותאם, סוג בר שליטה יתושים יהיה זמין לשמש עבור הפניות backcrosses. סקס להפריד אותם גם כן.</li>
	<li>אסוף את החומרים הדרושים (איור 2A) והכן צלחת PCR 96 היטב עם 0.5 μL של ריאגנט שחרור DNA ו 20 μL של חוצץ דילול (מערכת שחרור gDNA) לאדם להיות genotyped (איור 2B) ולהשאיר אותו על קרח. שמור שתי תגובות עבור NTC.</li>
	<li>סמן מגש לבקבוקוני יתושים (בקבוקוני Drosophila ) כך שכל באר על הצלחת 96 תואמת את בקבוקון היתושים המתאים במגש.</li>
	<li>יש להעשיר את יתושי ה-G1 עם CO2 ולהניח אותם בצלחת פטרי מזכוכית כדי לשמור עליהם מסוממים (איור 2C, D). יש למרדים ולהניח 8 יתושים פראיים בצלחת פטרי שנייה.</li>
	<li>נגב זוג פינצטה עם 70% אתנול והסר את אחת מרגלי היתוש האחוריות (איור 2E,F).</li>
	<li>שקועים ברגל בתמיסת ריאגנט לשחרור דנ"א, מניחים את היתוש בחתינה המתאימה וסוגבים אותו עם ספוג (איור 2G,H).</li>
	<li>לנגב את פינצטה שוב עם 70% אתנול ולהמשיך עם הסרת הרגל מן היתוש הבא. חזור על שלבים 2.5-2.7 עד להשלמת הצלחת 96-well. הערה: חשוב לנגב את פינצטה עם 70% אתנול. זה ממזער זיהום חוצה דנ"א.</li>
	<li>אטמו את הצלחת עם חותם צלחת PCR אופטי (איור 2I) ודגרו את הצלחת 96-well המכילה את הרגליים בטמפרטורת החדר (RT) במשך 2-5 דקות ולאחר מכן ב 98 °C (2 דקות). אפשר לצלחת להתקרר ל- RT תוך כדי הכנת תערובת ה- PCR. הערה: התהליך כולו בדרך כלל לוקח 3-4 שעות. אם היתושים חייבים להישמר בבקבוקונים במשך זמן רב יותר מהמשך הצפוי (במיוחד ≥ יום אחד), מניחים חתיכה קטנה של צימוקים (או מקור סוכר ומים) עם כל יתוש כדי להבטיח את הישרדות היתושים במהלך הדגירה המורחבת.</li>
</ol>3. ח"ם
<ol><li>בצע פי.סי.אר.<ol>
<li>הכן תערובת אב המכילה את הרכיבים הבאים לכל תגובה: 10 μL של חיץ 2x (מערכת שחרור gDNA), 0.5 μM של כל פריימר, 1 μL של צבע EvaGreen, 0.4 μL של פולימראז (מערכת שחרור gDNA), להשלים עד 19 μL עם מים ברמה מולקולרית.</li>
		<li>באמצעות pipet רב ערוצי, להעביר 19 μL של תערובת האב לתוך כל באר. העבר 1 μL של פתרון שחרור DNA המכיל DNA יתושים מוכן בסעיף 2 לצלחת (איור 3A). אוטמים את הצלחת עם אטם לוחית PCR אופטי.</li>
		<li>בצע את PCR בעקבות הפרמטרים רכיבה על אופניים: 98 °C (5 דקות), 39 מחזורים של 98 °C (78 °F) עבור 10 מעלות צלזיוס, טמפרטורת החישול הנבחרת (72 °C (72 °F) עבור 30 מעלות צלזיוס; הארכה סופית 72 °C (72 °F) למשך 2 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צור פרופילי התכה תרמית בעקבות הפרמטרים: שלב denaturation 95 °C במשך 1 דקות, חישול 60 °C (5 °F) במשך 1 דקות, להמיס זיהוי עקומת בין 75 °C (75 °F) ב 0.2 °C (55 °F) במרווחים של 0.2 °C ,עם זמן אחיזה של 10 מעלות צלזיוס בכל טמפרטורה. עיין בחומר המשלים ובאיור המשלים S1-S5 לקבלת תיאור מפורט של הגדרת התוכנה עבור HRMA לפעול באמצעות מערכת CFX96 בזמן אמת.</li>
	<li>בדקו את פרופילי ההיתוך (איור 3B). הקצה פקד מסוג פראי לאשכול ההפניות. הערה: התוכנה (ראה טבלת החומרים) מנרמלת באופן אוטומטי את הנתונים ומייעדת אשכולות עם צבעים לעקומות נמסות שונות.</li>
	<li>סמן את האשכולות השונים בצבעים המתאימים בתבנית 96-well (איור 3C).</li>
	<li>בחרו את האנשים בעלי העקומות העניין, הסירו אותם מהצינורות ואת ה-backcross (איור 3D). להאכיל בדם את הנקבות המזדווגות ולאסוף ביצי G2 .</li>
</ol>4. אימות רצף על ידי רצף סנגר
<ol><li>לטהר את מוצר PCR מן בארות עם יתושים נבחרים (מן הצלחת מוכנה בסעיף 3.1), באמצעות אנזים כדי לבזות את פריימרים PCR שיורית, dephosphorylate עודף dNTPs. לחלופין, השתמש בכל ערכת ניקוי עמודות והמשיך ברצף הדגימות. הערה: רצף ישיר עשוי להיות מאתגר יותר כאשר גודל המוצר PCR קטן (≤200 bp). במקרים כאלה, פריימרים עיצוב כדי להגביר שברים גדולים יותר המקיפים את אתר היעד (≥250 bp) ולהגביר על ידי PCR באמצעות ה- DNA בלוח 96-well (שלב 2.2).</li>
	<li>נתח וזיהה את ההדלות באמצעות תוכנת מציג המעקב (איור 4). לחלופין, פולי שיא מנתח software20 יכול לעזור לזהות את המוטציה אצל אנשים הטרוזיגוס.<ol>
<li>עבור אל אתר האינטרנט של Poly Peak Parser, בחר את הרצף מהאנשים המוטנטיים בתפריט עיון והעתק והדבק את רצף ההפניות בתיבה. הערה: היישור בין אלל חלופי להפניה יופיע באופן אוטומטי בצד ימין של המסך.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+Guidelines+for+diagnosis%2C+treatment%2C+prevention+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control.</a> WHO. , Report No. 978 160(2009).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+epidemiology+update%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Zika epidemiology update.</a> WHO. , 1-13 (2019).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+prevention+and+control+of+Chikungunya+fever%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever.</a> WHO. , (2009).</li>
