Name: יצירת חומרים מהונדסים ונוקאאוטים במינים סטרונגילואידים על ידי מיקרו-אינטגרציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: למד שיטת מיקרו-אינטגרציה תוך-ביצית ליצירת נוקאאוטים וחומרים מהונדסים בנמטודות Strongyloides stercoralis ו-S. ratti. טכניקה זו מאפשרת חקר פונקציית גנים ומנגנוני טפילות בפארזיטולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

pPV540 ו- pPV402 היו מתנות חביבות מד"ר ג'יימס לוק מאוניברסיטת פנסילבניה. אנו מודים לאסטרה בראיינט על הערות מועילות על כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי חוקרי קרן בורוז-וולקום בפרס הפתוגנזה של מחלות, פרס חוקר הפקולטה של המכון הרפואי ע"ש הווארד יוז, והמכונים הלאומיים לבריאות R01 DC017959 (E.A.H.).

<ol><li>Krolewiecki, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+health+response+against+Strongyloides+stercoralis%3A+time+to+look+at+soil-transmitted+helminthiasis+in+full%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165(2013).</li>
<li>Buonfrate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+prevalence+of+Strongyloides+stercoralis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection.</a> Pathogens. 9 (6), 468(2020).</li>
<li>Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+functional+genomics+for+parasitic+nematodes+of+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals.</a> Journal of Experimental Biology. 223, Pt Suppl 1 206482(2020).</li>
<li>Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22WormBook%22">WormBook</a>. , ed. The C. elegans Research Communnity (2006).</li>
<li>Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLok%2C+JB+%22WormBook%22">WormBook</a>. , ed. The C. elegans Research Communnity (2013).</li>
<li>Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+genetic+transformation+of+Strongyloides+stercoralis+by+microinjection+of+plasmid+DNA+constructs+into+the+male+germline%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline.</a> International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).</li>
<li>Schafer, T. W., Skopic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasites+of+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gastroenterology+Reports%22%5BJournal%5D)">Parasites of the small intestine.</a> Current Gastroenterology Reports. 8 (4), 312-320 (2006).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22The+C.+elegans+Research+Community%2C+WormBook%22">The C. elegans Research Community, WormBook</a>. , (2006).</li>
<li>Gang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+a+human-parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode.</a> PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675(2017).</li>
<li>Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLok%2C+JB+%22The+C.+elegans+Research+Community%2C+WormBook%22">The C. elegans Research Community, WormBook</a>. , (2007).</li>
<li>Hawdon, J. M., Schad, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storage+of+hookworm+infective+larvae+in+buffered+saline+solution+maintains+larval+responsiveness+to+host+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Helminthological+Society+of+Washington+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals.</a> Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Junio, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongyloides+stercoralis%3A+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3%27+UTR%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).</li>
<li>Gang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+mechanisms+of+host+seeking+and+infectivity+in+skin-penetrating+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).</li>
<li>Bryant, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+thermosensation+in+host+seeking+by+skin-penetrating+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes.</a> Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).</li>
<li>Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+transfection+and+transgenesis+in+parasitic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes.</a> Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).</li>
<li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+chromosomal+integration+of+transgenes+in+the+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti+and+establishment+of+stable+transgenic+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871(2012).</li>
<li>Lok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac%3A+a+vehicle+for+integrative+DNA+transformation+of+parasitic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+Genetic+Elements%22%5BJournal%5D)">piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes.</a> Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417(2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transgenesis+of+the+parasitic+nematode+Strongyloides+stercoralis+requires+endogenous+non-coding+control+elements%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements.</a> International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).</li>
<li>Bryant, A. S., Hallem, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wild+Worm+Codon+Adapter%3A+a+web+tool+for+automated+codon+adaptation+of+transgenes+for+expression+in+non-Caenorhabditis+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes.</a> G3. 3 (7), (2021).</li>
<li>Crane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurements+reveal+a+single+5%27-intron+is+sufficient+to+increase+protein+expression+level+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo measurements reveal a single 5'-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans.</a> Scientific Reports. 9 (1), 9192(2019).</li>
<li>Han, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+transgenesis+efficiency+and+CRISPR-associated+tools+through+codon+optimization+and+native+intron+addition+in+Pristionchus+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes.</a> Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).</li>
<li>Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+transfection+enhances+RNAi+and+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+non-model+nematode+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems.</a> Scientific Reports. 9 (1), 483(2019).</li>
<li>Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+culture+conditions+for+free-living+stages+of+the+nematode+parasite+Strongyloides+ratti%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti.</a> Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).</li>
<li>Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+morph+development+in+the+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).</li>
<li>Kim, A., Pyykko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters%3A+versatile+use+of+PiggyBac+transposons+as+a+genetic+manipulation+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).</li>
<li>Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+Strongyloides+and+related+parasitic+nematodes%3A+historical+perspectives%2C+current+functional+genomic+applications+and+progress+towards+gene+disruption+and+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing.</a> Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).</li>
<li>Farboud, B., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+enhancement+of+genome+editing+by+CRISPR%2FCas9+through+improved+guide+RNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design.</a> Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).</li>
<li>Cheong, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nuclear+receptor%2Fcoactivator+developmental+signaling+pathway+in+the+nematode+parasite+Strongyloides+stercoralis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118(2021).</li>
<li>Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongyloides+stercoralis%3A+the+first+rodent+model+for+uncomplicated+and+hyperinfective+strongyloidiasis%2C+the+Mongolian+gerbil+%28Meriones+unguiculatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus).</a> Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+the+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).</li>
<li>Viney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+life+cycle+of+Strongyloides+ratti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Today%22%5BJournal%5D)">Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti.</a> Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).</li>
<li>Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongyloides+stercoralis+age-1%3A+a+potential+regulator+of+infective+larval+development+in+a+parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode.</a> PLoS ONE. 7 (6), 38587(2012).</li>
<li>Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+Strongyloides+stercoralis+infective+larvae+requires+the+DAF-16+ortholog+FKTF-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1.</a> PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370(2009).</li>
<li>Douglas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+expression+of+a+T+cell+epitope+in+Strongyloides+ratti+reveals+that+helminth-specific+CD4%2B+T+cells+constitute+both+Th2+and+Treg+populations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations.</a> PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709(2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

