Name: בדיקה סלולרית מבוססת כתב לניטור יעילות חיבור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למד שיטה לניטור יעילות חיבור ב-HeLa באמצעות מערכת דיווח מיני-גן. חקור את השפעת מוטציות אתרי חיבור ופיתוח U1 snRNA מדכא לטיפול במחלות גנטיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי כספים ל- S.S. מהמכונים הלאומיים לבריאות (R21CA170786 ו- R01GM127464) ולאגודה האמריקאית לסרטן (מענק המחקר המוסדי 74-001-34-משמרות המהפכה) ול- S.S. ו- W.M מתוכנית שותפות המחקר בעמק (P1-4009 ו- VRP77). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Zhuang, Y., Weiner, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compensatory+base+change+in+U1+snRNA+suppresses+a+5%27+splice+site+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation.</a> Cell. 46 (6), 827-835 (1986).</li>
<li>Scotti, M. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mis-splicing+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA mis-splicing in disease.</a> Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).</li>
<li>Ward, A. J., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathobiology+of+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The pathobiology of splicing.</a> Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).</li>
<li>Scalet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-causing+variants+of+the+conserved+%2B2T+of+5%27+splice+sites+can+be+rescued+by+engineered+U1snRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutatation%22%5BJournal%5D)">Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs.</a> Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).</li>
<li>Yamazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+modified+U1+small+nuclear+RNA+for+rescue+from+exon+7+skipping+caused+by+5%27-splice+site+mutation+of+human+cathepsin+A+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene.</a> Gene. 677, 41-48 (2018).</li>
<li>Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+nuclear+RNA-mediated+modulation+of+splicing+reveals+a+therapeutic+strategy+for+a+TREM2+mutation+and+its+post-transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation.</a> Science Reports. 8 (1), 6937(2018).</li>
<li>Balestra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+mutations+impairing+CDKL5+expression+and+activity+can+be+efficiently+rescued+by+U1snRNA-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130(2019).</li>
<li>Donadon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-specific+U1+snRNAs+improve+ELP1+exon+20+definition+and+rescue+ELP1+protein+expression+in+a+familial+dysautonomia+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>Summer, H., Gramer, R., Droge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).</li>
<li>Dominski, Z., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+splice+sites+in+pre-mRNAs+with+short+internal+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons.</a> Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).</li>
<li>Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+repression+by+polypyrimidine+tract+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Exon repression by polypyrimidine tract binding protein.</a> RNA. 11 (5), 699-716 (2005).</li>
<li>Le Guedard-Mereuze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+contexts+that+determine+the+pathogenicity+of+base+substitutions+at+position+%2B3+of+donor+splice-sites%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites.</a> Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).</li>
<li>Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-loop+4+of+U1+snRNA+is+essential+for+splicing+and+interacts+with+the+U2+snRNP-specific+SF3A1+protein+during+spliceosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly.</a> Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).</li>
<li>Steitz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSteitz%2C+JA+%22Functions+of+the+abundant+U-snRNPs.+Structure+and+function+of+major+and+minor+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles%22">Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles</a>. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).</li>
<li>Fortes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+expression+of+specific+genes+in+mammalian+cells+with+5%27+end-mutated+U1+small+nuclear+RNAs+targeted+to+terminal+exons+of+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).</li>
<li>Roca, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+recognition+of+5%27+splice+sites+by+noncanonical+base-pairing+to+U1+snRNA+involving+bulged+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides.</a> Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).</li>
<li>Roca, X., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+atypical+5%27+splice+sites+by+shifted+base-pairing+to+U1+snRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA.</a> Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).</li>
<li>Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splice-switching+small+molecules%3A+A+new+therapeutic+approach+to+modulate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression.</a> Methods. 167, 134-142 (2019).</li>
<li>Hamid, F. M., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+underlying+position-specific+regulation+of+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).</li>
<li>Martelly, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+roles+for+human+U1+snRNA+stem-loops+in+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-18 (2021).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הבדיקה יכולה להיות מותאמת לניתוח חיבור בשורות תאים שאינם HeLa, עם זאת, גורמים המשפיעים על יעילות טרנספקטיה, כגון מפגש תאים וכמות של DNA ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה. יחס מבנה הכתב ל- U1 הוא פרמטר קריטי נוסף שייתכן שיהיה צורך לקבוע בהתאם לרמות הביטוי שנצפו בסוגי תאים אחרים. איכות הרנ"א המופק היא קריטית לניתוח חיבור; לכן, השימוש במים ללא RNase וטיהור של משטחים עם סוכני השבתה RNase מומלץ מאוד.
ניתוח של תמלילי עיתונאים על ידי הרחבת פריימר או פלואורסצנטי RT-PCR מניבים תוצאות דומות, ולכן כל טכניקה י...

