זיהוי איdel בעקבות MUtagenesis CRISPR/Cas9 באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה aedes aegypti יתוש
10 בספטמבר 2021
מאמר זה מפרט פרוטוקול לזיהוי מהיר של indels המושרה על ידי CRISPR / Cas9 ובחירה של קווים מוטנטיים יתוש Aedes aegypti באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה.
פרוטוקול זה הוא דרך פשוטה ויעילה מאוד לזהות מוטציות שנוצרו על ידי טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מאנשים רבים. שני היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם כי זה יכול להיעשות בכמה שעות וכי זה חל על שפע של אורגניזמים. עיצוב פריימר יכול להיות מאתגר עבור גנים מסוימים וייתכן שיידרשו סבבים מרובים של תכנון ואימות פריימר כדי להפוך את HRMA ליעילה.
לביצוע PCR הדרגתי, התחל על-ידי הכנת תערובת ראשית. לאחר מכן הסר 19 מיקרוליטרים של התערובת הראשית עבור הפקד שאינו תבנית או NTC בלוח 96 בארות. לאחר מכן, הוסף את התבנית לתערובת האב הנותרת.
Aliquot 20 microliters של תערובת המדגם לתוך צלחת 96-well. בצע PCR בעקבות הפרמטרים רכיבה על אופניים ולאחר מכן ליצור את פרופילי המסה תרמית באמצעות הפרמטרים המוזכרים בכתב היד. לאחר איסוף כל החומר הנדרש, להכין תערובת מאסטר עם 0.5 microliters של ריאגנט שחרור DNA ו 20 microliters של חוצץ דילול לכל אדם להיות genotyped.
באמצעות צינור רב ערוצי, aliquot 20 microliters של התערובת לתוך צלחת PCR ולהשאיר את צלחת PCR על קרח. לאחר מכן, מניחים את יתושי G1 המרידים בצלחת פטרי כדי לשמור אותם מסומם ומניחים שמונה יתושים מסוג בר בצלחת הפטרי השנייה. נגב זוג פינצטה עם 70% אתנול והשתמש פינצטה מחוטאת כדי להסיר את אחד היתושים רגליים אחוריות.
לאחר מכן, להטביע את הרגל בתמיסת ריאגנט שחרור DNA. מניחים את היתוש בווינאל המתאים וסוגבים את הקרבון עם ספוג. לאחר סיום, לנגב את פינצטה עם 70% אתנול לפני שתמשיך עם הסרת הרגל מן היתוש הבא עד צלחת 96-well הושלמה.
מאוחר יותר, לאטום את הצלחת עם חותם צלחת PCR אופטי ולדגירה את צלחת PCR המכיל את הרגליים בטמפרטורת החדר במשך שתיים עד חמש דקות, ואחריו דגירה ב 98 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. אפשר לצלחת להתקרר לטמפרטורת החדר. עבור PCR, הכינו תערובת ראשית המכילה את הרכיבים המועדפים ולאחר מכן השתמשו בצינור רב-ערוצי כדי להעביר 19 מיקרוליטרים של תערובת האב לכל באר של הצלחת 96-well.
לאחר העברת מיקרוליטר אחד של תמיסה לשחרור DNA המכיל DNA יתוש שהוכן בעבר לצלחת, לאטום את הצלחת עם חותם צלחת PCR אופטי. בצע את ה- PCR עם הפרמטרים המתאימים לרכיבה על אופניים כדי ליצור פרופילי המסה תרמיים בהתאם לפרמטרים המתוארים בכתב היד, ולאחר מכן בדוק את פרופילי ההיתוך על-ידי הקצאת פקד מסוג בר לאשכול הייחוס. סמן את האשכולות השונים בצבעים המתאימים בתבנית 96-well.
לאחר מכן, בחר את האנשים עם עקומות של עניין ולהסיר את האנשים שנבחרו מן הצינורות כדי לחצות בחזרה. מזון דם עשה את זה נקבות, ואחריו איסוף G2As. בניתוח הייצוגי, מוצג ניתוח הרצף של מוטציית ZIP11 של Aedes aegypti.