<li>WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791">https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791</a> (2020).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li>
<li>Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+resolvases+T4+endonuclease+VII+and+T7+endonuclease+I+in+mutation+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection.</a> Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).</li>
<li>Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+applications+for+clinical+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">High resolution melting applications for clinical laboratory medicine.</a> Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).</li>
<li>Reed, G. H., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+of+single-nucleotide+polymorphism+scanning+by+high-resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis.</a> Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Tong, S. Y., Giffard, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiological+applications+of+high-resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbiological applications of high-resolution melting analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).</li>
<li>Simko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+DNA+melting+analysis+in+plant+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution DNA melting analysis in plant research.</a> Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN%2FCRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li>
<li>O'Leary, S., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+knockout+of+female-biased+genes+AeAct-4+or+myo-fem+in+Ae.+aegypti+results+in+a+flightless+phenotype+in+female%2C+but+not+male+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971(2020).</li>
<li>Kojin, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+SGS1+is+critical+for+Plasmodium+gallinaceum+infection+of+both+the+mosquito+midgut+and+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands.</a> Malaria Journal. 20 (1), 11(2021).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Larkin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustal+W+and+Clustal+X+version+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Clustal W and Clustal X version 2.0.</a> Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).</li>
<li>Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Coffee%3A+A+novel+method+for+fast+and+accurate+multiple+sequence+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment.</a> Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).</li>
<li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li>
<li>Hill, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+peak+parser%3A+Method+and+software+for+identification+of+unknown+indels+using+sanger+sequencing+of+polymerase+chain+reaction+products%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).</li>
<li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+candidate+iron+transporters+from+the+ZIP%2FZnT+gene+families+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380(2018).</li>
<li>Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+%28HRM%29+for+high-throughput+genotyping-limitations+and+caveats+in+practical+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316(2017).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), 407-415 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה מציע פתרון פשוט ומהיר לזיהוי של indels שנוצר על ידי טכנולוגיית CRISPR / Cas9 יתוש וקטור Ae. aegypti. הוא מספק גמישות, ומאפשר גנוטיפינג של יתושים שעברו מוטציה למגוון רחב של גנים משריר הטיסה ועד חילוף החומרים של הברזל ועוד 13,14. HRMA יכול להתבצע רק כמה שעות מאוסף מדגם כדי הניתוחים הסופיים. נדרש זמן נוסף לעיצוב פריימר ויהיה תלוי גם בזמן לקבלת כל תוצאות הרצף הדרושות (לזיהוי SNPs), ניתוחי רצף והזמנה פריימר.
<p class="jove_conten...

