Name: שיטת PCR טיפה דיגיטלית לכימות יעילות טרנסדוקציה AAV ב- מורין רשתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: למד כיצד לכמת יעילות טרנסדוקציה של AAV ברשתית עכברים באמצעות שיטת PCR טיפה דיגיטלית. פרוטוקול זה מספק כלי רגיש לכימות מוחלט של DNA מטרה בחקר תרפיית גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לאוזקאן קיילס, ג'וזפין יוטנר ופרופ' בוטנוד רוסקה, המכון לרפואת עיניים מולקולרית וקלינית באזל, פלטפורמת וירוסים מורכבים על עזרתם והתמיכה בייצור AAV. ברצוננו גם להודות לפרופ' ז'אן בנט, בית הספר לרפואה פרלמן, אוניברסיטת פנסילבניה על זן AAV8/BP2. עבודות בעלי חיים מבוצעות במתקן בעלי החיים של האוניברסיטה הטכנית גבזה. על כך אנו מודים ליילה דיקמטס ופרופ' אויגר חליס טזבאי על הסיוע הטכני והתמיכה בבעלי חיים. ברצוננו גם להודות לד"ר פאטמה אוזדמיר על הערותיה על כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי TUBITAK, מספרי מענק 118C226 ו 121N275, ומענק שילוב אוניברסיטת סאבאנסי.