חיבור טרום-mRNA הוא שלב עיבוד חיוני שמסיר אינטרונים שאינם מקודדים ובדיוק ליגטות exons קידוד כדי ליצור mRNA בוגר. הכרה ברצפי קונצנזוס בצמתים אקסון-אינטרון, המכונים אתר 5′-splice ואתר 3′-splice, על ידי רכיבים של מכונות החיבור יוזמת את תהליך החיבור. ריבונוקלאופרוטאין גרעיני קטן U1 (snRNP) מזהה את האתר 5′-splice על ידי זיווג בסיס של SnRNA U1 לקדם mRNA1. מוטציות תורשתיות גנטית שמשנות 5′-splice רצפי אתר קשורים למחלות רבות2,3. זה צפוי כי אובדן basepairing של U1 snRNA עם אתרי מוטציה 5′-splice גורם חיבור חריג, אשר יכול לסכן את התרגום של התמליל המושפע. גישה טיפולית פוטנציאלית לתיקון פגמי החיבור כרוכה בדיכוי מוטציות על ידי U1 snRNA שונה הנושא שינויים נוקלאוטידים מפצים באזור 5′שלו כי basepairs עם אתר 5′-splice. כזה שונה U1 snRNAs, המכונה גם exon ספציפי U1 snRNAs, נמצאו יעילים בהיפוך פגמים חיבור, וכתוצאה מכך ביטוי חלבון מוגבר מן mRNA4,5,5,6,7,8.
כאן, אנו מתארים את בדיקת ההשלמה של U1 snRNP, בדיקת חיבור סלולרי המבוססת על כתב המאפשרת הערכה של ההשפעה של מוטציות 5′-ss על חיבור של אקסון וניתן להשתמש בה גם לפיתוח של U1 snRNAs שונה כדי לאפשר את ההצלה של הכללת exon. אנו מספקים גם פרוטוקולים לניטור תמלילי הכתבים המשולבים על ידי הרחבת פריימר ו- RT-PCR, ולקביעת הביטוי של U1 snRNAs שונה על ידי הרחבת פריימר ו- RT-qPCR.