פרוטוקול מיקרו-איניג'קציה זה מפרט את השיטות להחדרת מבנים לטרנסגנזה ומוטגנזה בתיווך CRISPR/Cas9 לתוך S. stercoralis ו-S. ratti. הן עבור S. stercoralis והן עבור S. ratti, ההישרדות לאחר ההזרקה ושיעור הטרנסגנזה או המוטגנזה כפופים למספר משתנים הניתנים לכוונון עדין.
השיקול הקריטי הראשון לטרנסגנזה מוצלחת הוא האופן שבו טרנסג'נדרים פלסמידים נבנים. מחקרים קודמים מצאו כי ביטוי של טרנסגנים אקסוגניים ב-Strongyloides דורש שימוש במקדמי Strongyloides 5' ו...

סטרקוראליס סטרקורליס סטרונגילואידס כבר מזמן התעלמו ממנו כפתוגן אנושי חשוב בהשוואה לתולעי הקרס המוכרות יותר ולתולעת העגולה Ascaris lumbricoides1. מחקרים קודמים על נטל התולעים לעתים קרובות העריכו באופן חמור את השכיחות של S. stercoralis בשל הרגישות הנמוכה של שיטות אבחון נפוצות עבור S. stercoralis2. בשנים האחרונות, מחקרים אפידמיולוגיים המבוססים על כלי אבחון משופרים העריכו כי השכיחות האמיתית של זיהומי S. stercoralis גבוהה בהרבה ממה שדווח בעבר, כ -610 מיליון אנשים ברחבי העולם2.
גם ל-S. stercoralis וגם למינים אחרים של סטרונגילואידים, כולל טפיל החולדה הקשור באופן הדוק ולמודל המעבדה הנפוץ S. ratti, יש מחזור חיים יוצא דופן שיש לו יתרון למחקרים גנומיים ניסיוניים מכיוון שהוא מורכב מדורות טפיליים וחופשיים (סביבתיים)3 (איור 1). באופן ספציפי, גם S. stercoralis וגם S. ratti יכולים לעבור דרך דור אחד של חיים חופשיים. הדור החי החופשי מורכב מזחלים פוסט-טפיליים המתפתחים לזכרים ונקבות בוגרים בעלי חיים חופשיים; כל צאצאיהם של הבוגרים החיים בחופשיות מתפתחים לזחלים מדביקים, אשר חייבים להדביק פונדקאי כדי להמשיך את מחזור החיים. יתר על כן, ניתן לתמרן באופן ניסיוני את הדור הסביבתי או החופשי הזה במעבדה. מאחר שמבוגרים בעלי חיים חופשיים של סטרונגילואידים ובוגרים של C. elegans חולקים מורפולוגיה דומה, ניתן להתאים טכניקות כגון מיקרו-אינטגונדציה תוך-גונדלית שפותחו במקור עבור C. elegans לשימוש עם סטרונגילואידים בוגרים חיים חופשיים 4,5. בעוד שדנ"א מוחדר בדרך כלל לנקבות בוגרות בעלות חיים חופשיים, גם זכרים וגם נקבות של סטרונגילואידים יכולים להיות מיקרו-איניג'קט6. לפיכך, כלים גנומיים פונקציונליים זמינים כדי לחקור היבטים רבים של הביולוגיה של סטרונגילואידים. נמטודות טפיליות אחרות חסרות דור חופשי, וכתוצאה מכך, הן אינן מקובלות באותה מידה על טכניקות גנומיות פונקציונליות3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63023/63023fig01.jpg"> איור 1: מחזור החיים של סטרקורליס סטרונגילואידים. הנקבות הטפיליות של S. stercoralis מאכלסות את המעי הדק של מארחי היונקים שלהן (בני אדם, פרימטים שאינם בני אדם, כלבים). הנקבות הטפיליות מתרבות על ידי פרתנוגנזה ומטילות ביצים בתוך המעי הדק. הביצים בוקעות בעודן בתוך הפונדקאי לתוך זחלים פוסט-טפיליים, אשר מועברים לסביבה עם צואה. אם הזחלים הפוסט-טפיליים הם זכרים, הם מתפתחים לזכרים בוגרים שחיים בחופשיות. אם הזחלים הפוסט-טפיליים הם נקבות, הם יכולים להתפתח לנקבות בוגרות בעלות חיים חופשיים (התפתחות עקיפה) או לזחלים זיהומיים בשלב השלישי (iL3s; התפתחות ישירה). הזכרים והנקבות החיים בחופשיות מתרבים מינית כדי ליצור צאצאים המוגבלים להפוך ל-iL3s. בתנאים מסוימים, S. stercoralis יכול גם לעבור הדבקה אוטומטית, שבה חלק מהזחלים הפוסט-טפיליים נשארים בתוך המעי המארח במקום לעבור לסביבה בצואה. זחלים אלה יכולים להתפתח לזחלים אוטו-אינפקטיביים (L3a) בתוך הפונדקאי, לחדור דרך דופן המעי, לנדוד דרך הגוף, ובסופו של דבר לחזור למעי כדי להפוך למבוגרים רבייתיים. מחזור החיים של S. ratti דומה, למעט העובדה ש- S. ratti מדביק חולדות ואין לו מחזור אוטו-אינפקטיבי. הדור הסביבתי הוא המפתח לשימוש במיני סטרונגילואידים למחקרים גנטיים. הנקבות הבוגרות החיות באופן חופשי (P0) יכולות להיות מיקרו-איניג'קט; צאצאיהם, שכולם יהפכו ל-iL3s, הם המהונדסים הפוטנציאליים של F1. נתון זה שונה מקסטלטו ואחרים. 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63023/63023fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
S. stercoralis חולק היבטים רבים של הביולוגיה שלו עם נמטודות אנושיות-טפיליות אחרות במערכת העיכול, כולל פלישת המארחים ומודולציה של מערכת החיסון המארח. לדוגמה, תולעי קרס אנושיות-טפיליות בסוג Necator ו - Ancylostoma גם נדבקות על ידי חדירת העור, מנווטות באופן דומה בגוף, ובסופו של דבר שוכנות כבוגרים טפיליים במעי הדק7. לפיכך, נמטודות רבות במערכת העיכול ככל הנראה משתמשות בהתנהגויות חושיות נפוצות ובטכניקות התחמקות חיסוניות. כתוצאה מכך, הידע שנאסף מ-Strongyloides ישלים את הממצאים בנמטודות אחרות, שפחות ניתנות לטיפול גנטי, ויוביל להבנה מלאה יותר של הטפילים המורכבים והחשובים האלה.
פרוטוקול מיקרו-איניג'קציה זה מתווה את השיטה להחדרת דנ"א לנקבות בוגרות בעלות חיים חופשיים של סטרונגילואידים כדי ליצור צאצאים מהונדסים ומוטנטיים. מתוארות דרישות תחזוקת המתח, כולל התזמון ההתפתחותי של תולעים בוגרות למיקרו-אינטגרציות ואיסוף צאצאים מהונדסים. פרוטוקולים והדגמה של טכניקת המיקרו-איניג'קציה המלאה, יחד עם פרוטוקולים לגידול וסינון צאצאים מהונדסים, כלולים, יחד עם רשימה של כל הציוד הדרוש וחומרים מתכלים.