כמו וקטורים של פתוגנים כגון דנגי1, זיקה2, ו chikungunya3 וירוסים, כמו גם טפילים מלריה4, יתושים מהווים איום משמעותי על בריאות הציבור על בני אדם. עבור כל המחלות האלה, יש מיקוד משמעותי של התערבות שידור על השליטה של וקטורים יתושים. חקר הגנים החשובים, למשל, מתירניות לפתוגנים, כושר יתושים, הישרדות, רבייה ועמידות לחומרי הדברה הוא המפתח לפיתוח אסטרטגיות חדשות לבקרת יתושים. למטרות כאלה, עריכת גנום יתושים הופכת למנהג נפוץ, במיוחד עם פיתוח טכנולוגיות כגון HEs, ZFNs, TALENs, ולאחרונה, CRISPR עם Cas9. הקמת זנים בעריכת גנים כרוכה בדרך כלל באנשים הנושאים את המוטציות הרצויות במשך כמה דורות כדי למזער את ההשפעות מחוץ למטרה ומייסד (צוואר בקבוק), ואחריו לחצות אנשים הטרוזיגוס כדי ליצור קווי הומוזיגוס או טרנס-הטרוזיגוס. בהיעדר סמן דומיננטי, genotyping מולקולרי הוא הכרחי בתהליך זה, כי במקרים רבים, אין תכונות פנוטיפיות ברורות ניתן לזהות עבור מוטציות heterozygous.
למרות רצף הוא תקן הזהב לאפיון גנוטיפי, ביצוע זה על פני מאות, או אולי אלפי אנשים, מהווה עלויות משמעותיות, עבודה, וזמן הנדרש כדי להשיג תוצאות, וזה קריטי במיוחד עבור אורגניזמים עם תוחלת חיים קצרה כגון יתושים. חלופות נפוצות הן Surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 וניתוח נמס ברזולוציה גבוהה (HRMA, שנסקר ב7). הן SNA והן T7E1 משתמשות באידונוקלאזים המבקעים רק בסיסים לא תואמים. כאשר מוגבר אזור מוטציה של הגנום המוטנטי ההטרוזיגוסיגוס, רסיסי DNA מאללים מוטנטיים ופראיים מחושלים כדי ליצור דנ"א דו-גדילי לא תואם (dsDNA). SNA מזהה את הנוכחות של אי התאמות באמצעות עיכול עם אנדונוקלאז ספציפי לאי התאמה ואלקטרופורזה ג'ל אגרוז פשוט. לחלופין, HRMA משתמש בתכונות התרמודינמיות של dsDNA שזוהו על ידי צבעים פלואורסצנטיים מחייבים DSDNA, עם טמפרטורת הניתוק של הצבע המשתנה בהתבסס על נוכחות וסוג המוטציה. HRMA שימש לגילוי פולימורפיזם חד-נוקלאוטיד (SNPs)8, גנוטיפינג מוטנטי של דגי זברה9, יישומים מיקרוביולוגיים10, ומחקר גנטי צמח11, בין היתר.
מאמר זה מתאר HRMA, שיטה פשוטה של genotyping מולקולרי עבור יתושים מוטנטיים שנוצר על ידי טכנולוגיית CRISPR / Cas9. היתרונות של HRMA על פני טכניקות חלופיות כוללים 1) גמישות, כפי שהוא הוכח שימושי עבור גנים שונים, מגוון רחב של גדלים indel, כמו גם את ההבחנה בין גדלים indel שונים heterozygous, הומוזיגוס, ו trans-heterozygous בידול12,13,14, 2) עלות, כפי שהוא מבוסס על ריאגנטים PCR נפוץ, ו 3) חיסכון בזמן, כפי שהוא יכול להתבצע רק כמה שעות. בנוסף, הפרוטוקול משתמש בחלק גוף קטן (רגל) כמקור לדנ"א, ומאפשר ליתושים לשרוד את תהליך הגנוטיפינג, ומאפשר הקמה ותחזוקה של קווים מוטנטיים.