<table><tbody><tr><td>ריאגנט דרגת ריאגנט מים נטולי יונים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-751628</td><td></td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5758-25ML</td><td></td></tr><tr><td>חבילת אבקת נשר בינוני שונה (DMEM) של Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS), מקור אוסטרלי,</td><td>אומגה מדעית</td><td>מומת בחום FB-22</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4458-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד, פתרון סטנדרטי 1.0N</td><td>חומצה</td> הידרוכלורית <td>S2567-16A</td><td></td></tr><tr><td>, מוסמכת ACS פלוס, 36.5 עד 38.0%</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מסננים חד פעמיים לבקבוקי PES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB12566510</td><td></td></tr><tr><td>EDTA מלח דיסודיום דיהידרט</td><td>אמרסקו</td><td>0105-2.5 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>2.5% טריפסין (פי 10), ללא פנול אדום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר ביוריאגנט</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר ביו-ריאגנט</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>דיסודיום מימן פוספט Heptahydrate</td><td>פישר Bioreagent</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט</td><td>פישר ביוריאגנט</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>מדיום טרנספקציה - Opti-MEM ו-trade; I סרום מופחת בינוני, ללא פנול אדום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה - ליפופקטמין ומסחר; 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&trade; ריאגנט</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם (כ-0.75% אתנול כחומר משמר/ביולוגיה מולקולרית)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, אבסולוט (200 הוכחה), דרגת ביולוגיה מולקולרית, Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול, כיתה ביולוגיה מולקולרית, Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2618-212</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן (5 מ"ג/מ"ל)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2052</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml עופרת, 1 mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG035C001MC</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>גודל אי הכללה - Sephadex&reg; G-25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2580-10G</td><td></td></tr><tr><td>אי הכללת גודל מיני עמודות</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1415-0600</td><td></td></tr><tr><td>pBR322 DNA-MspI Digest</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>N3032S</td><td></td></tr><tr><td>סמן משקל מולקולרי נמוך, 10-100 nt</td><td>Affymetrix</td><td>76410 100 UL</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנטים משביתים Rnase - RNaseZAP&trade;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R2020-250 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 מ"מ ea)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT&trade; מעכב ריבונוקלאז רקומביננטי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28025013</td><td>המשמש להארכת פריימר</td></tr><tr><td>Taq DNA פולימראז</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>בוחן אקראי (50 ומיקרו; M)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>מיקס PCR בזמן אמת - SYBR&trade; בחר מאסטר מיקס</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td>המשמש להכנת cDNA</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>5X First-Strand Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>Formamide (&ge; 99.5%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td>סקירת גיליונות נתוני בטיחות חומרים</td></tr><tr><td>ברומופנול מלח נתרן כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>114405-5G</td><td></td></tr><tr><td>קסילן ציאנול FF</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>טריס בסיס (גבישים לבנים או אבקה גבישית / ביולוגיה מולקולרית)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית (גבישית / אלקטרופורזה)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד: ביס-אקרילאמיד 19:1 (40% תמיסה/אלקטרופורזה)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1406-1</td><td>סקירת גיליונות נתוני בטיחות חומרים</td></tr><tr><td>אוריאה (גבישים חסרי צבע עד לבן או אבקה גבישית/מול. ביול.)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרוקסודיסולפט (APS) &ge; 98%, Pro-Pure, Proteomics Grade</td><td>VWR</td><td>M133-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) &GE; 99%, Ultrapure</td><td>VWR</td><td>0761-25ML</td><td>סקירת גיליונות נתוני בטיחות חומרים מערכות</td></tr><tr><td>ג'ל לוחות מתכווננות, Expedeon</td><td>VWR</td><td>ASG-400</td><td></td></tr><tr><td>עטיפת ג'ל אנכית וסחר; ערכות צלחות זכוכית, 16.5 x 14.5 ס"מ</td><td>VWR</td><td>NGP-125NR</td><td></td></tr><tr><td>עטיפת ג'ל אנכית וסחר; ערכות צלחות זכוכית, 16.5 x 22.0 ס"מ</td><td>VWR</td><td>NGP-200NR</td><td></td></tr><tr><td>עטיפת ג'ל אנכית וסחר; ערכות צלחות זכוכית, 16.5 x 38.7 ס"מ</td><td>VWR</td><td>NGP-400NR</td><td></td></tr><tr><td>GE מסכי זרחן אחסון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>GE28-9564</td><td></td></tr><tr><td>טייפון וסחר; FLA 7000 Biomolecular Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9610-73 AB</td><td></td></tr><tr><td>בקמן קולטר LS6500 מונה נצנוץ נוזלי</td><td>GMI</td><td>8043-30-1194</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex מערכות PCR בזמן אמת</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקה סלולרית מבוססת כתב לניטור יעילות חיבור