כל הפרוטוקולים הניסיוניים התקבלו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת סבנסי והניסויים נערכו בהתאם להצהרת 'האגודה לחקר הראייה ורפואת העיניים' לשימוש בבעלי חיים במחקר
1. ייצור AAV בקנה מידה קטן12
<ol><li>תאי HEK293T תרבות באמצעות לוחות 15 ס"מ להשלים 10 מ"ל של DMEM / 10% FBS עד 70-80% השפעה.</li>
	<li>הכן את תערובת transfection עם 20 מיקרוגרם של פלסמיד עוזר (pHGT1-Adeno1), 7 מיקרוגרם של plasmid קפסיד ו 7 מיקרוגרם של AAV2-CBA-tdTomato-WPRE ו 136 μL של פתרון PEI (1 מ"ג / מ"ל) ב 5 מ"ל של DMEM.</li>
	<li>מוסיפים את תערובת טרנספקטיון מוכן 5 מ"ל לתוך צלחת תרבית התא המכיל 10 מ"ל של מדיה תרבית ודגרה את התאים transfected עבור 48-60 שעות ב 37 °C (50 °F).</li>
	<li>לאסוף את המדיה ב 48-60 h לאחר transfection ולעכל אותו עם DNase I בריכוז הסופי של 250 U / mL במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F).</li>
	<li>צנטריפוגה את המדיה המעוכלת ב 4000 x גרם, 4 °C במשך 30 דקות ולאחר מכן לסנן אותו עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר לתוך קרום תאית מחודשת רטובה מראש עבור 100 kDa.</li>
	<li>צנטריפוגה קרום תאית מחודשת ב 4000 x גרם, 4 °C (50 °F) במשך 30 דקות ולהשליך את המדיה.</li>
	<li>לשטוף צנטריפוגות קרום תאית מחודשת עם PBS המכיל 0.001% F-68 Pluronic שלוש פעמים ב 4000 x גרם,4 °C (55 °F) במשך 30 דקות. השלך את ה- PBS בכל שלב.</li>
	<li>לאסוף AAVs מרוכז מהחלק העליון של קרום תאית מחודשת aliquot לשימושים נוספים.</li>
	<li>תעכל 5 μL של AAV טרי עם DNase I (0.2U / μl) במשך 15 דקות ב 37 °C (77 °F) עבור titering. זה ואחריו 10 דקות ב 95 °C דגירה עבור הן בהשמדת DNase I והשפלה capsids ויראלי.</li>
	<li>הכן דילול טורי פי 10 מ- AAVs מעוכל באמצעות F-68 פלורוני 0.05%. השתמש בפריימרים AAV2-ITR ו- WPRE עבור טיטציה(טבלה 1). titers חושבו על ידי הכפלת תוצאות dd-PCR עם גורמי דילול. התוצאות הוסבו לעותק גנום/מ"ל (GC/mL). הערה: ריכוזי AAV לייצור AAV בקנה מידה קטן צפויים להיות סביב 1 x 1012 GC / mL. פרוטוקול זה אינו ישים עבור זני AAV שאינם משחררים ביעילות AAVs למדיה כמו AAV213.</li>
</ol>2. הזרקה תוך-ויאטרלית של AAV
<ol><li>
הכנת ציוד
	<ol>
<li>לפני שתתחיל, להכין 10 מיקרו-מזרק μL עם מחט קהה 36 G. יש לשטוף חמש פעמים עם 70% EtOH, חמש פעמים ב-ddH2O ולבסוף חמש פעמים עם PBS.</li>
		<li>טען את הכמות המתאימה של AAV לתוך המזרק עבור כל זריקה.</li>
		<li>הכן את המחט הכירורגית (תות, משי, 6/0), סרט הדבקה, מלקחיים ומספריים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הזרקה תוך-ויטמינית
	<ol>
<li>החל 1 טיפה של 0.5% טרופיקמיד ו 2.5% פנילפרין הידרוכלוריד (למשל, Mydfrin) המכיל טיפת עיניים לפני הרדמה כדי להרחיב את האישונים.</li>
		<li>עכברים מרדים עם איזופלוראן 5% (1 ליטר/דקה) ולהמשיך עם 1.5% איזופלוראן (1 ליטר / דקה) במהלך ההליך. תא איזופלוראן קטן משמש לאינדוקציה הראשונה.</li>
		<li>אמת את עומק ההרדמה על ידי אובדן רפלקס ההגנה, רפלקס הגמילה ותגובת צביטת הזנב.</li>
		<li>יש למרוח 0.3% טוברמיצין ו-0.1% תמיסה עיניים סטרילית דקסמתזון על כל עין לפני הליך ההזרקה. יישום של טיפת עיניים מונע יובש ומפעיל השפעות אנטי דלקתיות ואנטי בקטריאלית.</li>
		<li>השתמש וו כירורגי כדי לייצב את העפעף העליון. לסגת מעט לאחור כדי לחשוף את החלק הגבי של העין. הדביק את הקרס לספסל כדי להחזיק אותו בעמדה.</li>
		<li>הסר את הלחמית (פחות מ 1 מ"מ2) עם מספריים קשתית מעוקלת לחשוף את sclera של העין מתחת למיקרוסקופ לנתח. השתמש מזרק אינסולין טרי סטרילי (30 גרם) כדי לנקב את הסקלרה.</li>
		<li>הכנס את המחט של microsyringe דרך אותו ניקוב באמצעות מיקרו-מניפולטור. מניחים את קצה המחט מאחורי העדשה באמצע העיית.</li>
		<li>הזרק 1 μL של AAV2 / BP2 ו AAV2 / PHP. וקטורים S בעלי 1.63 x 1012 GC/mL ו 1.7 x 1012 GC / mL ריכוזים לאט לתוך הזגג של העין. בקרת עוצמת הזרקה נעשית באופן ידני. להשאיר את המחט במקום במשך 1 דקות לאט למשוך את המחט.</li>
		<li>שחררו את העפעף והחלו טיפול ג'ל אקטואלי אנטי דלקתי ואנטי בקטריאלי המכיל 0.3% טוברמיצין ו-0.1% דקסמתזון על העיית. לפקח ולהעריך את העכברים בימים הבאים על פי גיליון התוצאות במונחים של מראה (עיניים בהירות, מעיל מטופח, כיפוף), התנהגות (פעילות, השתקת, השחתה עצמית), ומשקל גוף בסולם של 0 עד 3. לכל תנאי יש ציון מ 0-3 וציון כולל של 3 ומעלה הוא קריטריון סיום.</li>