<table><tbody><tr><td>70% אתנול</td><td></td><td></td><td>70% תמיסת אתנול במים</td></tr><tr><td>96 בארות PCR וצלחות PCR בזמן אמת</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td>להשגת DNA גנומי (מרגל היתוש)</td></tr> <tr><td>תבניות</td><td></td><td></td> צלחות 96 בארות <td>מודפסות תוצרת בית, להקלטת גנוטיפ</td></tr><tr><td>מכונת Bio Rad CFX96</td><td>Bio Rad</td><td></td><td>PCR עם יכולות</td></tr> <tr><td>שיפוע ו-HRMAמאגרי ריאגנטים ביוטכנולוגיים מגוונים</td><td>VWR</td><td>490006-896</td><td></td></tr><tr><td>Exo-CIP ערכת ניקוי PCR מהירה</td> ניו <td>אינגלנד Biolabs</td><td>E1050S</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי זכוכית</td><td>VWR</td><td>89001-246</td><td>150 מ"מ x 20 מ"מ</td></tr><tr><td>מעטפת קשיחה דופן דקה 96 לוחות PCR עם חצאית</td><td>היטב Bio-rad</td><td>HSP9665</td><td>עבור</td></tr><tr><td>פיפטור רב ערוצי HRMA (P10)</td> <td>Integra Biosciences</td><td>4721</td><td></td></tr><tr><td>פיפטור רב ערוצי (P300)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4723</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Polyolefin Acrylate סרט איטום, Thermo Scientific</td><td>VWR</td><td>37000-548</td><td>לשימוש עם 96-well&nbsp; לוחות PCR להשגת DNA גנומי</td></tr><tr><td>סרט איטום אופטי</td><td>Bio-rad</td><td>2239444</td><td>לשימוש עם לוחות PCR עם 96 בארות עבור ערכת</td></tr><tr><td>PCR ישירה של רקמות בעלי חיים HRMA Phire (ללא כלי דגימה)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>F140WH</td><td>להשגת DNA גנומי וביצוע</td></tr><tr><td>מחלקי בקבוקון זבוב פלסטיק</td> PCR <td>Genesee</td><td>59-128W</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח נמס מדויק</td><td>Bio Rad</td><td>1845025</td><td>משמש לגנוטיפ של דגימות ה- DNA של היתושים ולניתוח תכונות הדנטורציה התרמית של DNA דו-גדילי (ראה פרוטוקול שלב 3.3)</td></tr> <tr>תוכנת <td></td><td>SeqMan Pro</td><td>DNAstar Lasergene</td><td>ליישור רצפים</td></tr><tr><td>מרובים פיפטור חד ערוץ</td><td>גילסון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פינצטה דומונט #5 11 ס"מ</td><td>WPI</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>פקקי קצף לבנים</td><td>VWR</td><td>60882-189</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני דרוזופילה רחבים, פוליסטירן</td><td>Genesee</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>מגש בקבוקון זבוב רחב, כחול</td><td>Genesee</td><td>59-164B</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי איdel בעקבות mutagenesis crispr/cas9 באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה aedes aegypti יתוש

Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

עריכת גנים יתושים הפכה לשגרה במספר מעבדות עם הקמת מערכות כגון גרעיני אפקט דמוי מפעיל תמלול (TALENs), גרעינים אצבע אבץ (ZFNs), ו אנדונקולאזים ביות (HEs). לאחרונה, טכנולוגיית החלבון 9 (Cas9) הקשורה באופן קבוע לסירוגין משולבת באופן קבוע (CRISPR)/CRISPR מציעה חלופה קלה וזולה יותר להנדסת גנום מדויקת. בעקבות פעולת נוקלאז, נתיבי תיקון DNA יתקנו את קצות ה- DNA השבורים, ולעתים קרובות יציגו indels. מוטציות מחוץ למסגרת אלה משמשות להבנת תפקוד הגנים באורגניזמי היעד. החיסרון, עם זאת, הוא כי אנשים מוטנטיים לשאת שום סמן דומיננטי, מה שהופך זיהוי ומעקב של אללים מוטנטיים מאתגרים, במיוחד בקנה מידה הדרוש לניסויים רבים. 
ניתוח המסה ברזולוציה גבוהה (HRMA) היא שיטה פשוטה לזיהוי וריאציות ברצפי חומצות גרעין ומשתמשת בעקומות התכה של PCR כדי לזהות וריאציות כאלה. שיטת ניתוח זו לאחר PCR משתמשת בצבעי כריכת DNA כפולים נטושים פלואורסצנטיים עם מכשור בעל יכולת לכידת נתונים של בקרת טמפרטורה והוא מוגדל בקלות לפורמטים של לוחות של 96 באר. מתואר כאן הוא זרימת עבודה פשוטה באמצעות HRMA לגילוי מהיר של INDELs המושרה CRISPR / Cas9 והקמת קווים מוטנטיים יתוש Ae. aegypti. באופן קריטי, כל השלבים יכולים להתבצע עם כמות קטנה של רקמת רגל ואינם דורשים הקרבת האורגניזם, המאפשר צלבים גנטיים או בדיקות פנוטיפינג להתבצע לאחר genotyping.

יתושים המכילים מוטציות בגנים AaeZIP11 (משגר ברזל פואטי21) ומיו-פאם (גן מיוסין מוטה נקבה הקשור לשרירי הטיסה13) הושגו באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9, genotyped באמצעות HRMA, ומאומת רצף (איור 5). איור 5A ואיור 5C מראים את עוצמת הפלואורסצנטיות המנורמלת מעקומות ה-HRM מדגימות מוטציות של AaeZIP11 ומיו-פאם , בהתאמה, יחד עם פקדים מסוג בר. <strong class="xfig"...

מאמר זה מפרט פרוטוקול לזיהוי מהיר של indels המושרה על ידי CRISPR / Cas9 ובחירה של קווים מוטנטיים יתוש Aedes aegypti באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה.

זיהוי איdel בעקבות MUtagenesis CRISPR/Cas9 באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה aedes aegypti יתוש

Mosquito gene editing has become routine in several laboratories with the establishment of systems such as transcription-activator-like effector nucleases ...

פרוטוקול זה הוא דרך פשוטה ויעילה מאוד לזהות מוטציות שנוצרו על ידי טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מאנשים רבים. שני היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם כי זה יכול להיעשות בכמה שעות וכי זה חל על שפע של אורגניזמים. עיצוב פריימר יכול להיות מאתגר עבור גנים מסוימים וייתכן שיידרשו סבבים מרובים של תכנון ואימות פריימר כדי להפוך את HRMA ליעילה.לביצוע PCR הדרגתי, התחל על-ידי הכנת תערובת ראשית. לאחר מכן הסר 19 מיקרוליטרים של התערובת הראשית עבור הפקד שאינו תבנית או NTC בלוח 96 בארות. לאחר מכן, הוסף את התבנית לתערובת האב הנותרת.Aliquot 20 microliters של תערובת המדגם לתוך צלחת 96-well. בצע PCR בעקבות הפרמטרים רכיבה על אופניים ולאחר מכן ליצור את פרופילי המסה תרמית באמצעות הפרמטרים המוזכרים בכתב היד. לאחר איסוף כל החומר הנדרש, להכין תערובת מאסטר עם 0.5 microliters של ריאגנט שחרור DNA ו 20 microliters של חוצץ דילול לכל אדם להיות genotyped.באמצעות צינור רב ערוצי, aliquot 20 microliters של התערובת לתוך צלחת PCR ולהשאיר את צלחת PCR על קרח. לאחר מכן, מניחים את יתושי G1 המרידים בצלחת פטרי כדי לשמור אותם מסומם ומניחים שמונה יתושים מסוג בר בצלחת הפטרי השנייה. נגב זוג פינצטה עם 70% אתנול והשתמש פינצטה מחוטאת כדי להסיר את אחד היתושים רגליים אחוריות.לאחר מכן, להטביע את הרגל בתמיסת ריאגנט שחרור DNA. מניחים את היתוש בווינ

