התגבשות על השבב ודיפרקציה טורית בקנה מידה גדול בטמפרטורת החדר

פרוטוקול זה מדגים התגבשות חלבונים על מכשיר דמוי שבב בהיזכרות נתוני עקיפת קרני רנטגן. מכשיר זה נקרא גביש על גביש מכיוון שגבישי חלבון גדלים על גביש קוורץ יחיד. לאחר גידול מוצלח של גבישי חלבון במכשירים כאלה, אלפי תמונות עקיפה נאספות מכל מכשיר בטמפרטורת החדר מבלי לגעת אפילו בגבישי החלבון.

עקיפת קרני רנטגן בטמפרטורת החדר חיונית מאוד לחקר תפקוד חלבונים המערבים מצבי קונפורמציה רבים. שינויים אינפורמטיביים אלה בחלבון או פעולות חלבון יכולים להיות קפואים, ולכן לא ניתן לזהות קריו-קריסטלוגרפיה. ניתן להשתמש במכשירים אלה כדי לחקור תהליכי איתות הנגרמים על-ידי אור ושינויים בחמצון-חיזור.

רק קומץ מכשירים מספק ערכות נתונים שלמות ומתירות. כדי להתחיל בהרכבה מראש של ההתקן, תייג את הטבעת החיצונית לזיהוי הדגימה. כלול את שם הפרויקט, מספר ההתקן, מצב ההתגבשות והתאריך כרצונך.

לאחר מכן מניחים את הטבעת המסומנת במהופך על משטח נקי ומניחים פרוסת קוורץ אחת בתוך הטבעת החיצונית. לאחר מכן, יוצקים כמות קטנה של שמן טבילה במיקרוסקופ לתוך צלחת פטרי וטובלים שים בשמן כדי להבטיח ששני צידי הים מצופים היטב. הסירו את עודפי השמן על ידי טפיחת השמים על משטח נקי.

לאחר מכן מניחים את השים המשומן על גבי פרוסת הקוורץ הראשונה. ערבבו את תמיסת החלבון וחיץ ההתגבשות על פרוסת הקוורץ הראשונה באמצעות פיפטה. נסו להימנע מבועות אוויר בעת הערבוב.

הנפח הכולל של תמיסת ההתגבשות לא יעלה על הקיבולת המרבית של תא ההתגבשות שנקבע על ידי גודל ועובי השיים. מניחים את פרוסת הקוורץ השנייה מעל התמיסה המעורבת. הפתרון יתפשט באופן ספונטני.

לאחר מכן יש להקיש קלות על פרוסת הקוורץ השנייה על הקצה כדי לסייע בפיזור השמן תוך כדי דחיפת האוויר החוצה. אבטח את ההתקן על-ידי הברגת טבעת תמך לתוך הטבעת החיצונית. במידת הצורך, השתמש בכלי הידוק.

הימנעו מהידוק יתר מכיוון שהוא עלול לגרום לפלים עדינים של קוורץ להתעוות או להיסדק. אחסנו את המכשירים המורכבים בקופסה בטמפרטורת החדר או בתוך אינקובטור מבוקר טמפרטורה. לאחר מספר שעות או ימים, הניחו את מכשיר ההתגבשות מתחת למיקרוסקופ ועקבו אחר צמיחת הגבישים.

במידת הצורך, מטב את תנאי ההתגבשות כמתואר בכתב היד. לצורך כיול, התקן גביש YAG דק על מחזיק השבב, ולאחר מכן התקן את תחנת הקרן. לאחר מכן, פתח את תוכנת Insitux והפעל את התוכנית המצוינת כדי לצלם תמונות פלואורסצנטיות של קרני רנטגן של הקרן הישירה שבה המכשיר הוא שם שנבחר על ידי המשתמש עבור התקן ההתגבשות וההתקן.

param הוא שם הקובץ המכיל פרמטרי בקרה ספציפיים להתקן. לאחר מכן מצא את המיקום המדויק של קרן הרנטגן הישירה על ידי הפעלת תוכנית התאמת פרופיל הקרן שבה תמונת הצריבה היא שם הקובץ של תמונת הרנטגן הפלואורסצנטית. לסריקה אופטית, הנח התקן התגבשות במחזיק השבב ואבטח באמצעות אגודל.