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

במהלך ביטוי הגנים, השלב החיוני של חיבור טרום mRNA כרוך בזיהוי מדויק של אתרי חיבור והרכבה יעילה של מתחמים spliceosomal להצטרף exons ולהסיר introns לפני ייצוא cytoplasmic של mRNA בוגר. יעילות חיבור יכולה להשתנות על ידי נוכחות של מוטציות באתרי חיבור, ההשפעה של גורמי חיבור טרנס-פעולה, או את הפעילות של טיפולית. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לבדיקה סלולרית שניתן ליישם לניטור יעילות החיבור של כל אקסון נתון. הבדיקה משתמשת בפלסמיד אדפטיבי המקודד 3-exon/2-intron minigene כתב, אשר יכול לבוא לידי ביטוי בתאי יונקים על ידי טרנספקטיבה חולפת. לאחר ההעברה, הרנ"א התאי הכולל מבודד, והיעילות של חיבור אקסון ב-mRNA הכתב נקבעת על ידי הרחבת פריימר או תגובת שרשרת חצי כמותית הפוכה תמלול-פולימראז (RT-PCR). אנו מתארים כיצד ניתן לקבוע כיצד ניתן לקבוע את ההשפעה של מחלות הקשורות 5′ מוטציות באתר splice-site על ידי הצגתם בכתב; וכיצד ניתן להשיג את הדיכוי של מוטציות אלה על ידי שיתוף טרנספקטיה עם U1 קטן גרעיני RNA (snRNA) לבנות נושא מוטציות מפצות באזור 5 ′ שלה כי basepairs עם אתרי 5 ′-splice בצמתים exon-intron ב pre-mRNAs. לכן, הכתב יכול לשמש לעיצוב של חלקיקי U1 טיפולית כדי לשפר את ההכרה של מוטציה 5′ splice-sites. החדרת אתרים רגולטוריים הפועלים cis- פועל, כגון חיבור משפר או רצפי משתיק קול, לתוך הכתב יכול לשמש גם כדי לבחון את התפקיד של U1 snRNP ברגולציה בתיווך על ידי גורם חיבור חלופי ספציפי. לבסוף, כתב המבטא תאים יכול להיות דגירה עם מולקולות קטנות כדי לקבוע את ההשפעה של טיפוליים פוטנציאליים על חיבור לפני mRNA המכונן או על exons נושא אתרי מוטציה 5 ′ splice. בסך הכל, בדיקת הכתב ניתן ליישם כדי לפקח על יעילות splicing במגוון רחב של תנאים כדי ללמוד מנגנונים חיבור בסיסיים ומחלות הקשורות splicing.

כתב ההסתבכות Dup51, מיניגן תלת-שני אקסון-2, נגזר מהגן האנושי β-גלובין ומתואר בעבר (איור 1A)11,12 . יצרנו כתב מוטציה, Dup51p, על ידי החדרת תסמונת אשר הקשורים 5-splice מוטציות באתר המתרחשות exon 3 של protocadherin 15 (PCDH15) gene13. רצף האתרים של 5-splice בצומת אקסון 2-אינטרון 2 השתנה מ- CAG / GUUGGUAUC ל- AUG / GUGUAUC (/ הוא גבול האקסון-אינטרון) (איור 1B)<sup class="xref...

פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית minigene כדי לפקח על ההשפעה של מוטציות באתר 5-splice באתר על חיבור ומפתח מדכא U1 snRNA להצלת עיכוב חיבור המושרה מוטציה. הכתב והמדכא U1 snRNA מבנים באים לידי ביטוי בתאי HeLa, ו splicing מנותח על ידי הרחבת פריימר או RT-PCR.