<table><tbody><tr><td>(&מינוס;)-ניקוטין, &ge; 99% (GC), ניקוטין נוזלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876-5ML</td><td>לתולעים משתקות</td></tr> 3 <tr><td>אינץ' ברזל C-clamp, 3 אינץ' x 2 אינץ' (קיבולת x עומק)</td> <td>VWR</td><td>470121-790</td><td>C-clamp לאבטחת התקנה לספסל</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Phenix</td><td>RBA-500</td><td>agarose למגלשות</td></tr><tr><td>פחם עצם, דלי 4 פאונד, 10 x 28 רשת</td><td>Ebonex</td><td>n/a</td><td>פחם לתרביות</td></tr> <tr><td>צואה-פחםפחם עצם, גרגירים, 10 x 28 רשת</td><td>Reade</td><td>bonechar10x28</td><td>פחם לתרביות צואה (חלופה לאמור לעיל)</td></tr> <tr><td>מיקרומניפולטור גס</td><td>Narishige</td><td>MMN-1</td><td>מיקרומניפולטור גס</td></tr><tr><td>קורנינג קוסטאר Spin-X מסנני צינור צנטריפוגה</td><td>פישר</td><td>07-200-385</td><td>עמוד מיקרופילטר</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית, 48 x 60 מ"מ, עובי מס' 1</td><td>מעבדה לחקר המוח</td><td>4860-1</td><td>כיסויים (48 x 60 מ"מ)</td></tr><tr><td>צלחות פטרי עמוקות, גרסה כבדה עם 6 פתחי אוורור, קוטר 100 מ"מ</td><td>VWR</td><td>82050-918</td><td>10 ס"מ צלחות פטרי (לתרביות צואה-פחם)</td></tr><tr><td>בסיס רטרט Eisco עם מוט</td><td>פישר</td><td>12-000-101</td><td>מעמד למנגנון ברמן</td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet מיקרו-מזרק מיקרו-טיפים</td><td>VWR</td><td>89009-310</td><td>למילוי מחטי מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>פישרברנד רפידות תחתונות סופגות</td><td>פישר</td><td>14-206-62</td><td>נייר ספסל (להכנה)</td></tr><tr><td>טבעות ברזל יצוק</td><td>פישר</td><td>14-050CQ</td><td>טבעת O של ברמן</td></tr><tr><td>כוסות פוליפרופילן תלת-פינות</td><td>פישר פישר</td><td>14-955-111F</td><td>פלסטיק (לערבוב)</td></tr><tr><td>כוסות פוליפרופילן תלת-פינות</td><td>פישר</td><td>14-955-111F</td><td>פלסטיק (לדלי תפיסה/דלי מים)</td></tr><tr><td>כוסות פוליפרופילן תלת-פינות פישר</td><td>פישר</td><td>14-955-111F</td><td>פלסטיק (x2) (לייצור מחזיק)</td></tr><tr><td>אפוקסי גורילה במזרק</td><td>דבק מקמאסטר-קאר</td><td>7541A51</td><td>(לחיבור צינורות)</td></tr> <tr><td>שמן הלופחמן 700</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H8898-50ML</td><td>שמן הלופחמן</td></tr> צינורות <tr><td>גומי סיליקון בטמפרטורה גבוהה למזון ומשקאות, 1/2 אינץ' ID, 5/8 אינץ' OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>צינורות 3038K24</td><td>(למשפך)</td></tr> <tr><td>משפכי KIMAX, גזע ארוך, 60&deg; זווית, קימבל צ'ייס</td><td>VWR</td><td>89001-414</td><td>משפך ברמן</td></tr><tr><td>קימברלי-קלארק מקצועי Kimtech Science מגיני ספסל</td><td>פישר</td><td>15-235-101</td><td>נייר ספסל (להכנה)</td></tr> <tr><td>סטריאומיקרוסקופ Leica עם פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>GFP סטריאומיקרוסקופ לזיהוי ומיון תולעים טרנסגניות</td></tr><tr><td>microINJECTOR פליז מחזיק מחט זרוע ישרה</td><td>Tritech</td><td>מערכת</td> מיקרו-מזרק מחזיק <td>מחט מיקרו-הזרקה</td>MINJ-4</tr><tr>מערכת מיקרו-הזרקה<td></td><td>Tritech</td><td>MINJ-1</td><td>מערכת מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>גרבילים מונגוליים מעבדות</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>213-גרבילים מונגוליים</td><td>לתחזוקה של S. stercoralis, זכר 4-6 שבועות</td></tr><tr><td>Nasco Whirl-Pak שקיות קלות לסגירה, 18 אונקיות</td><td>VWR</td><td>11216-776</td><td>שקיות מדגם Whirl-Pak</td></tr><tr><td>טול ניילון (רשת)</td><td>בדי ג'ו-אן</td><td>zprd_14061949a</td><td>רשת