האלקטרופרוגרמה ממוטנטים הטרוזיגוס של Aedes aegypti ZIP11 הצביעו על מיקום הנוקלאוטיד שבו התרחשה ההדלה. ההדלה מיוצגת על ידי מעבר מפסגות בודדות לכפלות, שכן תנוחות פולימורפיות מראות את שני הנוקלאוטידים במקביל. בסוף ההפעלה, מספר זוגות הבסיס שנמחקו או נוספו חושב על-ידי ספירת הפסגות הבודדות.
יתושים המכילים מוטציות בגנים Aedes aegypti ZIP11 ומיו-פאם היו genotyped ורצף מאומת באמצעות ניתוח המסה ברזולוציה גבוהה של HRMA. האותות הפלואורסצנטיים של הדגימות נוטלו לערכים יחסיים של אחד עד אפס. בנוסף, כל עקומה הופחתה מההפניה מסוג בר וציין את ההגדלה המתאימה.
הקצאת אשכול אוטומטית שנכשלה מוצגת בתוצאות הייצוגיות, כאשר לא בוצעה הבחנה נכונה בין הקבוצות. יתר על כן, כל מדגם נותח בנפרד והוקצה לקבוצות הנכונות בהתבסס על הדמיון לדגימות התייחסות של הטרוזיגוטים, הומוזיגוטים וטרנסהטרוזיגוטים. לאחר ביצוע HRMAs, ריצוף ה- DNA מהאנשים שעברו מוטציה יש צורך לנתח את indels ולזהות את המוטציות האחרות ברצף היעד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוטוקול לזיהוי מהיר של אינדלים (indels) המושרים על ידי CRISPR/Cas9 ובחירה של שורות מוטנטים ביתוש Aedes aegypti באמצעות ניתוח המסת גבוהה (high-resolution melt analysis). השיטה יעילה וניתנת ליישום באורגניזמים שונים, ומאפשרת זיהוי מהיר של מוטנטים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גנטיקה
- ביולוגיה מולקולרית
- אנטומולוגיה
רקע
- טכנולוגיית CRISPR/Cas9 נמצאת בשימוש נרחב לעריכה גנומית.
- זיהוי יעיל של מוטציות הוא קריטי למחקרים גנטיים.
- ניתוח המסה ברזולוציה גבוהה (HRMA) מציע שיטה לזיהוי מהיר.
- אתגרים בתכנון פריימרים עלולים להשפיע על היעילות של HRMA.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול לזיהוי מוטציות המושרות על ידי CRISPR.
- הדגמת הישימות של HRMA באורגניזמים שונים.
- ייעול תהליך הבחירה של קווי מוטנטים.
שיטות שהשתמשו בהן
- הכנת תערובת מאסטר (master mix) עבור PCR.
- שימוש בביקורות ללא תבנית (NTC) בלוחית של 96 בארות.
- ביצוע Gradient PCR לאופטימיזציה של התנאים.
- ניתוח המסה ברזולוציה גבוהה (High-resolution melt analysis) לזיהוי indel-ים.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר זיהוי מהיר של מוטנטים.
- ניתן להשלים את ה-HRMA תוך מספר שעות.
- ייתכן שיהיה צורך במספר סבבים של תכנון פריימרים כדי להשיג יעילות.
- השיטה היא ורסטילית ומתאימה למינים שונים.
מסקנות
- פרוטוקול זה משפר את היעילות של זיהוי מוטציות.
- הוא מספק כלי בעל ערך למחקר גנטי ביתושים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו ליישומים רחבים יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי מהיר של מוטציות מסוג indels המושרות על ידי CRISPR/Cas9 מאפשר תיקוף יעיל של מטרות במחקר לבקרת וקטורים, ובכך מקצר את לוחות הזמנים של מחקרים פונקציונליים של גנים. ניתוח התכה ברזולוציה גבוהה (High-resolution melt analysis) תומך בביצוע גנוטיפינג ברמת קנה מידה ללא צורך בהקרבת האורגניזם, מה שמקל על ביצוע בדיקות פנוטיפיות והכלאות גנטיות בהמשך התהליך. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת זיהוי כמותי של מוטציות מדגימות רקמה מינימליות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי מהיר של indel בעקבות מוטגנזה של CRISPR.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי זיהוי אללים מוטנטיים ללא הקרבת אורגניזמים, ובכך משמר דגימות עבור בדיקות המשך.