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

פרוטוקול זה מתאר בדיקה סלולרית לניטור יעילות חיבור, באמצעות כתב ניהול הסתגלות. מאמר זה Assay יכול לשמש כדי ללמוד את ההשפעות של מוטציות הקשורות למחלה באתרי אקסון או חיבור, וכדי לעצב טיפול, חלקיק אחד במיוחד, כדי לשפר את ההכרה של מוטציה לאתרי חיבור חמש נקודות. המעבר בתאי הלה שואפים את המדיום המבוזבז ודגור את התאים עם שלושה מיליליטרים של 0.2 5% נסיעות המכילות EDTA מילימולרי אחד, ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.לאחר הדגירה בשבעה מיליליטר של DMEM טרי ולהעביר את ההשעיה התא לצינור 10 מיליליטר. צנטריפוגה התאים. לאחר מכן resuspend גלולה התא ב 10 מיליליטר של DMEM טרי, צלחת התאים על צלחת תרבית רקמות חדשה ב 20% מפגש, עבור transsfection של חולף.לספור את תאי hela עם שקופית ציטומטר hemo נקי ולהכין השעיה עם צפיפות של 2.5 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר, זרע מיליליטר אחד של השעיית התא לתוך כל באר של צלחת 12 היטב ודגור לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת לשאוף את המדיום בילה ולהוסיף 800 microliters של DMEM טרי עם סרום לצלחת. הכינו את תערובות הטרנספקטיון ומערבולת אותם במשך 15 שניות.לאחר מכן צנטריפוגות התערובות ודגור אותם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר הדגירה להוסיף את כל 200 microliters של תערובת transfection לתוך באר אחת של 12 צלחת תא הלה היטב כדי להשיג נפח סופי של מיליליטר אחד לכל באר, ודגור הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. תגובות התיוג המוכנות מדגרות.הקדישו מחדש את חרוזי ההרחקה המולקולריים במשקל 25 קילו של דלטון על ידי מערבולת עדינה למשך 10 שניות. הבא להעביר 600 microliters של חרוזים resuspended לעמודה מיני חד פעמית, להציב בצינור איסוף 1.5 מיליליטר, ולהחזיר את מלאי החרוזים לארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה העמודה ולהשליך את הזרימה דרכם.לאחר מכן לשטוף את החרוזים פעמיים על ידי הוספת 300 מיקרוליטרים של מים חינם RNA לעמודה. לאחר השטיפה השנייה, העבירו את העמוד המצומצם לצינור צנטריפוגות חדש של 1.5 מיליליטר, והוסיפו את תערובת התגובה של קינאז לעמודה. צנטריפוגה העמודה ולאסוף את הזרימה דרך המכיל P32 שכותרתו oligonucleotides.הוסיפו שני מיקרוגרמים של RNA המופקים מתאי המסוק ל-200 צינורות מיקרו-צנטריפוגות מיקרו-ליטר והוסיפו מים נטולי RNA כדי לפצות את הנפח ל-6.55 מיקרוליטרים. לאחר מכן להוסיף 0.9 microliters מאסטר לערבב אחד לכל צינור PCR המכיל את דגימות RNA, ולדגור את הצינורות תחילה ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן על קרח במשך דקה אחת. הבא ב 2.55 microliters, תערובת מאסטר שתיים, לכל צינור המכיל RNA ומאסטר לערבב אחד, ולדגור את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.לאחר הדגירה להעביר את הצינורות למחזור תרמי ודגור תחילה ב 50 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, ולאחר מכן ב 70 מעלות צלזיוס, במשך 15 דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של צבע טעינת RNA פורממיד פי 2 לכל דגימה, והמשיכו להפריד את הקטעים לפי דף UIA. סינתזת דנ"א של פרסי.