ניילון למחזיק ברמן</td></tr><tr><td>חוט פלטינה, 36 מד, לאינץ'</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>1233S72</td><td>חוט פלטינה/אירידיום לפיק תולעים</td></tr><tr><td>מדכאי לשון פוריטניים, 152 מ"מ (L) x 17.5 מ"מ (W)</td> מקלות עץ <td>VWR</td><td>62505-007</td><td>(לערבוב דגימות)</td></tr> <tr><td>ערכת QIAprep Spin Miniprep (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>QIAGEN miniprep kit</td></tr><tr><td>חולדות-לונג אוונס</td><td>Envigo</td><td>140 HsdBlu:LE Long</td><td>Evans חולדות לתחזוקה של S. ratti, נקבה 4-6 שבועות</td></tr><tr><td>Rats-Sprague Dawley</td><td>Envigo</td><td>002 Hsd:Sprague Dawley SD</td><td>חולדות לתחזוקה של S. ratti, נקבה 4-6 שבועות</td></tr><tr><td>קופסאות שימושיות באמת קופסאות אחסון שקופות עם מכסים, קיבולת 1.6 ליטר, 7-5/8 אינץ' x 5-5/16 אינץ' x 4-5/16 אינץ'</td> <td>קופסאות פלסטיק למחסן</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>משרדי 452369 תא לחShepherd techboard, 8 x 16.5 אינץ'</td><td>Newco</td><td></td><td>999589 techboard</td></tr><tr><td>רצפת תיל מוגבהת מנירוסטה</td><td>Ancare</td><td>R20SSRWF</td><td>תחתיות כלוב תיל</td></tr><tr><td>StalkMarket כפות סכו"ם הניתנות לקומפוסטציה, 6 אינץ', לבן, חבילה של 1,000</td><td>כפות</td><td>9587303 אופיס דיפו</td><td></td></tr><tr><td>צלחת סטנדר, סוג ערימה, 37 x 25 מ"מ</td><td>קרולינה (מדע)</td><td>741012</td><td>משקפי שעון (קטנים, עגולים)</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>מוטיק</td><td>K-400 LED</td><td>ניתוח היקף הכנה</td></tr><tr><td>תיק אחסון, צבע שקוף/לבן, גובה חיצוני 4-7/8 אינץ', אורך חיצוני 13-5/8 אינץ', סטריליט</td><td>גריינג'ר</td><td>53GN16</td><td>קופסאות פלסטיק לתא לח</td></tr><tr><td>Sutter P-30 חולץ מיקרופיפטה</td><td>Sutter</td><td>P-30 / P</td><td>חולץ מחט עם נימה פלטינה/אירידיום</td></tr><tr><td>משקפי שעון סירקיוז</td><td>פישר</td><td>S34826</td><td>משקפי שעון (גדולים, עגולים)</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Castaloy מהדקי זווית קבועה</td><td>פישר</td><td>05-769-2Q</td><td>מהדקי משפך (2x)</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור שמן ג'ויסטיק תלוי תלת צירי</td><td>Narishige</td><td>MM0-4</td><td>מיקרומניפולטור עדין</td></tr><tr><td>מהדקי פינצ'קוק מאוחדים מוהר</td><td>פישר</td><td>S99422</td><td>מהדקי צביטה (2x)</td></tr><tr><td>צלחות פטרי מאווררות וחדות (קוטר 60 מ"מ)</td><td>טריטק מחקר</td><td>T3308P</td><td>6 ס"מ צלחות פטרי (לתרביות צואה-פחם בקנה מידה קטן)</td></tr><tr><td>מגבי טישו קלים VWR</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td>בטנה לזכוכית שעון מחזיק ברמן</td></tr><tr><td>, מרובע, 1-5/8</td><td>בקרוליינה (מדע)</td><td>742300</td><td>משקפי שעון (קטן, מרובע)</td></tr><tr><td>עיגולים רגילים איכותיים של Whatman, כיתה 1, קוטר 5.5 ס"מ</td> נייר סינון <td>פישר</td><td>09-805B</td><td>(עבור 6 ס"מ פטרי כלים)</td></tr><tr><td>עיגולים רגילים בדרגה איכותית של Whatman, כיתה 1, קוטר 9 ס"מ</td> נייר סינון <td>פישר</td><td>09-805D</td><td>(לכלי פטרי 10 ס"מ)</td></tr><tr><td>מכשיר דיוק עולמי נימי זכוכית בורוסיליקט, 1.2 מ"מ x 4</td><td>בפישר</td><td>50-821-813</td><td>נימי זכוכית למחטי מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>סכיני X-Acto, סכין מס' 1 עם מס' 11 להב</td><td>אופיס דיפו</td><td>238816</td><td>סכיני X-Acto ללא להבים להחזקת קיסמי תולעים</td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver A1</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>מיקרוסקופ הפוך</td></tr></tbody></table>