		<li>מניחים את החיות בכלוב לאחר ההחלמה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. פלואורסצנטיות והדמיה פונדוס
<ol><li>מסננים את העכבר ומרחיבים את האישון על ידי הצבת טיפות של 0.5% טרופיקמיד ו 2.5% פנילפרין הידרוכלוריד לכל עין.</li>
	<li>להרסים את החיה עם ההליך הנ"ל עם איזופלוראן. להעריך את עומק ההרדמה בזהירות על ידי צביטת כפות הרגליים.</li>
	<li>הנח את העכבר על שלב ההדמיה ואמת את ההסתגלות הנכונה על-ידי בדיקה דרך מצלמת fundus. יש למרוח ג'ל אקטואלי (0.2% קרבומר 980) על פני העיניים כדי להגן על העיניים מפני התייבשות בהרדמה ולהשתמש בו כג'ל צימוד להדמיה.</li>
	<li>לתפעל את שלב ההדמיה כדי יישר קו עם האף של המטרה. התאם את הבמה לפי הצורך כדי למרכז את עין העכבר. ברגע שהעין מרוכזת, להזיז לאט את המטרה עד שהוא יוצר קשר עם העין.</li>
	<li>בצע הדמיית פונדוס ופלואורסצנטיות בשתי העיניים כדי לעקוב אחר ביטוי tdTomato בשבוע אחד ושבועיים לאחר הזרקה תוך-ויטמינית (איור 3B)14. קח תמונות פונדוס ופלואורסצנטיות בהגדרות זהות להשוואה של ביטוי עיתונאי.</li>
</ol>4. בידוד רשתית
<ol><li>המתת חסד בעלי חיים לאחר דימות פונדוס ופלואורסצנטיות על ידי שאיפת CO2 לאיסוף רשתית בנקודת זמן של שבועיים.</li>
	<li>הסט את גלגל העין קדימה בעזרת מלקחיים מפצלים 13.5 ס"מ.</li>
	<li>הסר את העדשה יחד עם הזגוז הנותר על ידי הפעלת לחץ עדין עם המלקחיים.</li>
	<li>חותכים את החיבור של גלגל העין לעצב הראייה עם מלקחיים מעוקלים מדויקים ולסחוט בעדינות את הרשתית עם אותם מלקחיים מעוקלים.</li>
	<li>מעבירים רשתיות נותחו לצינור מיקרוצנטריפוגה.</li>
	<li>הצמד רשתית להקפיא על ידי הצבת הצינורות לתוך החנקן הנוזלי.</li>
</ol>5. בידוד דנ"א גנומי של רקמות
<ol><li>לבודד DNA גנומי עם ערכת DNA גנומי מבוסס עיכול Proteinase K ממוסחרת.</li>
	<li>תעכל רשתית ב-55 °C (55 °F), 200 x גרם למשך 30 דקות עם פרוטאינאז K, שכבר מסופק בערכה.</li>
	<li>בצע שלב הדגירה RNase, לשטוף צעדים עם חוצץ לשטוף I ו- II, ולבסוף צעד חמק על פי פרוטוקול היצרן.</li>
	<li>הוסף שלב ספין נוסף לאחר הכביסה האחרונה כדי להסיר אתנול שיורית.</li>
	<li>למדוד את הריכוז של DNA גנומי ולאחסן דגימות ב -20 °C (50 °F).</li>
</ol>6. ניתוח PCR דיגיטלי טיפה של דגימות רשתית עכבר לכימות של גנומים ויראליים
<ol><li>לדלל DNAs גנומי מן הרשתיות מוזרק 0.05% פתרון F-68 פלורוני כדי להגיע לריכוז הסופי של 1 ng/ μL עבור כל מדגם.</li>
	<li>בצע תגובות נפרדות עבור WPRE ו- 18S באמצעות פריימרים ספציפיים ליעד עם ריכוז סופי של 125 ננומטר עבור כל פריימר.</li>
	<li>בצע ייצור טיפות בתערובת תגובה של 20 מיקרו-ליטר של PCR כולל 1 ננומטר של דנ"א גנומי, פריימרים של 125 ננומטר וסופרמיקס 2x evagreen.</li>
	<li>טען את תערובת המדגם בחלק האמצעי של המחסנית ליצירת טיפות.</li>
	<li>לאחר טעינה לדוגמה מחסנית נעשה, להוסיף 70 μL של שמן הדור טיפה לשורה התחתונה של המחסנית.</li>
	<li>שים את האטם על גבי המחסנית והנח אותו לתוך מחולל טיפה. ודא כי אין פער בין האטם לבין המחסנית.</li>
	<li>יש ליטול בעדינות כ-40 מיקרו-אל של טיפות הנוצרות בבאר העליונה. הוסף את פתרון טיפת לצלחת התגובה חצי חטופה 96 טוב PCR.</li>
	<li>אטמו את צלחת ה-PCR עם איטום לוחית PCR באמצעות רדיד איטום אלומיניום.</li>
	<li>יש להניח את צלחת ה-PCR על אופנוע תרמי אטום בחום 96.. השתמש בפרוטוקול PCR; 95 °C (5 דקות), 40 מחזורים של 95 °C (5 °F) במשך 30 °C (60 °F) למשך 1 דקות, 4 °C (5 דקות), 90 °C (5 דקות) ו -4 °C אחיזה אינסופית. החל 2 °C /s קצב הרמפה בכל מחזור כדי להבטיח כי טיפות להגיע לטמפרטורה הנכונה עבור כל צעד במהלך רכיבה על אופניים</li>
	<li>מקם צלחת PCR בקורא טיפות כדי לכמת טיפות באמצעות תוכנת dd-PCR. תבנית מוגדרת באמצעות הגדרות ספציפיות עבור evagreen.</li>
	<li>נתח נתונים באמצעות גרף התוויה חד-ממדית עם כל דגימה לעוצמת פלואורסצנטיות לעומת מספר טיפה. ערך הסף מסודר כך שהלטיפות מעל הסף מוקצות כחיוביות ואת הערך שלהלן כשלילי. לאחר מכן היישום של אלגוריתם פואסון כדי לקבוע את הריכוז ההתחלתי של DNA היעד ביחידות של עותקים / μL. היחס בין WPRE לעומת 18S מחושב למדידת יעילות התמרה של AAV.</li>
</ol>