indel-detection-following-crisprcas9-mutagenesis-using-high

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

סרטון זה מדגים את תפקידה של תגובת שרשרת פולימראז טיפתית דיגיטלית בזיהוי מוטציה אינדל בדגימת DNA. הדיוק והרגישות הגבוהים של ddPCR מאפשרים זיהוי מדויק ועקבי של מוטציות נדירות הקיימות בדגימה, גם ברמות נמוכות. הוא יכול לזהות ולכמת מוטציות אינדל באזורים שונים של הגנום, ומספק תובנות חשובות על מנגנוני המוטציה וההשלכות התפקודיות של מוטציות אלה.

תגובת שרשרת דיגיטלית של פולימראז טיפתי לזיהוי מוטציות אינדל בגני מטרה

סרטון זה מדגים את תגובת שרשרת פולימראז הדרגתי לאופטימיזציה של טמפרטורת החישול של פריימרים, הקובעת טמפרטורת חישול הדרגתית לאורך בארות. ההשפעה של טמפרטורות חישול שונות נקבעת על ידי התשואה של מוצרים מוגברים המסייעים לייעל את מצב התגובה.

תגובת שרשרת פולימראז הדרגתית לקביעת טמפרטורת החישול האופטימלית

פרוטוקול זה מתווה את זרימת העבודה של הגן מבוססת על CRISPR/Cas9 עריכת המערכת עבור התיקון של מוטציות נקודה בתרבית של תאים. כאן, אנו משתמשים בגישה קומבינטורית לעריכת ג'ין עם נתונים היסטוריים אסטרטגיה ניסיוני המשכית למדידת ויאסין היווצרות באתר היעד — בעיקרו של דבר, ניתוח מוטגנזה מכוונת באתר.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 משמש יותר ויותר כדי לאפיין את תפקוד הגנים באורגניזמים שאינם מודל. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור שורות נוק-אאוט של Culex pipiens, מהכנת תערובות הזרקה, להשגה והזרקה של עוברים יתושים, כמו גם כיצד לגדל, לחצות, מסך מוזרק יתושים וצאצאיהם עבור מוטציות הרצויות.

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

הפרוטוקול מתאר כיצד להשיג שינויים מכווני אתר בגנום של יתושי מלריה אנופלס באמצעות מערכת φC31 . השינויים המתוארים כוללים הן את האינטגרציה והן את חילופי הקלטות מהונדסות בגנום של קווי עגינה נושאי attP.

אתר φC31-בתיווך אינטגרציה וחילופי קלטות בוקטורים אנופלס של מלריה

פרוטוקול זה מספק את השלבים החל מיצוי DNA ועד לערך ניסיוני עבור PCR טיפה דיגיטלית (ddPCR), כולל ניתוח לזיהוי וכימות של אירועי הצטרפות קצה לא הומולוגיים (NHEJ) באתרי יעד לאחר מחשוף Cas9 המושרה על ידי gRNA ותיקון DNA. שימושים אחרים בשיטה זו כוללים יישומים כגון זיהוי פולימורפיזם ואימות וריאנט עריכת גנים.

PCR טיפה דיגיטלית כדי לזהות מוטציות indels באוכלוסיות יתושים אנופלין מהונדס גנטית

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לעריכת גנום באמצעות מיקרו-הזרקה עוברית ביתוש A. aegypti באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9.

עריכת גנום ביתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti באמצעות CRISPR-Cas9

גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

למדו לזהות מוטציות CRISPR/Cas9 ביתוש Aedes aegypti באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מוטנטים תוך שעות ספורות ומתאימה למגוון אורגניזמים.

זיהוי איdel בעקבות MUtagenesis CRISPR/Cas9 באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה aedes aegypti יתוש

גלה סרטונים נוספים