יצירת חומרים מהונדסים ונוקאאוטים במינים סטרונגילואידים על ידי מיקרו-אינטגרציה

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

הסוג סטרונגילואידים מורכב ממספר מינים של נמטודות חודרות עור עם טווחי פונדקאים שונים, כולל סטרונגילואידים סטרקורליס ו-סטרונגילואידים ראטי. S. stercoralis הוא נמטודה אנושית-טפילית וחודרת עור המדביקה כ-610 מיליון בני אדם, בעוד שטפיל החולדה S. ratti קשור קשר הדוק ל-S. stercoralis ומשמש לעתים קרובות כמודל מעבדה עבור S. stercoralis. גם S. stercoralis וגם S. ratti ניתנים להתאמה בקלות ליצירת טרנסגניות ונוקאאוטים באמצעות טכניקת העברת חומצות גרעין אקסוגניות של מיקרו-איניג'קציה תוך-גונדלית, וככאלה, הופיעו כמערכות מודל להלמינתנים טפיליים אחרים שעדיין אינם מקובלים על טכניקה זו.
בוגרים טפיליים של סטרונגילואידים מאכלסים את המעי הדק של הפונדקאי שלהם ומשחררים צאצאים לסביבה דרך הצואה. ברגע שהם נמצאים בסביבה, הזחלים מתפתחים לבוגרים חופשיים, שחיים בצואה ומייצרים צאצאים שחייבים למצוא פונדקאי חדש ולטלוש אליו. דור סביבתי זה הוא ייחודי למין סטרונגילואידים ודומה מספיק במורפולוגיה למודל של נמטודה חופשית Caenorhabditis elegans שניתן להתאים טכניקות שפותחו עבור C. elegans לשימוש עם נמטודות טפיליות אלה, כולל מיקרו-אינטגונדציה תוך-גונדלית. באמצעות מיקרו-איניג'ינג תוך-גונדלי, ניתן להכניס מגוון רחב של טרנסג'נדרים ל-Strongyloides. רכיבי CRISPR/Cas9 יכולים גם להיות מיקרו-איניג'קטים כדי ליצור זחלי סטרונגילואידים מוטנטיים. כאן מתוארת הטכניקה של מיקרו-איניג'קציה תוך-גונדלית לתוך סטרונגילואידים, כולל הכנת מבוגרים החיים בחופשיות, הליך ההזרקה ובחירת הצאצאים המהונדסים. תמונות של זחלי סטרונגילואידים מהונדסים שנוצרו באמצעות מוטגנזה של CRISPR/Cas9 כלולות. מטרת מאמר זה היא לאפשר לחוקרים אחרים להשתמש במיקרו-איניג'קציה כדי ליצור סטרונגילואידים מהונדסים ומוטנטיים.