<ol><li>Herrmann, A. K., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+dissection+of+AAV-host+interactions%3A+The+fast+and+the+curious%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).</li>
<li>Pillay, S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+determinants+of+adeno-associated+viral+vector+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Host determinants of adeno-associated viral vector entry.</a> Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).</li>
<li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+AAV+tropism+in+the+nervous+system+with+natural+and+engineered+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).</li>
<li>Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+structure+and+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AAV capsid structure and cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).</li>
<li>Han, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+tropism+and+transduction+of+adeno-associated+virus+varies+by+serotype+and+route+of+delivery+%28intravitreal%2C+subretinal%2C+or+suprachoroidal%29+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats.</a> Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).</li>
<li>Muraine, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+efficiency+of+adeno-associated+virus+serotypes+after+local+injection+in+mouse+and+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).</li>
<li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+and+optogenetic+stimulation+of+retinal+bipolar+cells+by+a+synthetic+adeno-associated+virus+capsid+and+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).</li>
<li>Higashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+woodchuck+hepatitis+virus+post-transcriptional+regulatory+element+reduces+readthrough+transcription+from+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Albayrak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+quantification+of+proteins+and+mrna+in+single+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells.</a> Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Juttner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neuronal+and+glial+cell+types+with+synthetic+promoter+AAVs+in+mice%2C+non-human+primates+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Hif1a+rescues+cone+degeneration+and+prevents+subretinal+neovascularization+in+a+model+of+chronic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12(2018).</li>
<li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li>
<li>Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+tools+for+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source tools for biological image analysis.</a> Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).</li>
<li>Parks, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ribosomal+RNA+alleles+are+conserved+and+exhibit+tissue-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression.</a> Science Advances. 4 (2), (2018).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Maclachlan, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+safety+evaluation+of+AAV2-sFLT01-+a+gene+therapy+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration.</a> Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).</li>
<li>Stieger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intact+rAAV+particles+up+to+6+years+after+successful+gene+transfer+in+the+retina+of+dogs+and+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates.</a> Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+gene+editing+prevents+deafness+in+a+model+of+dominant+progressive+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss.</a> Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).</li>
<li>Cox, D. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA editing with CRISPR-Cas13.</a> Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בפרוטוקול זה, יצרנו שני וקטורים AAV שיש להם חלבונים קפדיים שונים ולאחר מכן titered אותם בהתאם. אחד הצעדים המכריעים ביותר של פרוטוקול זה הוא לייצר כמויות מספיקות של AAVs שיניב ביטוי עיתונאי לגילוי לאחר התמרה12,13. 
Titering של AAVs הוא גם גורם חשוב כדי להתאים את המינונים של AAV עבור זריקות תוך-ויטמיניות. ברגע שקריטריונים חשובים אלה מושגים, זה אפשרי לכמת את יעילות התמרה של AAVs על ידי מתודולוגיית dd-PCR.
מעב...