הוסיפו שני מיקרוגרמים של RNA המופקים מתאי ההלה שעברו טרנסצנטריפוגה, ל-200 צינורות מיקרו-צנטריפוגות מיקרו-ליטר והוסיפו מים חופשיים של RNAs כדי לפצות את הנפח ל-11 מיקרוליטרים נמוכים. לאחר מכן, מוסיפים שני מיקרוליטרים, מאסטר לערבב אחד לכל מדגם ודגור תחילה ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן על קרח במשך דקה אחת. לאחר מכן, להוסיף שבעה microliters, מאסטר לערבב שניים לכל צינור ולדגור את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ואחריו דגירה ב 50 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ו 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.לאחר מכן, עבור PCR לדלל את תגובת ה- DNA C להניב ריכוז של 100 ננוגרם לכל מיקרוליטר, ולהעביר מיקרוליטר אחד של כל מדגם CDNA לצינורות PCR חדשים. הוסף 10.5 מיקרוליטרים של התערובת הראשית לכל צינור המכיל CDNA, ובצע את ה- PCR. שימוש בתרמוציקלר לאחר השלמת ה- PCR.הוסף 12.5 מיקרוליטרים של צבע טעינת DNA פורממיד 2X לכל צינור. לחמם את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולהמשיך לבצע דף UIA. פיפטה חמישה מיקרוליטרים של CDNA מדולל לתוך בארות בודדות של צלחת qpcr 96-well משולש.לאחר מכן להוסיף 10 microliters של תערובת PCR בזמן אמת לכל באר, לאטום את הצלחות עם סרט אופטי, צנטריפוגה כדי לאסוף את התגובות לתחתית הבארות, ולאחר מכן לבצע את qpcr תוך איסוף ערכי מחזור כימות הסף של משרעת היעד. לפני טעינת הסמנים והדגימות, לשטוף את הבארות עם מאגר TBE כדי להסיר את האוריאה מיושבת. לאחר מכן לטעון 10 microliters של כל מדגם לכל באר ולהפעיל את הג'ל ב 300 עד 500 וולט במשך שעתיים עד שלוש שעות, או עד קסילן מגיע לתחתית.לאחר אלקטרופורזה להסיר את לוחות הזכוכית ממנגנון אלקטרופורזה ולהפריד בזהירות את שתי הצלחות, כך הג'ל שוכב שטוח על כל משטח זכוכית, ולאחר מכן להעביר את הג'ל על נייר סינון לכסות אותו עם ניילון נצמד, באמצעות ואקום מייבש ג'ל לייבש את הג'ל ב 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, לאחר מכן מניחים את הג'ל היבש בקלטת הדמיה זרחנית לדגירה לילית בטמפרטורת החדר. כאשר הוא בא לידי ביטוי בתאי הלה, כתב החיתוך dup 51 minnijean מבטא את התמליל הבוגר באורך מלא שבו אקסון 2 הוא משולב ביעילות. חמש המוטציות העיקריות באתר החיבור ו-dup 51 P מפחיתות את ההכללה השנייה של אקסון מ-95% ל-30% מה שמוביל להיווצרות תעתיק קצר יותר.ביטוי משותף של dup 51 P עם U15A SNRNA מציל את אקסון שני חיבורים, ומשחזר את היווצרות התמליל באורך מלא. לעומת זאת, ביטוי משותף עם סוג פראי U1 או U15G וריאנט אין השפעה דומה על חיבור dup 51P. זיהוי של תמלילי וריאנט U15A, על ידי הרחבה ראשונית משתמש U1 שבע עד 26 oligo נוקלאוטיד, שהוא 20 נוקלאוטידים ארוכים וזוגות בסיס ליד האדנין במיקום החמישי של U1 SNRNA.בנוכחות DATP לבד, U1 שבע עד 26 מאפשר שילוב של שניים עד שלושה נוקלאוטידים עבור סוג הבר האנדוגני U1 SNRNA מניב מוצר ארוך 22 או 23 נוקלאוטידים. עבור U15A ו U15G גרסאות הרחבה מסתיימת לאחר הוספת אדנוזין יחיד לייצר מוצר נוקלאוטיד 21. לאחר הנורמליזציה לביטוי U2 SNRNA, גרסאות U1 5g ו- U15A מסוג U1 שהוחלפו באו לידי ביטוי בשלושה עד חמישה קיפולים מעל SNRNA האנדוגני.איכות הרנ"א שחולצה היא קריטית לניתוח חיבור. לכן, השימוש במים ללא RNA, וטיהור של שירותים עם סוכני השבתה RNAs מומלץ מאוד. מערכת הדיווח המתוארת כאן ניתן ליישם כדי ללמוד את התפקיד של U1 SN RNAs בתקנות חיבור עבור היפוך ההשפעה של מחיר פלאש חיבור מוטציות עבור השתקת גנים באמצעות שינוי U1SN RNAs.