אם הניסוי היה מוצלח, הזחלים F1 יבטאו את הפנוטיפ הטרנסגני ו/או המוטנטי המעניין (איור 4). עם זאת, שיעורי הטרנספורמציה משתנים מאוד ותלויים במבנים, בבריאות התולעים, בתנאי התרבות שלאחר ההזרקה ובמיומנות של הנסיין. באופן כללי, ניסוי מוצלח יניב זחלים &gt;15 F 1 לכל נקבה מוזרקת ושיעור טרנספורמציה של &gt;3% עבור סמנים פלואורסצנטיים. אם המספר הכולל של צאצאים חיים מגיע בממוצע לפחות מ-10 זחלים/נקבות, ייתכן שהמבנה רעיל, והזחלים שהשתנו לא שורדים. מציאת מספר גדול של ביצים פלואורסצנטיות...

ערכת הכלים הגנומית הפונקציונלית עבור הנמטודות הטפיליות סטרונגילואידים סטרקורליס וסטריונגילודים ראטי כוללת טרנסגנזה, מוטגנזה בתיווך CRISPR/Cas9 ו-RNAi. פרוטוקול זה ידגים כיצד להשתמש במיקרו-איניג'קציה תוך-גונדלית כדי להכניס טרנסג'נים ורכיבי קריספר לתוך S. stercoralis ו - S. ratti.

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and ...