וירוסים הקשורים אדנו (AAVs) משמשים כיום עבור מגוון רחב של מחקרים ריפוי גנטי ברשתית. AAVs מספקים דרך בטוחה ויעילה של אספקת גנים עם פחות אימונוגניות ופחות שילובי גנום. כניסת AAV לתא היעד מתרחשת באמצעות אנדוציטוזיס, אשר דורש כריכה של קולטנים וקולטנים משותפים על פני השטח התא1,2. לכן, יעילות התמסורת של AAVs עבור סוגי תאים שונים תלויה בעיקר capsid ואת האינטראקציות שלה עם קולטני התא המארח. AAVs יש סרוטיפים וכל סרוטיפ יכול להיות טרופיזם תאי / רקמה ברור ויעילות transduction. ישנם גם סרוטיפים מלאכותיים של AAV ווריאנטים שנוצרו על ידי שינוי כימי של קפסיד הווירוס, ייצור של קפידים היברידיים, החדרת פפטיד, דשדוש קפסיד, אבולוציה מכוונת, mutagenesis רציונלי3. אפילו שינויים קלים ברצף חומצות אמינו או מבנה קפיד יכול להשפיע על אינטראקציות עם גורמי תא מארח וכתוצאה מכך tropisms שונים4. בנוסף וריאנטים capsid, גורמים אחרים כמו מסלול הזרקה וריאציה אצווה לאצווה של ייצור AAV יכול להשפיע על יעילות transduction של AAVs הרשתית העצבית. לכן, שיטות אמינות להשוואת שיעורי התמסורת עבור וריאנטים שונים נחוצים.
רוב השיטות לקביעת יעילות התמרה של AAV מסתמכות על ביטוי גנים עיתונאיים. אלה כוללים הדמיה פלואורסצנטית, אימונוהיסטוכימיה, כתם מערבי, או ניתוח היסטוכימי של מוצר הגן הכתב5,6,7. עם זאת, בשל אילוץ הגודל של AAVs, זה לא תמיד אפשרי לכלול גנים עיתונאי לפקח על יעילות transduction. באמצעות מקדמים חזקים כמו משפר CMV היברידי / עוף בטא-אטין או וודצ'אק הפטיטיס לאחר אלמנט רגולטורי לאחר שעתוק (WPRE) כרצף מייצב mRNA מסבך עוד יותר את בעיית הגודל8. לכן, זה יהיה גם מועיל להגדיר את שיעור התמולה של AAVs מוזרק עם מתודולוגיה ישירה יותר.
טיפה דיגיטלית PCR (dd-PCR) היא טכניקה רבת עוצמה כדי לכמת DNA היעד מכמויות דקות של דגימות. טכנולוגיית dd-PCR תלויה אנקפסולציה של DNA היעד ותערובת תגובת PCR על ידי טיפות שמן. כל תגובת dd-PCR מכילה אלפי טיפות. כל טיפה מעובדת ומנותחת כתגובת PCR עצמאית9. ניתוח של טיפות מאפשר לחשב את מספר העותק המוחלט של מולקולות DNA היעד בכל דגימה פשוט באמצעות אלגוריתם פואסון. מכיוון שיעילות התמרה של ה- AAVs מתואמת עם מספר העותק של הגנום AAV ברשתית העצבית, השתמשנו בשיטת dd-PCR כדי לכמת גנומים AAV.
כאן, אנו מתארים מתודולוגיה dd-PCR כדי לחשב את יעילות התמרה של וקטורים AAV מ- DNA גנומי רשתית6,10. ראשית, AAVs המבטאים כתב tdTomato נוצרו באמצעות פרוטוקול בקנה מידה קטן, titered על ידי שיטת dd-PCR11. שנית, AAVs הוזרקו תוך-ויטארי לרשתית העצבית. כדי להדגים את יעילות התמרה, כימתנו תחילה את ביטוי tdTomato באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ותוכנת ImageJ. לאחר מכן בידוד ה- DNA הגנומי לכימות גנומים AAV ברשתיות מוזרקות באמצעות dd-PCR. השוואה של רמות הביטוי tdTomato עם הגנום AAV transduced כימות על ידי dd-PCR הראה כי שיטת dd-PCR כימתה במדויק את יעילות התמרה של וקטורים AAV. הפרוטוקולים שלנו הדגימו תיאור מפורט של מתודולוגיה מבוססת DD-PCR כדי לכמת את יעילות התמרה של AAV. בפרוטוקול זה, אנו מציגים גם את המספר המוחלט של גנומים AAV המועברים לאחר זריקות תוך-ויטמיניות פשוט על ידי שימוש בגורם הדילול לאחר בידוד DNA גנומי ותוצאות dd-PCR. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק שיטה רבת עוצמה, אשר תהיה חלופה לביטוי עיתונאי לכמת את יעילות התמולה של וקטורים AAV ברשתית.