לאחר מכן הרכב את מחזיק השבב על שלב התרגום של הדיפרקטומטר באמצעות מנגנון קינמטי. בהתאם לרגישות האור של דגימת החלבון ומטרת הניסוי, התקן מקור אור לבן או אינפרא אדום כדי לקחת מיקרוגרפים מהחלון האופטי של המכשיר. לאחר שההתקנה מוכנה, הפעל את תוכנית הסריקה על ידי הזנת הפקודה המצוינת לסריקה בתנועה בקו הקרן.

לאחר מכן הפעל את תוכנית הריצוף במחשב משתמש שבו x הוא הערך ההתחלתי עבור העמודה ו- y הוא הערך ההתחלתי עבור תזוזות סוררות של מיקרוגרפים. התוכנה תופרת את כל המיקרוגרפים למונטאז' של פיקסל אחד עד שלושה מיקרומטר. לאחר תפירת המיקרוגרפים, הזן את הפקודה המצוינת כדי להפעיל את תוכנית מציאת הגבישים.

תוכנית זו מבצעת זיהוי גבישים ותכנון ירי והפרמטרים המרכזיים בתוכנית זו מאפשרים בחירת גביש ספציפי ותכנון מטרה. הסר את מקור האור ומקם את נקודת העצירה של האלומה. לאחר מכן הפעל את תוכנית איסוף הנתונים עבור עקיפה טורית.

הפקודה המוצעת מפעילה איסוף נתונים על-ידי ביקור בצילומים המתוכננים ברצף מתוכנת מראש. כל גביש ממוקד עובר טרנסלוקציה למיקום הקרן. בכל תחנה מתבצעת חשיפה לקרני רנטגן עם או בלי תאורת לייזר בהשהיה מתוזמנת בזמן.

במחקר הושוו תנאי ההתגבשות בין דיפוזיית אדים לאצווה על השבב. ארבעה מקרי בוחן של התגבשות על השבב וערכות נתונים מייצגות שנאספו ישירות מהתקני קוורץ מודגמים כאן. ניסויי הקריסטלוגרפיה הדינמיים חשפו שינויים הנגרמים על ידי אור בחלבון פוטורצפטור אדום רחוק על ידי השוואת נתונים מ-4, 352 גבישים בחושך ו-8, 287 גבישים לאחר תאורת אור.

מערך הנתונים הכהה מ-in situ serial Laue diffraction הביא לפתרון טוב יותר של צפיפות אלקטרונים, מה שאפשר בניית מודל בטוחה של כרומופור בילין בקונפורמציה של כל סימן Z. מפות ההפרש המושרות באור חשפו תנועות מרוכזות בגיליון הבטא המרכזי, מה שמרמז על החשיבות של ערימת הפי-פי בין טבעות הפירול של הכרומופור לבין מספר שאריות ארומטיות. פלטפורמה זו נקראת Insitux.

היתרון הייחודי של פלטפורמה זו הוא שלא צריך לעשות שום מניפולציה גבישית ברגע שההתגבשות נעשית. יש צורך לאסוף מערכי נתונים רבים בתנאים משתנים כדי ללכוד את תנועות החלבון. וזה מתאפשר עם Insitux מכיוון שהוא מאפשר איסוף נתונים בקנה מידה גדול מאלפי גבישי חלבון בטמפרטורת החדר.

עם יכולת חדשה זו הכוללת קריסטלוגרפיה, ניתן להפעיל את המערכות הרגישות לאור בתוך המכשיר ולחקור את מערכת אינרטיית האור אם התקן הגביש על הגביש מומר לזרימות חיצוניות.