שימוש במיקרו-איניג'קציה כדי להעביר מבני דנ"א לתוך סטרונגילואידים מאפשר לנו ליצור נוקאאוטים ומהונדסים, שניתן להשתמש בהם כדי לחקור כיצד התולעים האלה מתפתחות, לנווט בסביבתן ולהטפיל פונדקאים. עד כה, זוהי הטכניקה המוצלחת היחידה ליצירת נוקאאוטים ומהונדסים בטפילים אלה. יום אחד לפני המיקרו-איניג'קציה, מוסיפים 180 מיקרוליטרים של תמיסת האגרוז על החלקת כיסוי באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית, ואז מיד מפילים החלקת כיסוי שנייה למעלה כדי לשטח את האגרוז לתוך כרית דקה.לאחר 5 עד 10 שניות, הסירו את החלקת הכיסוי העליונה על ידי החלקת השניים זה מזה וקבעו באיזו שקופית נמצאת כרית האגר, והניחו אותה עם הפנים כלפי מעלה. לאחר מכן, בחר חתיכת זכוכית זעירה מתוך החלקת כיסוי שבורה, ובאמצעות מלקחיים, לחץ אותה בעדינות לתוך האגר ליד הקצה העליון של הפד. ביום המיקרו-זירה, תרפדו את מחזיק ה-Baermann, שהוא מסננת העשויה משתי טבעות פלסטיק עם שתי שכבות של רשת ניילון צמודה ביניהן עם שלוש פיסות חופפות של רקמת מעבדה.לאחר מכן מוסיפים את תערובת הצואה-פחם למחזיק בארמן. לאחר מכן מניחים את מחזיק ה-Baermann עם תערובת הצואה-פחם במשפך, מקפלים את פיסות הרקמות סביב תערובת הצואה-פחם, ומוסיפים מספיק מים כדי להטביע את רוב פחם הצואה. לאחר מכן, הוסיפו את המשפך למכסה צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 15 ס"מ כדי להכיל את הריח ולתייג את המשפך לפי הצורך.לאחר שעה עד שעתיים, החזיקו צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר מתחת לצינורות הגומי בתחתית המשפך ופתחו בזהירות את המהדקים בתחתית כדי לחלק 30 עד 40 מיליליטר מים המכילים תולעים לתוך צינור 50 מיליליטר. ולאחר מכן. להעביר 15 מיליליטר של מי בארמן המכילים את התולעים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. סובבו את הצינור, הסירו עד 13 מיליליטרים של ה-supernatant, והשליכו אותו למיכל פסולת נוזלית עם יוד כדי להרוג תולעים.לאחר איסוף כל התולעים, בדוק את כדור התולעים בתחתית הצינור. אם אין תולעים גלויות, המתן שעה עד שעתיים ואז אסוף תולעים נוספות ממנגנון בארמן. מעבירים את התולעים במים מעטים ככל האפשר לצלחת בינונית של 2% צמיחת נמטודה של שישה סנטימטרים עם מדשאה של E.coli HB101 ומשתמשים בצלחת זו כצלחת המקור למיקרו-אינטגיה.מתחת למיקרוסקופ הניתוח, כסו את שברי הזכוכית על כיסוי כרית המיקרו-זירה החלקה בשמן הלוקרבון באמצעות פיק תולעי פלטינה סטנדרטי. לאחר מכן, הניחו את החלקת כיסוי כרית המיקרו-איניג'קציה על היקף המיקרו-איניג'קציה ואתרו את שברי הזכוכית המכוסים בשמן. יישמו את רסיס הזכוכית כך שקצה יהיה מאונך לכיוון המחט כדי לשמש כמשטח המשמש לשבירת המחט.לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ ניתוח, ודא כי המחט אין בועות או פסולת בפיר מחודד, ולאחר מכן לאבטח את המחט 1 עד 1.5 ס"מ לתוך מחזיק בלחץ. מקם את קצה המחט במרכז שדה הראייה של המיקרוסקופ לפי העין ותחת הגדלה נמוכה, מקם את קצה המחט בשדה הראייה בניצב לצד רסיס הזכוכית. לאחר מכן, עברו להגדלה גבוהה יותר ויישרו את קצה המחט עם קצה הזכוכית, ליד, אך לא נגעו בה.לאחר מכן, כדי לשבור את קצה המחט ולאפשר זרימת נוזלים, הקש בעדינות על המחט בצד פיסת הזכוכית תוך הפעלת לחץ רציף מהגז. ברגע שהנוזל מתחיל לזרום, בדקו את צורת הקצה וודאו שהוא חד עם נוזל זורם בקלות. כאשר הנוזל זורם היטב מהמחט, הזיזו את שקופית המיקרו-אינטגיה להיקף הניתוח והוסיפו אחד לשני מיקרוליטרים של שמן הלוקרבון על כרית האגר למיקום התולעים.העבר 20 עד 30 סטרונגילואידים בוגרים צעירים לצלחת בינונית של צמיחת נמטודה של 2% ללא חיידקים למשך חמש דקות לפחות כדי להסיר עודפי חיידקים על פני השטח ולבחור תולעים בודדות למיקרו-איניג'קציה. מוסיפים עוד תולעים לצלחת לפי הצורך בזמן ההזרקה. בעזרת כמות קטנה של שמן הלוקרבון על קטיף תולעים, בחרו מהצלחת נקבה בוגרת צעירה עם ביצה אחת עד ארבע ביצים בגונד שלה ללא חיידקים והעבירו את התולעת לטיפה זעירה של שמן על כרית האגר.באמצעות בחירת התולעת, מקם בעדינות את התולעת כך שהיא לא תהיה מפותלת והגונדה תהיה גלויה וקלה לגישה. לאחר מכן, מקם את התולעת בשדה הראייה של מיקרו-איניג'קציה, וודא שהגונאד נמצא באותו צד של המחט וממוקם כך שהמחט תיצור קשר עם הגונד בזווית קלה. לאחר מכן, הביאו את קצה המחט לצד התולעת באותו מישור מוקד.לאחר מכן, כשהוא מכוון לזרוע הגונד הסמוכה לאמצע התולעת, מכניסים בעדינות את המחט לתוך הגונד באמצעות מיקרו-אינדקטור. מיד להפעיל לחץ על המחט כדי למלא בעדינות את כל זרוע gonad עם תמיסת DNA. לאחר הזרקת מספיק נוזלים, יש להסיר את המחט ולראות כי הפצע נסגר.חזור על ההליך עם הזרוע השנייה של הגונד, אם הוא גלוי. לאחר השלמת ההזרקה, ודא במהירות כי המחט אינה סתומה על ידי הפעלת לחץ עם קצה המחט על כרית האגר, ולאחר מכן העבר את המגלשה עם התולעת המוזרקת למיקרוסקופ הניתוח. כדי לשחזר את התולעת המוזרקת, הניחו תחילה כמה טיפות של מלוחים מואצים בתולעת על התולעת כדי להציף אותה מעל כרית האגר.לאחר מכן אספו כמות קטנה של חיידקים על קטיף תולעים ונגעו בתולעת עם החיידקים הדבקים כדי להסיר אותה מהנוזל. מעבירים בעדינות את התולעת לצלחת ההתאוששות. לניסויים התנהגותיים, העבר 20 עד 30 זחלים לצלחת בינונית של צמיחת נמטודה של 2% עם מדשאת חיידקים HB101 עבה, ותחת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, זהה את הזחלים המבטאים את הטרנסג'ין המעניין.לאחר מכן, באמצעות קטיף תולעים, בחרו את הזחלים המהונדסים והניחו אותם בכוס שעונים קטנה עם מלחים עם תילועים. לצורך מיקרוסקופיה, באמצעות סכין גילוח, הצמידו רשת לתחתית הפלסטיק של צלחת כימוטקסיס באורך 10 ס"מ כדי לעקוב בקלות אחר מיקומן של התולעים על הצלחת. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של זחלים במי מלח עם חיץ תולעת לריבוע ברשת, וממלאים כמה ריבועים לפי הצורך.לאחר מכן מוסיפים טיפות של 15 עד 20 מיקרוליטר של 1% ניקוטין במים לטיפות התולעת. לאחר ארבע דקות, כאשר התולעים משותקות, יש לסנן אותן באמצעות מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי. זחלי סטרקולריס סטרקולריס סטרקולריס מהונדסים מהונדסים עם תבנית ביטוי לא שלמה ומלאה של מעשה-2 mRFPmars מוצגים כאן.הביטוי המטושטש בשריר דופן הגוף נפוץ יותר כאשר הטרנסגן אינו משולב בגנום. לעומת זאת, ביטוי עקבי בכל שריר דופן הגוף מצביע לעתים קרובות על כך שהטרנסגן השתלב בגנום. שלב המפתח הוא מיקום המחט באותו מישור של מיקוד כמו הגונד כדי להבטיח שהדנ"א מוזרק לגונד וישולב בביצים המתפתחות.התפתחותה של טכניקה זו אפשרה לחקור את תפקוד הגנים בנמטודות טפיליות, המספקת תובנות חדשות על מנגנונים של טפילות ואינטראקציות בין פונדקאי לטפילים.