<table><tbody><tr><td>96 בארות חצי חצאית ddPCR צלחות</td><td>BioRad</td><td>12001925</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>Amicon מסנן</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>AAV</td></tr><tr><td>C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS</td><td>BioRad</td><td>1851197</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>C57BL / 6JRj עכברים זן</td><td>Janvier</td><td>C57BL / 6JRj</td><td>עכברים</td></tr><tr><td>DG8 אטמים</td><td>BioRad</td><td>1863009</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>DG8 מחסניות</td><td>BioRad</td><td>1864008</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604Q</td><td>AAV</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN BIOTECH</td><td>L 1825</td><td>AAV</td></tr><tr><td>ייצור טיפות שמן eva green</td><td>BioRad</td><td>1864006</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>שמן קורא טיפות</td><td>BioRad</td><td>1863004</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN BIOTECH</td><td>p30-3306</td><td>AAV</td></tr><tr><td>אטמי רדיד עבור PX1 אוטם צלחות PCR</td><td>BioRad</td><td>1814040</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>מזרקי אינסולין</td><td>BD רפואי</td><td>320933</td><td>הזרקה תוך זגוגית</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET</td> N01AB06 <td></td><td>הרדמה</td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק MM33</td><td>World Precision Instruments</td><td>82-42-101-0000</td><td>הזרקה תוך זגוגית</td></tr><tr><td>מיקרון IV</td><td>מעבדות מחקר פניקס</td><td>מיקרון IV</td><td>מערכת מיקרוסקופיה המבוססת על מצלמה צבעונית 3-CCD, תופס מסגרת ותוכנת מדף מאפשרת לחוקרים לצלם רשתית עכבר.</td></tr><tr><td>Mydfrin (% 2.5 פנילפרין הידרוכלוריד)</td><td>Alcon</td><td>S01FB01</td><td>להרחבת אישונים</td></tr><tr><td>מזרק Nanofil 10 &mu; l</td><td>World Precision Instruments</td><td>מחט</td><td>הזרקה תוך זגוגית</td></tr><tr><td>RN G36, 25 מ"מ, PST 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF36BL-2</td><td>הזרקה תוך זגוגית</td></tr><tr><td>PEI-MAX</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>AAV</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>PAN BIOTECH</td><td>P06-07100</td><td>AAV</td></tr><tr><td>פלסמיד pHGT1-Adeno1</td><td>פלסמידמפעל</td><td>PF1236</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Pluronic F-68</td><td>Gibco</td><td>24040032</td><td>AAV</td></tr><tr><td>PX1 PCR מערכת אוטם צלחות</td><td>BioRad</td><td>1814000</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>BioRad</td><td>1864034</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>QX200 קורא טיפות/QX200 מחולל טיפות</td><td>BioRad</td><td>1864001</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>מפצל מלקחיים WATCHER MAKER - אורך = 13.5 ס"מ</td><td>אנדוסטול רפואי</td><td>EJN-160-0155</td><td>בידוד רשתית</td></tr><tr><td>מסנן מזרק סטרילי</td><td>AISIMO</td><td>ASF33PS22S</td><td>AAV</td></tr><tr><td>רקמות DNA גנומי ערכת</td><td>EcoSpin</td><td>E1070</td><td>gDNA</td></tr><tr><td>בידוד טוברדקס (0.3% טוברמיצין / 0.1% דקסמתזון)</td> <td>אלקון</td><td>S01CA01</td><td>אנטי דלקתי / אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>טרופיד (% 0.5 טרופיקמיד)</td><td>Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.</td><td>S01FA06</td><td>הרחבת אישונים</td></tr><tr><td>Turbonuclease</td><td>Accelagen</td><td>N0103L</td><td></td></tr><tr><td>AAV Viscotears (קרבומר 2 מ"ג/גרם)</td><td>Bausch+Lomb</td><td>S01XA20</td><td>טיפת עיניים</td></tr></tbody></table>

שיטת pcr טיפה דיגיטלית לכימות יעילות טרנסדוקציה aav ב- מורין רשתית

Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

מעבדות רבות לביולוגיה של תאי הרשתית משתמשות כיום באופן שגרתי בווירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) לעריכת גנים וליישומים רגולטוריים. היעילות של התמלת AAV היא בדרך כלל קריטית, אשר משפיע על התוצאות הניסיוניות הכוללות. אחד הגורמים העיקריים ליעילות התמרה הוא הסרוטיפ או הגרסה של וקטור AAV. נכון לעכשיו, סרוטיפים מלאכותיים שונים של AAV ווריאנטים זמינים עם זיקות שונות לארח קולטני פני תא. עבור טיפול גנטי ברשתית, התוצאה היא דרגות שונות של יעילות transduction עבור סוגי תאים רשתית שונים. בנוסף, מסלול ההזרקה ואיכות ייצור AAV עשויים להשפיע גם על יעילות התמסורת של רשתית AAV. לכן, חיוני להשוות את היעילות של גרסאות שונות, אצוות ומתודולוגיות שונות. שיטת ה-PCR (dd-PCR) של טיפה דיגיטלית כימתה את חומצות הגרעין בדיוק גבוה ומאפשרת ביצוע כימות מוחלט של יעד נתון ללא כל תקן או התייחסות. באמצעות dd-PCR, זה גם אפשרי להעריך את יעילות התמרה של AAVs על ידי כימות מוחלט של מספרי עותק הגנום AAV בתוך רשתית מוזרקת. כאן, אנו מספקים שיטה פשוטה כדי לכמת את קצב התמרה של AAVs בתאי רשתית באמצעות dd-PCR. עם שינויים קלים, מתודולוגיה זו יכולה גם להיות הבסיס לכימות מספר העותק של DNA מיטוכונדריאלי, כמו גם הערכת היעילות של עריכת בסיס, קריטי עבור מספר מחלות רשתית ויישומים לטיפול בגנים.