- השפעה על הפורטפוליו: מאיץ תהליכי תיקוף של מטרות (target validation), ומאפשר תיעדוף מהיר יותר של מטרות גנטיות במערכות רלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר עקומות המסה פלואורסצנטיות מנורמלות המאפשרות השוואה כמותית בין גנוטיפים של טיפוס בר (wild-type) לבין גנוטיפים מוטנטיים.
- ערך תפעולי: תואם לפורמטים של פלטות בעלות 96 בארות, ובכך תומך בסריקה בעלת תפוקה בינונית של פרטים ערוכים.
- מוכנות הבדיקה: יוצר פרופילי המסה מובחנים עבור הטרוזיגוטים, הומוזיגוטים וטרנס-הטרוזיגוטים, מה שמאפשר שיוך אשכולות (cluster assignment) מהימן.
מחקרe טרנסלציונלי ופרה-קליני
- רצף תרגומי: מאפשר ביצוע גנוטיפינג ולאחריו פנוטיפינג או האכלת דם, ובכך מקשר בין שינוי גנטי לתוצאות תפקודיות במודלים של מחלות.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מסייע לאפיון של indel באמצעות ריצוף המשכי, מה שמאשר השפעות על המטרה (on-target) ומזהה שינויים פוטנציאליים מחוץ למטרה (off-target).
- תמיכה במודלים פרה-קליניים: מאפשר הקמה של שושלות מוטנטים ב-Aedes aegypti, וקטור מרכזי למחקרי העברת ארבּו-וירוסים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל ממוטגנזה באמצעות CRISPR ועד לזיהוי מועמדים (lead identification), ומספקת נקודת בקרה לגנוטיפינג לפני תיקוף תפקודי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי זיהוי מהיר של indels המשבשים את תפקוד הגנים במסלולים המטרה.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות ניתוח עקומות המסה מנורמלות ואשגור (clustering) מבוסס רפרנס.
- אנליטיקה: מייצר הסטות כמותיות בפרופיל ההמסה המתואמות לגודל ה-indel, מה שמאפשר ניתוח השוואתי בין דגימות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שינוי גנטי להערכה פנוטיפית על ידי מתן אפשרות לשימוש באורגניזמים חיים לאחר ביצוע גנוטיפינג.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן לשימוש חוזר במגוון אורגניזמים וגנים, כאשר הגמישות בתכנון הפריימרים תומכת ביישום רחב למטרות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את רמת הביטחון בחיזוי במהלך תיקוף המטרה על ידי אספקת ראיות ישירות לתוצאות עריכת הגנים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של PCR ואנליזת התכה עם בקרות מובנות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי צמצום הזמן והמשאבים הדרושים לסריקת מוטנטים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכון על ידי אישור נוכחות המוטציה לפני השקעה בבדיקות פנוטיפיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתכנון ואופטימיזציה של פריימרים, שכן גנים מסוימים עשויים לדרוש מספר סבבים של תכנון לצורך ביצוע HRMA יעיל.
- תלוי בציוד בעל בקרת עליית טמפרטורה מדויקת וגילוי פלואורסצנציה לצורך ניתוח המסה ברזולוציה גבוהה.
- מחייב הכנת דגימות סטנדרטית תוך שימוש ברקמת רגל ובריאגנטים לשחרור DNA כדי להבטיח איכות קלט עקבית.
- דורש דגימות ייחוס מסוג wild-type לצורך השמה מדויקת של אשכולות ונורמליזציה של פרופיל ההמסה.
- מוגבל בשל הצורך בריצוף לאחר HRMA כדי לאפיין באופן מלא indels ולזהות מוטציות נוספות ברצף המטרה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