generating-transgenics-knockouts-strongyloides-species

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

וידאו זה מדגים את הטכניקה של microinjection לתוך בלוטת המין של C. elegans כדי ליצור חיות טרנסגניות.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

תולעים טראנסגנטי משמשים בדרך...

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

אנו מדגימים כאן reprogramming epigenetic באמצעות העברה תא סומטי גרעיני (SCNT) יכול לשמש ככלי לייצור מודלים העכבר עם קולטן T מוגדרים מראש תא (TCR) ספציפיות. עכברים אלה transnuclear לבטא את TCR המתאימה מוקד אנדוגניים שלהם תחת שליטה של ​​האמרגן אנדוגני.

עכברים Transnuclear עם מוגדרים מראש תא קולטן T ספציפיות נגד Toxoplasma gondii לקבל ע&quot;י SCNT

ב אורגניזמים מודל, transgenesis יכול לתפעל פונקציות גן בעוד RNAi יכול מציאה תעתיקי mRNA ספציפי 1-2. פרוטוקול זה נועד להמחיש את טכניקות צורך להציג DNA מועבר ביציבות וחולפת RNA גדילי כפול לתוך נמטודות...

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס</em

זבוב הפירות הים תיכוני (Diptera: Tephritidae) הוא מזיק חקלאי עולמי. הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה שלו היא המפתח לשליטה באוכלוסיות הזבוב הים-תיכוני ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית. מיקרו-הזרקת עובר היא כלי בסיסי המאפשר הן טרנספורמציה של קו הנבט והן מחקרי גנטיקה הפוכה במין זה.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

Microinjection של ביציות העכבר משמש בדרך כלל עבור transgenesis קלאסי ( כלומר, שילוב אקראי של transgenes) ו CRISPR בתיווך גישור המיקוד. פרוטוקול זה סוקר את ההתפתחויות האחרונות microinjection, עם דגש מיוחד על בקרת איכות אסטרטגיות genotyping.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

היעילות של שיטת עריכת הגנום המשופרת באמצעות אספקת חומצות גרעין ביציות (I-GONAD) דומה למיקרו-הזרקה מסורתית, הדורשת איסוף זיגוטה מנקבות תורמות והעברה לנקבות פסאודו-בהריון. פרוטוקול זה מדגים את יעילותו על ידי החדרת מוטציות הנגרמות על ידי CRISPR/Cas9 ללוקוס ROSA26 בכרומוזום 6.

עריכה גנומית משופרת באמצעות חומצות גרעין ביציות מבוססת טכניקת אלקטרופורציה In Vivo ליצירת עכברי נוקאאוט

מאמר זה מדגים הנדסת גנום בתיווך CRISPR-Cas9 ב-Steinernema hermaphroditum, נמטודה אנטומופתוגנית (EPN: חרק-טפילי) ומודל גנטי מתפתח. הטכנולוגיה המתוארת שימושית ליצירת מוטנטים, ומאפשרת הבהרה של פונקציות גנים בביולוגיית הנמטודות הרלוונטיות לסימביוזה הדדית וטפילית.

מוטגנזה מבוססת CRISPR-Cas9 בנמטודה אנטומופתוגנית Steinernema hermaphroditum ושימור קווי מוטנטים

למד שיטת מיקרו-אינטגרציה תוך-ביצית ליצירת נוקאאוטים וחומרים מהונדסים בנמטודות Strongyloides stercoralis ו-S. ratti. טכניקה זו מאפשרת חקר פונקציית גנים ומנגנוני טפילות בפארזיטולוגיה.

יצירת חומרים מהונדסים ונוקאאוטים במינים סטרונגילואידים על ידי מיקרו-אינטגרציה

גלה סרטונים נוספים