ייצור AAV בקנה מידה קטן הוא שיטה מהירה ויעילה המספקת וקטורים לזריקות תוך-ויטמיניות(איור 1). ייצור AAV בקנה מידה קטן בדרך כלל נותן טיטרים בטווח של 1 x 1012 GC / ml אשר מספיק כדי לזהות ביטוי כתב ברשתית (איור 2). טיטרינג של AAV באמצעות dd-PCR נותן תוצאות עקביות. פריימרים ספציפיים של ITR2 ו- WPRE נמצאים בשימוש שגרתי והריכוז ההתחלתי של כל מולקולת יעד חושב באמצעות תוכנת dd-PCR על ידי מידול כהפצת פואסון. החישובים הושלמו על ידי כפל של גורמי דילול והומרו לעותק...

פרוטוקול זה מציג כיצד לכמת את יעילות התמרה של AAV ברשתית העכבר באמצעות PCR טיפה דיגיטלית (dd-PCR) יחד עם ייצור AAV בקנה מידה קטן, הזרקה תוך-ויטמינית, הדמיית רשתית ובידוד DNA גנומי ברשתית.

שיטת PCR טיפה דיגיטלית לכימות יעילות טרנסדוקציה AAV ב- מורין רשתית

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

בסרטון זה נראה כיצד לכמת את התמרת AAV ב רשתית העכבר באמצעות שיטת PCR טיפה דיגיטלית, שהיא רגישה ביותר ועושה כימות מוחלט של ה- DNA היעד. פיתחנו שיטה זו בעיקר עבור מבנים AVV גדולים שאינו מאפשר לנו להשתמש בגן עיתונאי כמו מבנים מבוססי CRISPR. באמצעות שיטה זו, אנו יכולים פשוט לכמת את קצב התמרה של AAVs ב רשתית.שיטה זו מסתמכת על רגישות וכימות מוחלט של ה-PCR של טיפה דיגיטלית ומפיקה תוצאות ישירות קדימה. בסרטון זה נראה כיצד לכמת את התמרת AAV ב רשתית העכבר באמצעות שיטת PCR טיפה דיגיטלית, שהיא רגישה ביותר ועושה כימות מוחלט של ה- DNA היעד. פיתחנו שיטה זו בעיקר עבור מבנים גדולים באזור שאינו מאפשר לנו להשתמש בגן עיתונאי כמו מבנים מבוססי CRISPR.באמצעות שיטה זו, אנו יכולים פשוט לכמת את קצב התמרה של AAVs ב רשתית. שיטה זו מסתמכת על רגישות וכימות מוחלט של שתי ה-PCR טיפה והניבה תוצאות ישר קדימה. בגלל היעילות של מתודולוגיית ה-PCR של טיפה דיגיטלית, מספר מעבדות כבר עוברות מ-PCR כמותי בזמן אמת לטיטרינג טיפה דיגיטלי PCR או AAV.שיטה זו יכולה גם לספק בסיס לכימות DNA מיטוכונדריאלי ב רשתית, כמו גם לבדוק את היעילות של תיקון המוטציה מבוסס CRISPR לטיפול גנטי ב רשתית העכבר. הכן תערובת טרנספקטו עם פלסמיד עוזר AAV, פלסמיד קפסיד AAV, וקטור AAV, ופתרון PI בחמישה מיליליטרים ביקוש. מוסיפים את תערובת הטרנס-טריליטר שהוכנה לתקשורת התרבותית.תאים מהודבקים מדגירה ב-37 מעלות צלזיוס. לאסוף את המדיה ב 48 עד 60 שעות לאחר transfection. לעכל את התקשורת עם DNAs בריכוז סופי של 250 יחידות למיליליטר במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס וצנטריפוגה זה ב 4, 000 גרם ארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.הרטיבו מראש את קרום התאית המחודשת עם PBS. סנן את המדיה עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר לתוך קרום התאית המחודשת הרטובה מראש עבור 100 קילו דלטון. צנטריפוגה קרום תאית מחודשת ב 4, 000 G ארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולהשליך את התקשורת.לשטוף צנטריפוגות קרום תאית מחודשת עם PBS המכיל 0.001%F68 פלורוני שלוש פעמים ב 4000 G ארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאסוף AAVs מרוכז מהחלק העליון של קרום תאית מחודשת להקצות לשימוש נוסף. כאן הראינו כיצד ליצור ייצור AAV בקנה מידה קטן יותר.לאחר בדיקת פרוטוקול זה, אתה אמור להיות מסוגל לעשות AVVs כי הוא מספיק כדי לראות את הביטוי הכתב ברשתית. באפשרותך גם לעקוב אחר הפרוטוקול עבור PCR דיגיטלי כדי שתוכל ליצור AAVs של ייצור. החל טיפה אחת של 0.5%טרופיקמיד ו 2.5%פנילפרין הידרוכלוריד המכיל טיפת עיניים לפני הרדמה כדי להרחיב את האישונים.יש להכשיר עכברים עם איזופלוראן ולאמת את הרפלקסים. יש למרוח 0.3%טוברמיצין ו-0.1%dexamethasone סטרילי תמיסה עיניים טיפה לכל עין לפני הליך ההזרקה. השתמש וו כירורגי כדי לייצב את העפעף העליון.לסגת מעט לאחור כדי לחשוף את החלק הגבי של העין. תדביק את הקרס ללהקה כדי להחזיק בעמדה. הסר את הלחמית עם המספריים המעוקלים-קשתית כדי לחשוף את הסקלרה של העין.השתמש מזרק אינסולין 30G טרי וסטרילי כדי לנקב את הסקלרה. הכנס את המחט של מזרק מיקרו דרך אותו ניקור באמצעות מניפולטור מיקרו. מניחים את קצה המחט מאחורי העדשה באמצע העין.הזריקו מיקרו ליטר אחד של תמיסה AAV לאט לתוך הזע של העין. השאר את המחט במקום במשך דקה אחת לאט למשוך את המחט. יש למרוח טיפול ג'ל אקטואלי אנטי דלקתי ואנטי בקטריאלי המכיל 0.3% טוברמיצין ו-0.1%דקסמתזון על העיניים.החל ירידה אחת 0.5% טרופיקמיד. ו 2.5% פנילפרין הידרוכלוריד המכיל טיפת עיניים לפני הרדמה כדי להרחיב את האישונים. החל קרבמיד שני מיליגרם לג'ל אקטואלי גרם על פני השטח של העיניים.התאם את מעמד העכבר לפי הצורך כדי למרכז את עין העכבר. בצע דימות פונדוס ופלואורסצנטיות בשתי העיניים כדי לעקוב אחר ביטוי TdTomato שבוע ושבועיים לאחר הזרקה תוך-ויטריאלית. המתת חסד בעלי החיים באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני לפני ההליך.הסט את כדור העין קדימה בעזרת מלקחיים מפצלים 13.5 ס"מ. הסר את העדשה יחד עם הזגוג שנותר. חותכים את החיבור של גלגל העין לעצב הראייה עם מלקחיים מעוקלים מדויקים ולסחוט בעדינות רשתית עם אותם מלקחיים מעוקלים.לבודד DNA גנומי עם ערכת DNA גנומי רקמות ממוסחרת K לעכל סרט מבוסס סרט. לעכל רשתית ב 55 מעלות צלזיוס 200 גרם במשך 30 דקות עם רשתית K.Lyse פרוטאינאז לחלוטין ולעקוב אחר sprotocol של היצרן. בפרוטוקולים אלה, הראינו הדמיית פלורס הזרקה תוך-ויטמינית, כמו גם בידוד רשתית ודנ"א גנומי.אלה הם הליכים קריטיים מאוד עבור רשתית, ועל ידי ביצוע פרוטוקול זה, אתה אמור להיות מסוגל להזריק את AAVs המיוצר ולעקוב אחר פרופיל הביטוי שלהם. ומצקת את יעילות התמרה על ידי כימות הגנומים של AAV בדנ"א גנומי ברשתית. כאן, אתה יכול לראות את היישום הבסיסי של PCR טיפה דיגיטלית, שבו אתה יכול לעשות כימות מוחלט של גנום AAV כי transduce בתאי הרשתית.לדלל DNAs גנומי מן הרשתיות מוזרק 0.05%תמיסת F 68 פלורונית כדי להגיע לריכוז סופי של ננוגרם אחד לכל microliter עבור כל מדגם. בצעו את ייצור הטיפות בתערובת תגובת PCR של 20 מיקרוליטרים, כולל פריימרים גנומיים ננוגרם אחד 125 ננומולרים ותערובת סופר-על 2x יורגת עד. טען תערובת לדוגמה לחלק האמצעי של המחסנית ליצירת טיפות.לאחר מכן להוסיף 70 שמן ייצור טיפות מיקרוליטרים לשורה התחתונה של המחסנית. שים את האטם על גבי מחסנית. ודא כי אין פער בין האטם לבין המחסנית.ואז למקם אותו לתוך מחולל טיפות. יש ליטול בעדינות כ-40 מיקרוליטרים של טיפות הנוצרות בפעמון העליון. הוסף פתרון טיפה לצלחת התגובה PCR 96-Well חצי חצאית.אטמו את צלחת ה-PCR עם איטום לוחית PCR באמצעות רדיד איטום אלומיניום. מניחים את צלחת ה- PCR לתוך רוכב האופניים התרמי האטום בחום 96-Well. השתמש בפרוטוקול ddPCR המצוין במאמר.מקם את צלחת ה- PCR בקורא הטיפות כדי לנתח נתונים. לאחר צפייה בסרטון וידאו זה, אתה אמור להיות מסוגל לבצע טכניקת PCR דיגיטלית בסיסית. אתה יכול גם להשתמש בתאים מאומצים עם כמויות קטנות של חומר, שהוא אידיאלי עבור טכניקת PCR דיגיטלי.עם זאת, עליך להתאים בזהירות את כמות ה- DNA היעד כדי לא לחרוג מהמגבלה של PCR טיפה דיגיטלית. הנה תרשים הזרימה של ההליך הניסיוני. ביצענו הפקה בקנה מידה קטן AAV, אשר ואחריו Titering AAV.ואז ביצענו הזרקה תוך-ויטמינית. לאחר מכן, כימתנו את עוצמת הפלואורסצנטית על ידי הדמיית פלואורסצנטיות פונדוס. לאחר מכן בודד את רשתיות העכבר וחילץ DNA גנומי מהרשתיות עבור ddPCR.Titering AAV הוא גם קריטי כדי להיות מסוגל לכמת כראוי התמרת AAV. ddPCR תלוי ביצירת טיפות שיש לה גנום AAV יעד מדולל. תוצאות ddPCR מייצגות מציגות טיפות חיוביות ושליליות עבור הגנום AVV.חיובי מעל הסף ושלילי הוא להלן. לאחר הכפלה עם גורמי הדילול, titer של AAVs נמצאו להיות 10 עד 12 עותקים גנום למיליליטר. על מנת לכמת נכון את יעילות tranduction AAV, הוזרקו מספר רשתיות.בעלי חיים מוזרקים צולמו, ופלואורסצנטיות פירושה שעוצמה חושבה. בנקודת זמן של שבועיים, הרשתיות היו מבודדות. ו- ddPCR בוצע באמצעות WPRE ו- 18 פריימרים S.עוצמת הפלואורסצנטיות של רשתיות מוזרקות AAV היו בקורלציה עם חישובי הגנום AAV, מראה את כוחה של המתודולוגיה. כאן, הראינו מספר טכניקות, כולל הזרקת הכנה AAV בקנה מידה קטן.