a-reporter-based-cellular-assay-for-monitoring-splicing-efficiency

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול להכנת חזקים, בקנה מידה קטן תמציות הלה גרעיני מתואר. פרוטוקול זה הוא בעל ערך עבור מבחני הדורשים שימוש של אוכלוסיות קטנות של תאים, כגון תאים שטופלו בתרופות או RNAi. השיטה צריכה להיות ישים למגוון רחב של ביטוי גנים מבחני סוגי תאים אחרים, כולל תאים חולים.

בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

הוכח כי ויסות שחבור חלופי תורם למעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), תוכנית תאית חיונית בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן אנו מתארים שיטה המשתמשת במודל EMT הניתן להשראה לזיהוי שחבור חלופי במהלך EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

אירועי שחבור טנדם מתרחשים באתרים המרוחקים פחות מ-12 נוקלאוטידים זה מזה. כימות יחסים של גרסאות חיבור כאלה אפשרי באמצעות גישת PCR כמותית מוחלטת. כתב יד זה מתאר כיצד ניתן לכמת וריאנטים של הגן STAT3, שבהם שני אירועי שחבור מביאים להכללה/אי הכללה של Serine-701 ו-α/β C-termini.

מיזוג במונחים מוחלטים ובאופן יחסי PCR כמותי נתונים לכמת STAT3 אחוי Variant תעתיקים

כאן אנו מתארים פרוטוקול שנועד לבחון את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, נתחנו את פרופילי transcriptomic דגמים הוריים ועמידים במבחנה באמצעות RNA-seq והקמתי שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גני מועמדים.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

בחיי עיר הכלאה (איש) פרוטוקול המשתמשת oligonucleotides antisense קצר כדי לזהות דפוסים חלופיים pre-mRNA splicing בסעיפים מוח העכבר מתואר.

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

SINEUPs הם סינתטיים antisense ללא קידוד RNAs, אשר מכילים תחום הכריכה (BD), תחום אפקטור (אד) ו- up-לווסת את התרגום של יעד ה-mRNA. כאן, אנו מתארים שיטות איתור עבור SINEUPs של שורות תאים בתרבית, ניתוח של פעילותם קידום תרגום על ידי המערב-כתם של תפוקה גבוהה חצי אוטומטי מערכת הדמיה.

תא המבוסס על מבחני של SINEUP ללא קידוד RNAs זה במיוחד יכולה לשפר את התרגום mRNA

פרוטוקול זה מציג כלי מהיר ושימושי להערכת תפקידו של חלבון עם פונקציה לא אופיינית בוויסות חיבור חלופי לאחר טיפול כימותרפי.

שימוש בכלי המיני-דג'ן E1A לחקר שינויי ההסתבכות של mRNA

בדיקת ACT1-CUP1, בדיקת גידול נחושת, מספקת קריאה מהירה של שחבור RNA שליח מבשר (pre-mRNA) וההשפעה שיש לגורמי שחבור מוטנטיים על תפקוד השחבור השחבור. מחקר זה מספק פרוטוקול ומדגיש את ההתאמה האישית האפשרית כדי להתמודד עם שאלת השחבור המעניינת.

מבחני ACT1-CUP1 קובעים את הרגישויות הספציפיות למצע של מוטנטים שחבורים בשמרים ניצנים

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

אנו מציגים פרוטוקולים להערכת מיומנות מסלול תיקון שבר גדיל כפול בתאים באמצעות חבילה של מצעי כתב חוץ-כרומוזומליים מבוססי לומינסנציה.

הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול DNA באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב

למד שיטה לניטור יעילות חיבור ב-HeLa באמצעות מערכת דיווח מיני-גן. חקור את השפעת מוטציות אתרי חיבור ופיתוח U1 snRNA מדכא לטיפול במחלות גנטיות.

בדיקה סלולרית מבוססת כתב לניטור יעילות חיבור

גלה סרטונים נוספים