digital-droplet-pcr-method-for-quantification-aav-transduction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כדי לחקור את חדירות מחסום הדם-רשתית ואת שלמות הממברנה המגבילה הפנימית במודלים של מחלות רשתית בבעלי חיים, השתמשנו במספר גרסאות של נגיף הקשור לאדנו-(AAV) ככלים לתיוג נוירונים ברשתית וגליה. ביטוי גן מדווח בתיווך וירוס משמש לאחר מכן כאינדיקטור לחדירות מחסום הרשתית.

שימוש בנגיף Adeno הקשורים ככלי לחקר חסמי רשתית במחלה

כתב יד זה פרטים של assay חשופה נקודה פשוטה עבור כימות של adeno-הקשורים וירוס (AAV) titers ויישומו ללמוד את התפקיד של הפעלת מכלול חלבונים (AAPs), שיעור הרומן של חלבונים נגיפיים שאינן מבניות נמצאו AAV כל אשר נגרמו מהזנים אליהם, בקידום ההרכבה של capsids נגזר cognate, heterologous AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם.

וזמינותו חשופה כמותיים נקודה עבור טיטור AAV והשימוש בה להערכה תפקודית של וירוס Adeno-הקשורים ההרכבה-הפעלת חלבונים

הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

כאן, אנו מציגים שיטה לחקירת מורפוגנזה נויריט ברשתית לאחר הלידה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לשגות זמן. אנו מתארים גישה לתיוג דליל ורכישה של סוגי תאי רשתית ותהליכים עדינים שלהם באמצעות וקטורים וירוס הקשורים אדנו רקומביננטי המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre.

הדמיה בזמן לשגות של arborization עצבי באמצעות תיוג וירוסים דליל אדנו הקשורים של אוכלוסיות תאי רשתית ממוקדים גנטית

תהליך עבודה מקיף של פרוטוקול מעבדה וניתוח מתוארים לבדיקה מהירה, חסכונית ופשוטה המבוססת על תאים צבעוניים כדי לזהות אלמנטים מנטרלים מול AAV6.

שיטה שלב אחר שלב לזיהוי נוגדנים מנטרלים נגד AAV באמצעות בדיקה מבוססת תאים צבעוניים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ותיקוף של שיטות מעבדה טובות בזיהוי תואם של וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו בדמעות אנושיות על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית לתמיכה בפיתוח קליני של וקטורים של ריפוי גנטי.

בדיקת תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי טיפתי לזיהוי וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו במחקרי שפיכה ביולוגית של דמעות

כאן אנו מפרטים פרוטוקול אופטימלי להזרקת וריד זנב רוחבי של עכבר לניהול מערכתי של וירוס הקשור לאדנו (AAV) בעכברים בוגרים. בנוסף, אנו מתארים פרוטוקולים של בדיקות נפוצות להערכת התמרה AAV.

אספקה עקבית של וירוס הקשור לאדנו באמצעות הזרקת וריד זנב לרוחב בעכברים בוגרים

כימות מדויק של עותקים גנומיים וקטוריים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) הוא קריטי, אך פרוטוקול סטנדרטי טרם נקבע. פרוטוקול זה מתאר שיטה מתוקפת להכנת דגימות AAV מטוהרות וביצוע תגובת שרשרת פולימראז טיפתית דיגיטלית (dd_PCR) כדי לכמת באופן אמין את טיטר הגנום הנגיפי.

כימות גנומים נגיפיים הקשורים באדנו בדגימות וקטוריות מטוהרות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז טיפתי דיגיטלי

זריקות תת-רשתית הן טכניקה הכרחית לפיתוח פרה-קליני של טיפולים למחלות קולטני אור ו-RPE. אנו מתארים טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית אופטימלית בעכברים המשפרת את שיעורי ההצלחה תוך ניתוחיים וממזערת נזק לרשתית.

טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית זעיר פולשנית אופטימלית בעכבר

שיטה שילוב של פלסמיד דנ"א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים...

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

למד כיצד לכמת יעילות טרנסדוקציה של AAV ברשתית עכברים באמצעות שיטת PCR טיפה דיגיטלית. פרוטוקול זה מספק כלי רגיש לכימות מוחלט של DNA מטרה בחקר תרפיית גנים.

שיטת PCR טיפה דיגיטלית לכימות יעילות טרנסדוקציה AAV ב- מורין רשתית

גלה סרטונים נוספים